一种急性心肌梗死治疗药物

文献发布时间：2023-06-19 11:09:54

技术领域

本发明属于心血管疾病药物技术领域，尤其涉及一种急性心肌梗死治疗药物。

背景技术

急性心肌梗死是全世界发病率和死亡率最高的一种心血管疾病，其是由于急性持续性冠状动脉缺血缺氧引起的心肌坏死，最终导致心肌重构及难以逆转的新功能下降。目前，临床上对于心肌梗死患者的主要治疗方式是药物治疗，介入治疗，溶栓治疗和手术治疗。尽管这些方式有效的提高了心肌梗死患者的生存率，但是这些治疗方式无法有效的解决心肌修复的问题。

非编码RNA是全基因组中的一类不编码蛋白质的RNA，这些RNA分子中缺乏开放阅读框。随着高通量技术的迅速发展，人们逐渐发现了多种ncRNAs，而且随着对ncRNAs研究的不断深入，越来越多的研究人员发现，ncRNAs在生物进程中发挥着重要的作用。ncRNAs不仅能够作用于机体的正常生长发育，而且与多种疾病的发生发展存在密切的关系。目前，关于ncRNAs在急性心肌梗死治疗中的相关机制尚未清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种急性心肌梗死治疗药物，为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

第一方面，本发明提供了LC101928034在急性心肌梗死治疗中的应用，所述LOC101928034的RNA核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了促进LOC101928034表达的试剂在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。

优选地，所述试剂为LOC101928034过表达质粒。

第三方面，本发明提供了一种治疗急性心肌梗死的药物，所述药物中含有LOC101928034过表达质粒。

第四方面，本发明提供了促进LOC101928034表达的试剂在制备心肌细胞增殖促进剂中的应用。

优选地，所述试剂为LOC101928034过表达质粒。

第五方面，本发明提供了一种心肌细胞增殖促进剂，所述促进剂中含有LOC101928034过表达质粒。

第六方面，本发明提供了促进LOC101928034表达的试剂在制备血管内皮细胞血管生成促进剂中的应用。

优选地，所述试剂为LOC101928034过表达质粒。

最后，本发明提供了一种血管内皮细胞血管生成促进剂，所述促进剂中含有LOC101928034过表达质粒。

本发明的有益效果是：

本发明首次证明了非编码RNA LOC101928034过表达能够有效的促进心肌细胞增殖并能够促进血管内皮细胞的血管生成，因此可将LOC101928034过表达试剂用于制备心肌细胞增殖促进剂和血管内皮细胞血管生成促进剂，进而可将其用于制备治疗急性心肌梗死的药物，为急性心肌梗死的治疗提供一种新的药物。

附图说明

图1 pcDNA3.1-LOC101928034过表达检测结果；

图2 过表达LOC101928034对于心肌细胞增殖的影响；

图3 过表达LOC101928034对于内皮细胞血管生成的影响；

图4 过表达LOC101928034对于血管内皮生成因子表达的影响。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

设计和验证LOC101928034过表达质粒

（1）根据LOC101928034 的RNA核酸序列NR_125947.1，SEQ ID NO.1以及pcDNA3.1的EcoR I和Xho I酶切位点设计引物构建pcDNA3.1- LOC101928034过表达质粒，引物序列如下所示；

上游引物：GAATTCACACAACTCACCAAACCA,SEQ ID NO.2

下游引物：CTCGAGCCGCACAAACCTATGAGG,SEQ ID NO.3

（2）将人心肌细胞AC16接种于6孔板中，待细胞密度达到80%时，使用lip2000脂质体对细胞进行转染，对照组转染pcDNA3.1，实验组转染pcDNA3.1- LOC101928034，每组设置3个重复；

（3）转染48h后，弃去培养基，每孔使用2ml PBS清洗2次，弃去PBS后，加入1mlTrizol处理10min；

（4）吹打后，将Trizol转移至新的无RNA酶EP管中，加入250ul氯仿，室温静置5min后，置于离心机中，4度，12500rpm离心15min；

（5）将400ul上清转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇混匀，室温静置10min后，置于离心机中，4度，12500rpm离心15min；

（6）弃上清，在EP管中加入1ml 75%乙醇，悬浮沉淀，置于离心机中，4度，7500rpm离心10min；

（7）弃去上清，超净工作台中干燥10min，根据白色沉淀大小加入20-40ul DEPC水，检测RNA的浓度和纯度；

以1组样本为例，RNA的质量结果为

符合RNA提取要求，可以进行后续的实验；

（8）去除基因组DNA

配置如下的反应体系：

5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，

gDNA Eraser 1.0μl，

Total RNA 1.0μg，

RNase Free dH2O up to 10.0μl；

设定PCR仪参数为42℃ 2分钟，4℃；

（9）进行逆转录反应

配置如下的反应体系：

步骤（8）的反应液 10.0μl，

PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，

RT Primer Mix 1.0 μl，

5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，

RNase Free dH2O 4.0 μl；

设定PCR仪参数为37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃；

（10）设计LOC101928034引物并进行荧光定量PCR反应

LOC101928034的引物序列如下：

正向引物：GAGAGCGGATACTGCCTTCC,SEQ ID NO.4

反向引物：GAGCCACACCCTTGTTCTGT,SEQ ID NO.5

GAPDH的引物序列如下：

正向引物：GATTTGGTCGTATTGGGCGC,SEQ ID NO.6

反向引物：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA,SEQ ID NO.7

配置如下的反应体系:

SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10.0μl，

LOC101928034正向引物： 0.4μl，

LOC101928034反向引物： 0.4μl，

cDNA模板 2.0μl，

ddH2O 7.2μl；

设定PCR仪参数为95℃预变性3min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，每个样品设置3个复孔；

