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具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒

文献发布时间：2023-06-19 12:07:15

技术领域

本发明涉及作为新型流感的发病原因的H7亚型禽流感病毒感染的预防药和治疗药。具体而言，涉及能够表达H7亚型禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白质基因的重组牛痘病毒DIs株，以及，包含所述重组牛痘病毒DIs株的新型流感用的预防药和治疗药。

背景技术

有报告称季节性流感在每年冬季流行，罹患者达到人口的10％至20％。其病原体为A/H1N1、A/H3N2或B型流感病毒，由于每年其抗原性都会少许变化，因此需要配合其流行预测株进行疫苗的制造。另一方面，作为新型流感，可以举出H5N1高致病性禽流感或H7N9禽流感、H7N7高致病性禽流感等。特别是，H7N9禽流感病毒的对人类的感染流行于2013年之后在中国被报道，至今至少有1564名的感染例和612名的死亡例被报道。另外，2016-2017年流行季，与过去4季相比感染规模最大，担心今后会有进一步的流行扩大。现在，为应对新型流感病毒的对人类的感染流行的扩大，美国、英国为首的多个国家正在进行疫苗制造用的候补株的筛选和保管，建立起了在流行爆发时能够立刻开始疫苗制造的体制。

但是，预定制造的疫苗是全粒子灭活疫苗，因此，需要多次疫苗接种，因此，充分的免疫诱导需要时间。进一步而言，有报道称H7N9禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白质序列包含诱发抑制性T细胞(Treg)的活化的序列(非专利文献1)，存在减弱H7HA蛋白质特异性抗体的诱导能力的可能性。从H1N1(2009)流行流感病毒的世界性大流行时随时间推移的变化，即在源发国的流行2-3月后，各国国内开始第一波感染流行来看，对于H7亚型流感病毒也需要进行能够在更早的阶段进行应对的疫苗的开发。

现在，作为流感治疗药，虽然有抑制对流感病毒的出芽而言非常重要的神经氨酸酶(NA)的作用的Tamiflu和Relenza，但在发病后48小时以内的给药非常重要等，其效果有一定的限制性。另外，NA抑制剂的静注剂也已经被开发。另外，作为流感病毒的聚合酶抑制剂的Avigan，虽然在2014年3月于日本国内获得了制造销售的许可，但只是应厚生劳动大臣的要求而进行制造和供给，是附带不能对一般民众销售等的条件的附条件许可。

各种疫苗中，活疫苗是最有效的一种。但是，已知一般而言，新兴病毒的弱毒性疫苗的开发需要非常长的时间，可以认为这对H7亚型流感而言也是一样的。因此，作为本发明者们锐意研究的结果，使用基因工程的手法，以作为流感活疫苗的牛痘病毒为母体，开发了表达H7亚型HA蛋白质基因的重组牛痘病毒(RVV)。至今为止，本发明者们开发的狂犬病病毒用或牛瘟(rinder pest)用的重组牛痘病毒(RVV)，在野外试验等中，已经证实了其能够发挥优秀的感染发病预防效果(非专利文献2)。另外，对于重症急性呼吸器症候群(SARS)，也成功制备了具有周知为其病原体的SARS-CoV的cDNA的重组牛痘病毒(专利文献1)，并确认了其优秀的预防效果和其是能够进行再给药的制剂(非专利文献3)。进一步，对于H5N1HPAIV，也成功制备了具有H5N1 HPAIV的HA的cDNA的重组牛痘病毒，确认了其是显示优秀的预防效果的制剂(专利文献2和非专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/038742号

专利文献2：日本专利第5884100号

非专利文献

非专利文献1：Liu R,et al.,H7N9 T-cell epitopes that mimic humansequences are less immunogenic and may induce Treg-mediated tolerance.HumVaccin Immunother.2015；11(9):p.2241-52

非专利文献2：Tsukiyama K.et al.,Development of heat-stable recombinant rinderpest vaccine.Arch.Virol.,1989,vol.107,p.225-235

非专利文献3：Kitabatake M.et al.,SARS-CoV spike protein-expressingrecombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies in rabbits pre-immunized with vaccinia virus.Vaccine,2007,vol.25,p.630-637

非专利文献4：Yasui F.et al.,Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restore immune potential against H5N1 influenzavirus.Sci.Rep.,2016,vol.6,p.37915

发明内容

本发明所要解决的技术问题

从这样的现状出发，对于含有能够有效防止H7亚型禽流感病毒感染引起的发病的重组牛痘病毒(RVV)的治疗药和预防药的开发十分迫切。

解决技术问题的技术手段

本发明的一实施方式如下。

<1>、一种重组牛痘病毒，其在牛痘病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码H7亚型禽流感病毒来源的血凝素蛋白的cDNA的全部或一部分。

<2>、<1>所述的重组牛痘病毒，其中，

H7亚型禽流感病毒为H7N9禽流感病毒或H7N7高致病性禽流感病毒。

<3>、<1>或<2>所述的重组牛痘病毒，其中，编码血凝素蛋白的cDNA为以下的(a)～(h)的DNA：

(a)包含序列编号1所示的碱基序列的DNA

(b)和包含与序列编号1所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并且，编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA

(c)包含在序列编号1所示的碱基序列中缺失、置换或添加了1个或数个碱基的碱基序列，并且，编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA

(d)与序列编号1所示的碱基序列具有75％以上的序列一致性，并且编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA

(e)包含序列编号2所示的碱基序列的DNA

(f)和包含与序列编号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，且编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA

(g)包含在序列编号2所示的碱基序列中缺失、置换或添加了1个或数个碱基的碱基序列，并且，编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA

(h)与序列编号2所示的碱基序列具有75％以上的序列一致性，并且编码属于H7N9的病毒株来源的血凝素蛋白的DNA。

<4>、一种药物组合物，其包含：

<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒。

<5>、<4>所述的药物组合物，其为H7亚型禽流感的预防药。

<6>、<4>所述的药物组合物，其为H7亚型禽流感的治疗药。

<7>、<5>或<6>所述的药物组合物，其中，

H7亚型禽流感为H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。

<8>、<4>～<7>中任一项所述的药物组合物，其用于皮内给药。

<9>、一种皮内给药用制剂，其包含：

<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒。

<10>、<9>所述的皮内给药用制剂，其为H7亚型禽流感的预防药。

<11>、<9>所述的皮内给药用制剂，其为H7亚型禽流感的治疗药。

<12>、<10>或<11>所述的皮内给药用制剂，其中，

H7亚型禽流感为H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。

<13>、一种流感疫苗，其包含：

<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒。

<14>、<13>所述的流感疫苗，其中，

所述流感为H7亚型禽流感。

<15>、<14>所述的流感疫苗，其中，所述H7亚型禽流感为H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。

<16>、<13>～<15>中任一项所述的流感疫苗，其用于皮内给药。

<17>、预防和/或治疗H7亚型禽流感的方法，其包含：

将有效量的<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒向对象给药的步骤。

<18>、<17>所述的方法，其中，所述H7亚型禽流感为H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。

<19>、<17>或<18>所述的方法，其中，

所述给药为皮内给药。

<20>、<17>～<19>中任一项所述的方法，其包含：

和针对其他亚型流感病毒的疫苗组合给药的步骤。

<21>、一种混合疫苗，其包含：

<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒和1种或2种以上的其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒。

<22>、<21>所述的混合疫苗，其中，

其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒为rDIs-H1、rDIs H3和rDIs-H5。

<23>、在流感疫苗的制造中对<1>～<3>中任一项所述的重组牛痘病毒的使用。

发明的效果

本发明能够提供对新型流感的预防或治疗有效，并且安全性高的新型重组牛痘病毒，和包含它的新型流感用预防药或治疗药。

附图说明

[图1]图1是表示使用同源重组技术的、具有H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质基因的DIs株来源的重组牛痘病毒(RVV)(具体而言rDIs-H7 HA)的制备的图。

[图2]图2是表示通过免疫印迹法对RVV(rDIs-H7 HA)的HA蛋白质的表达进行确认的结果的PVDF膜的照片。

[图3]图3是表示对于H7N9禽流感病毒向BALB/c小鼠的攻击感染，具有H7N9禽流感病毒来源的HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV(H7亚型禽流感病毒用疫苗：rDIs-H7 HA)的单次接种所带来的免疫诱导效果和感染防御能力的增强效果的探讨结果的图。