采用2

实验结果如图1所示，其中，转染pcDNA3.1-LOC101928034的细胞中，LOC101928034的相对表达量为4.581±0.061，可以看出，pcDNA3.1-LOC101928034能够有效的促进LOC101928034的表达。

实施例2

过表达LOC101928034促进心肌细胞的增殖

（1）将转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-LOC101928034的人心肌细胞AC16制备成细胞悬液，并调整细胞密度为50000/ml；

（2）将100ul细胞悬液接种于96孔板中，每组设置5个复孔，置于细胞培养箱中，培养48h；

（3）培养结束后，使用MTT检测570nm吸光值。

实验结果如图2所示，其中，pcDNA3.1组的吸光值为0.409±0.036，pcDNA3.1-LOC101928034组的吸光值为0.590±0.033，从上述结果可以看出，过表达LOC101928034能够有效的促进心肌细胞的增殖。

实施例3

过表达LOC101928034促进血管内皮细胞的血管形成

（1）将Matrigel基质胶从-20℃冰箱中取出放入到4℃冰箱中过夜融化，第二天在预冷的96孔板中加入40ulMatrigel基质胶，轻轻的震荡平铺；

（2）将转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-LOC101928034的血管内皮细胞HUVEC制备成细胞悬液，每孔加入2×10

（3）将96孔板置于37℃细胞培养箱中，培养4h后进行拍照并计算总分支长度。

实验结果如图3所示，从图中可以看出，过表达LOC101928034能够有效的促进血管内皮细胞的血管形成（相对倍数为1.399±0.144）。

实施例4

过表达LOC101928034促进血管内皮生成因子表达

（1）将人血管内皮细胞HUVEC接种于6孔板中，待细胞密度达到80%时，按照lip2000脂质体转染说明书对细胞进行转染，对照组转染pcDNA3.1，实验组转染pcDNA3.1-LOC101928034，每组设置3个重复；

（2）转染48h后，去除培养基，PBS清洗后，加入100ul蛋白裂解液，收集细胞至EP管中，冰上裂解30min；

（3）将细胞裂解液在12000g转速下离心12min，转移上清至新的EP管中，测定蛋白浓度调整上样量为20ug；

（4）配置分离胶和浓缩胶，将蛋白样品加入到点样孔中，按照浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V进行电泳，至溴酚蓝跑出；

（5）按照三明治模型安装电转夹，300mA恒流电转1.5h；

（6）电转结束后，将将膜取出，置于5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；

（7）孵育VEGF和GAPDH一抗，4℃封闭过夜；

（8）洗膜后，孵育二抗，室温孵育1h；

（9）洗膜后，进行显影拍照。

实验结果如图4所示，可以看出，过表达LOC101928034能够有效的促进VEGF的蛋白表达（相对倍数为1.818±0.174），该结果说明过表达LOC101928034通过促进VEGF来促进血管内皮细胞血管生成。

序列表

<110> 青岛市中心医院

<120> 一种急性心肌梗死治疗药物

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

acacaactca ccaaaccaag aaagaagaag cgctgaggag agagggttgt agagagggga 60

agaatgggga cggcccagag gtctgaccta tttatacccc agccaggccc tgcccatagc 120

aggggacagg ggagagcgga tactgccttc ctgctgtggg ctgatgcgcg ccctgcgtat 180

tcctggaagg tgcacacgat ggcagctacc gcctgctcca gaggcctggc catcctcact 240

gtcacagaac aagggtgtgg ctcacagcag agttccaggc cagcccccca gctcacctct 300

gccctctgtg tttctcagag actgttccca gacccatctt aacctccatc aggcttcagg 360

ccccgcagtc tccccctcct ctgagtagcc ctcccagacc acaccagccc ctcctaattt 420

atccccctgc tgtcctgttg ttatttcccc atgtagaggt ctcattgccc caacatcgct 480

gtaaactcct cagagagaca gcatcctacc ccaccaccca cacaccccac cgtggggctc 540

cttaagcact ctcagattat ctgccacctc ttcttatccc caacacccag ggatggctcg 600

gtcccagtct gccccagccc atgagatgcc ctagaagcct ccctccctgc aggaacttgc 660

acaaggagag cctggccctg tgcttctctg ccctcagccc ttggagaagc taggccttag 720

cagggagggg caggtctgag aggcgccccc acagcctcac caccactgcc ctcaccctgc 780

ctcctgccct gaactcgagg aagctgcacc cagaagaaaa acttgtggga tcctctctgc 840

ctgtcgccag ctgtgcaacc ttggaagaga acccaaaacc tagaagagcg tgagagggaa 900

aagaggaagg agattgactc ccaggccggc aaagaagcct tcctgcccgt gcaggcagcc 960

agagcgccag tgacaccttc gacctcgccc tcggccccca gcacccaagc cttgcctgtg 1020

ccgtcctctc cttggagact cagccctgtt gaggagggga gtgagcaata gaggagggaa 1080

ggaaaagagg agctgtgatt agccctgttt tataatgggc tacatagccc tgttttatat 1140

gggcttttta atggaagtat ggggagcagg gggcagagaa caagagacag tcacgcagca 1200

gaaggggggg ccagagtgca ccagcaatta attcagctct aggtcgagct taattattcc 1260

cacctatgat atcccagctc tgcccccagc cacctccctt aagcagccta cctctgctct 1320

cggggcttca ttttactcac ctgtcagtga tggagggtga taatagtaac tacctcatag 1380

gtttgtgcgg 1390

<210> 2

<211> 24

<212> DNA