[图4]图4是表示对于H7N9禽流感病毒向食蟹猴的攻击感染，具有H7N9禽流感病毒来源的HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV(H7亚型HA基因表达疫苗：rDIs-H7 HA)的使用皮肤擦过法进行的接种所带来的免疫诱导效果和感染防御能力的增强效果，以及即时性效果的探讨结果的图。

[图5]图5是表示在接种了H7亚型HA基因表达疫苗(rDIs-H7 HA)的食蟹猴中，H7N9禽流感病毒的攻击感染7天后的病毒去除效果的探讨结果的图。

[图6]图6是表示在接种了H7亚型HA基因表达疫苗(rDIs-H7 HA)的食蟹猴在H7N9禽流感病毒的攻击感染7天后的肺病理外观和肺重量的图。

[图7]图7是表示对于H7N7高致病性禽流感病毒向BALB/c小鼠的攻击感染，具有H7N9来源的HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV(H7亚型HA基因表达疫苗：rDIs-H7 HA)的单次接种所带来的感染防御效果的探讨结果的图。

[图8]图8是表示对于H7N9禽流感病毒向BALB/c小鼠的攻击感染，具有H7N9来源的HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV(H7亚型HA基因表达疫苗：rDIs-H7 HA)的即时性效果的探讨结果的图。

[图9]图9是表示对于H7N9禽流感病毒向食蟹猴的攻击感染，具有H7N9禽流感病毒来源的HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV(H7亚型HA基因表达疫苗：rDIs-H7 HA)的单价疫苗的使用皮内接种法和皮肤擦过法的接种、以及包含针对流感H7型流感以及H1、H3、H5亚型病毒的疫苗的四种混合疫苗(rDIs-H1、-H3、-H5-H7 HAs)的皮内接种所带来的免疫诱导效果和感染防御能力的增强效果的探讨结果的图。

[图10]图10是表示食蟹猴在H7亚型HA基因表达疫苗(rDIs-H7 HA)的单价疫苗的使用皮内接种法或皮肤擦过法的接种、包含针对流感H7型流感以及H1、H3、H5亚型病毒的疫苗的四种混合疫苗(rDIs-H1、-H3、-H5-H7HAs)的皮内接种或H7N9禽流感病毒的攻击感染7天后的肺病理外观和肺组织中病毒感染滴度的图。

本发明的具体实施方式

以下，将对本发明中的重组牛痘病毒和其用途进行详细说明，但本发明的范围不限于这些说明，除了以下的示例之外，在不违反本发明的主旨的范围内可以进行适宜变更而实施。需要说明的是，本说明书中引用的专利文献、非专利文献等其他刊物，作为参照而被纳入本说明书。

1.本发明的概要

在上述的背景下，本发明者们，鉴于要对不特定数目的受试者接种，使用了在哺乳动物细胞内中为非增殖性，故而安全性更高的，且具有人类的接种实绩的牛痘病毒DIs株，进而开发了具有H7亚型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒(RVV)。

众所周知，制备重组牛痘病毒(RVV)以作为活疫苗，这样的基因工程的手法是在如此情况下可采取的手法之一。作为在RVV的制备中使用的、作为重组母体的牛痘病毒，需要安全性经过确认的疫苗株，作为这样的疫苗株，可以举出牛痘病毒DIs株或LC16m8株。牛痘病毒DIs株是通过将牛痘病毒大连株(DEI株)在鸡蛋胚中传代培养进而分离而得的高度弱毒化的牛痘病毒株(Tagaya I et al.,A new mutant of dermovaccinia virus.Nature,1961,vol.192,p.1187-1188)。该DIs株虽然可以在鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖，但在其他哺乳动物细胞中不增殖，安全性更高。另一方面，牛痘病毒LC16m8株作为天然痘疫苗在1975年被当时的厚生省所认可，是具有对5万人以上婴幼儿接种的实绩的、安全且有效的弱毒疫苗株。LC16m8株的弱毒性，是源自被认为与对细胞的吸附·感染相关的LC16mO株的B5R蛋白质基因缺失了一碱基，而无法表达全长的B5R蛋白质(Morikawa S.,et al.An attenuatedLC16m8 smallpox vaccine:analysis of full-genome sequence and induction ofimmune protection.J.Virol.,2005,vol.79(18),p.11873-1189)。使用这样的安全性得到了确认的疫苗株，就能够进行可以对有免疫缺陷·免疫抑制的对象使用的，还具有不造成接种疤等的优点的重组流感活疫苗的开发。因此，本发明者们以创建将该DIs株作为母体而使用的重组新型流感疫苗，并确立对于紧急的新型流感的流行，通过使用单次接种并且在短时间内也能显示出有效性的新型疫苗而进行的预防和治疗法为目标。

在本发明中，如下文所详述的，在rDIs-H7 HA接种个体中，对于H7N9禽流感病毒感染和H7N7禽流感病毒感染，显示出了良好的发病防御效果。进一步而言，即使在疫苗接种1周后或2周后用H7N9禽流感病毒进行感染的情况下，也能够显著减轻症状，即时效果得到了确认。从以上的结果来看，rDIs-H7 HA可以作为能够即时地引发免疫诱导的H7亚型流感用疫苗。

本发明者，如上所述，建立了将DIs株作为母体使用的重组新型流感疫苗(rDIs-H7HA)。rDIs-H7 HA单次接种小鼠虽然在A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒的攻击感染后表现出了暂时的体重减少，但其后体重迅速回复，表现出了100％的生存率(图3)。在食蟹猴的发病防御试验中，在rDIs-H7 HA接种2次的组中，与疫苗非接种组(DIs接种组)相比，显示了快速的退烧效果(图4)、各处(结膜、鼻腔、口腔、气管)拭子中病毒的早期去除效果(图5)和肺炎的显著的减轻效果(图6)。另外，在食蟹猴中，对于是否可以通过在H7N9流感病毒感染的2周前进行rDIs-H7 HA的单次接种，来作为预防疫苗应对急速的感染扩大进行了探讨的结果，rDIs-H7 HA在病毒感染的2周前这样的短时间内也发挥了显著的即时性发病预防效果(图4～图6)。这样的即时性发病预防效果在小鼠中也得到了确认(图8)。进一步而言，rDIs-H7 HA接种小鼠在A/chick en/Netherlands/2586/2003(H7N7)流感病毒的攻击感染后，也显示了体重减少抑制效果和100％的生存率(图7)。如上所述，表达流感病毒HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV，作为H7亚型流感病毒用疫苗(rDIs-H7 HA)，通过1×10

2.具有新型流感病毒的HA蛋白质基因的重组牛痘病毒的制备

H5N1 HPAIV用疫苗的制备方法是既知的(日本专利第5884100号)，本发明的H7亚型流感病毒用疫苗(rDIs-H7 HA)也可以基于该既知方法进行制备。制备方法的概要如下。

H7亚型禽流感病毒，例如序列编号1的H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因已经在流感病毒基因数据库(GISAID；Global Initiative on Sharing All Influenza Data)中，以特定的登录号(Accession No.EPI439507)进行了登录。

这些HA蛋白质基因(包含一部分变异的基因)，已经被克隆并插入了质粒。因此，包含于本发明的重组牛痘病毒中的基因，即编码H7N9禽流感病毒的H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质的cDNA的全部(包含变异序列)或其一部分，可以通过通常的基因工程的手法获得。例如，可以利用作为基因工程的手法而通常被使用的、使用了DNA合成装置的核酸合成法。另外，将作为模板的基因序列提纯或合成后，设计各个基因的特异性引物，使用PCR装置扩增其基因序列的PCR法，也可以利用使用克隆载体的基因扩增法。所述方法可以参照“Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)”(Cold Spring HarborLaboratory Press(2012))等进行。得到的PCR产物的纯化可以使用既知的方法。另外，对于变异序列，特别是变异置换型的DNA，例如，可以参照所述“Molecular Cloning,ALaboratory Manual(4th edition)”(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))、“Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)”等中记载的位点特异性诱变法进行制备。具体而言，通过Kunkel法或Gapped duplex法等的既知手法，可以使用利用了位点特异性诱变法的变异导入用试剂盒进行制备，作为该试剂盒，例如，可以优选举出QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司制)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitr ogen公司制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System(Mutan-K，Mutan-Super Express Km等：Takara Bio公司制)等。

在本发明的优选的方式中，可以将插入所述质粒中的H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质基因，作为所述PCR的模板使用。在本发明的更优选的方式中，可以将H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因，作为所述PCR的模板使用。此外，可以通过以H7亚型高致病性禽流感病毒，更优选H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因的cDNA作为模板，使用各基因特异性引物进行PCR，而制备H7亚型高致病性禽流感病毒，更优选H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因区域。

所述的各变异型DNA，可以通过化学合成得到，或以包含序列编号1～序列编号2所示的碱基序列的DNA或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬菌斑杂交、Southern印迹等的既知的杂交法，从cDNA文库和基因组文库中得到。作为所述杂交中的严格条件，例如，可以举出0.1×SSC～10×SSC、0.1％～1.0％SDS和20℃～80℃的条件，更详细而言，可以举出在37℃～56℃下进行预杂交30分钟以上后，在0.1×SSC、0.1％SDS中，室温下进行10～20分钟的清洗1～3次的条件。关于杂交法的详细的步骤，可以参照“Molecular Cloning,ALaboratory Manual 4th ed.”(Cold Spring Harbor Press(2012))等。

另外，可以使用与序列编号1所示的碱基序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的一致性，并且，编码H7亚型禽流感病毒来源的HA蛋白质的DNA(变异型DNA)，与序列编号2所示的碱基序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的一致性，并且，编码H7N9禽流感病毒来源的HA蛋白质的DNA(变异型DNA)。

包含于本发明的重组牛痘病毒中的表达启动子，只要是插入牛痘病毒DIs株的基因缺失区域的启动子即可，无特别限定，例如，可举出牛痘病毒启动子mH5等。另外，作为该表达启动子，也可以使用例如，痘病毒A型包涵体(ATI)启动子和多个重复的牛痘病毒7.5kDa蛋白质(p7.5)前期表达启动子所构成的杂合启动子。该启动子可以与适当的质粒连接，例如已知的pBMSF7C或pUC/DIs(参照Arch.Virol.vol.138,p.315-330,1994；日本特开平6-237773号公报)。

本发明中可以使用的牛痘病毒启动子mH5的碱基序列如序列编号3所示。但是，在本发明中，除了包含序列编号3所示的碱基序列的DNA之外，和包含与序列编号3所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交并且具有启动子活性的DNA也可以作为表达启动子(特别是杂合启动子)而使用。“严格条件”如上所述。“具有启动子活性”是指，具有编码结构蛋白质或非结构蛋白质的基因的转录活性。通过所述杂合启动子而表达的蛋白质，可以在牛痘病毒的感染前期至后期，以受到完全的糖修饰的形式大量表达。

通过将插入编码所述表达启动子和HA蛋白质的DNA而得到的质粒载体，导入作为宿主的牛痘病毒中，能够制备重组牛痘病毒。向质粒载体的宿主中的导入，可以任意采用既知的手法，例如，通过向感染了弱毒牛痘病毒DIs株的动物细胞中导入得到的质粒载体，而在牛痘病毒DIs株的基因缺失区域的附近的序列上引发同源重组，可以制备分别表达H7亚型禽流感病毒(例如H7N9禽流感病毒或H7N7高致病性禽流感病毒)的HA蛋白质基因的重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)。

灭活疫苗的制造法是既知的。如同所述，将疫苗制造用的流感病毒接种到发育鸡胚中进行增殖，将从尿囊液中纯化·浓缩的病毒用乙醚进行部分分解，进一步用福尔马林灭活。

制备而得的DIs株来源的重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)，在牛痘病毒DIs株的基因缺失区域中插入了H7亚型禽流感病毒(例如H7N9禽流感病毒)的HA蛋白质基因。虽然流感病毒来源的HA蛋白质对豚鼠红血球表现出凝聚反应，但是牛痘病毒来源的HA蛋白质对豚鼠红血球不发生凝聚反应。因此，用rDIs-H7 HA感染动物细胞，以豚鼠红血球对由此形成的斑块的凝聚反应为指标，进行RVV的筛选。目标RVV通过具有红血球凝聚活性的红色斑块筛选即可。

通过红色斑块得到的病毒，可以通过以病毒基因组为模板，使用H7N9禽流感病毒等的H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质基因特异性引物进行PCR，来确认其H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质基因的导入。

H7N9禽流感病毒等的H7亚型禽流感病毒的HA蛋白质的表达，可以通过将感染rDIs-H7 HA后的动物细胞作为样品，使用免疫印迹法进行确认。需要说明的是，抗体可以使用免疫H7N9禽流感病毒的HA蛋白质来源的HA肽(序列编号4等)而制备的兔抗血清。

在RVV的制备中，作为靶基因的插入位点，作为牛痘病毒DIs株的基因缺失区域一般使用胸苷激酶(TK)基因区域，但是众所周知在TK基因区域中插入靶基因而导致TK的表达缺失会引起RVV的增殖性的降低。因此，在本发明中，作为靶基因的插入位点，优选牛痘病毒DIs株的基因缺失区域。

3.新型流感的预防用和治疗用药物组合物以及其使用

本发明提供包含DIs株来源的所述重组牛痘病毒的新型流感(即H7N9禽流感和H7N7高致病性禽流感)的预防药和治疗药(预防用和治疗用药物组合物)。另外本发明也提供包含将所述重组牛痘病毒对患者(受试者)进行给药的步骤的所述新型流感的预防和治疗方法、在所述新型流感的预防和治疗中的所述重组牛痘病毒的使用、在所述新型流感的预防药和治疗药的制造中的所述重组牛痘病毒的使用等。

本发明的药物组合物，可以通过既知的方法，例如，肌肉、腹腔内、皮内或皮下等的注射；或从鼻腔、口腔或肺的吸入；口服给药导入活体。进一步而言，包含于本发明的药物组合物中重组牛痘病毒，可以与既存的抗病毒药(例如，Tamiflu，Relenza)并用。并用的方式并无特别限定，本发明的重组牛痘病毒可以和既存的抗病毒药同时给药，另外，也可以通过在给药一方后，经过一定时间再给药另一方的方法导入活体。

本发明的药物组合物可以与赋形剂、增量剂、结合剂、润滑剂等既知的药学上容许的载体，缓冲剂、等张化剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甘味剂等混合。

本发明的药物组合物可以根据锭剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等的口服给药剂；注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂等的非口服给药剂等的方式，进行口服给药或非口服给药。优选的方式例如有向皮内、肌肉、腹腔等的局部注射等。在本发明的优选的实施方式中，所述的药物组合物可以是皮内给药用。

在本发明的一实施方式中，本发明的药物组合物可以包含本发明的重组牛痘病毒，作为皮内给药用制剂而提供。在本发明的一实施方式中，所述的皮内给药用制剂可以是H7亚型禽流感的预防药。在本发明的一实施方式中，所述的皮内给药用制剂可以是H7亚型禽流感的治疗药。在这样的实施方式中，H7亚型禽流感可以是H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。

在本发明的其他实施方式中，提供包含将本发明的重组牛痘病毒以有效量向对象进行给药的步骤的、预防和/或治疗H7亚型禽流感的方法。在这样的实施方式中，H7亚型禽流感可以是H7N9禽流感或H7N7高致病性禽流感。在本发明的优选的实施方式中，本发明的重组牛痘病毒的给药可以通过皮内给药实施。

给药量可以根据有效成分的种类、给药路径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状或其他条件适当选择，但是作为病毒的一天的给药量，口服的情况下为1,000～1,000,000,000PFU(噬斑形成单位，Plaque Forming Unit s)左右，优选100,000～100,000,000PFU左右，非口服的情况下为100～1,000,000,000PFU左右，优选1,000～100,000,000PFU左右。病毒可以1天进行1次给药，也可以分成数次进行给药。

本发明的重组牛痘病毒，作为新型流感预防用和治疗用疫苗而使用。另外，至今为止，在针对H7亚型禽流感病毒的疫苗的开发中，主要是进行着眼于针对H7N9禽流感病毒或H7N7高致病性禽流感病毒的抗体和细胞毒性T细胞(CTL)的研究。因此，优选预先测定作为疫苗的抗体滴度或细胞性免疫活性。在本发明的优选的实施方式中，所述的流感预防用和治疗用疫苗可以是皮内给药用的疫苗。

例如，对于制备的重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)或作为亲本株的DIs株的抗体滴度，可以通过将这些病毒株接种到小鼠中后，随时间分别回收血清，并测定血清的对于H7N9禽流感病毒或H7N7高致病性禽流感病毒的HA蛋白质的ELISA滴度而得到。

如上所述，本发明者们制备的重组牛痘病毒，能够诱导针对新型流感的体液免疫。

本发明的重组牛痘病毒可以在本发明的流感疫苗的制造中使用。

4.混合疫苗和其使用

在本发明的一实施方式中，包含本发明的重组牛痘病毒的疫苗，可以和针对其他亚型流感病毒的疫苗组合给药。在本发明的一实施方式中，所述的组合给药例如可以是使用包含本发明的重组牛痘病毒和其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒的混合疫苗进行给药。

在本发明的一实施方式中，提供包含本发明的重组牛痘病毒和1种或2种以上的其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒的混合疫苗。在本发明的一实施方式中，可以包含于本发明的混合疫苗中的其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒，可以是1种，也可以是2种以上。在本发明的一实施方式中，本发明的混合疫苗可以是二种混合疫苗。在本发明的别的实施方式中，本发明的混合疫苗可以是三种混合疫苗。在本发明的另外的实施方式中，本发明的混合疫苗可以是四种混合疫苗。在本发明的一实施方式中，其他亚型流感病毒来源的重组牛痘病毒可以是例如rDIs-H1、rDIs H3和rDIs-H5，但不限于这些。在本发明的优选的实施方式中，本发明的混合疫苗可以是四种混合疫苗(rDIs-H1、-H3、-H5-H7 HAs)。本发明的混合疫苗可以使用该技术领域中周知的方法制备。

以下，将举出实施例对本发明进行更具体的说明。这些的实施例只是用于说明，并非限定本发明的范围。

实施例

[实施例1]

<方法>

在牛痘病毒启动子mH5序列的下游连接人工合成的作为H7N9流感病毒(A/Anhui/1/2013)的抗原的血凝素蛋白(HA)基因，并插入同源重组用质粒载体，以制备RVV(图1)。此时，在插入H7N9亚型HA序列的情况下，作为限制酶位点，使用了SphI和AsiSI位点。通过向预先感染DIs株的CEF中，使用制备的同源重组用质粒载体(使用限制酶切断一处，进行了线状化)进行基因导入，而在DIs株的基因缺失位点的相邻区域引起同源重组，制备了向牛痘病毒的基因组中插入了mH5启动子和流感病毒HA蛋白质基因的重组牛痘病毒(RVV)，具体而言，是制备了rDIs-H7 HA的RVV。流感病毒来源的HA蛋白质对于豚鼠红血球表现出凝聚反应，但是牛痘病毒来源的HA蛋白质对于豚鼠红血球不发生凝聚反应。因此，使所述重组病毒感染CEF，以豚鼠红血球对由此形成的斑块的凝聚反应为指标，进行了RVV的筛选。目标重组病毒是从中选出的具有红血球凝聚活性并且形成红色斑块的病毒。

将使用序列1制备的DIs株来源的重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)，以病毒感染滴度(multiplicity of infection)10感染CEF。感染24小时后，除去培养基，以PBS(-)清洗2次。加入增溶液，制备了细胞增溶液。将细胞增溶液中含有的蛋白质量以10μg的质量进行SDS-聚丙烯酰胺电气泳动，转印到PVDF膜上。就对RVV的感染引起的流感病毒蛋白质表达的确认而言，对于H7N9禽流感病毒，一次抗体使用了小鼠抗H7N9-HA蛋白质单克隆抗体，二次抗体使用了羊抗小鼠IgG抗体-HRP。并使用了Millipore公司制发色试剂(Millipore；Immobilonwestern)。

将重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)以1×10

使用分叉针，将重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)以1×10

对于所述使用了食蟹猴的疫苗非接种组(DIs接种组)、重组牛痘病毒(rDIs-H7HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)，从攻击感染前开始，随时间进行体温测定，进一步，在攻击感染7天后进行了的肺重量的测定。

另外，将采集到的肺组织浸泡在10％缓冲福尔马林溶液中，进行病毒灭活和组织固定后，制备了组织的石蜡块。制备4μm的薄切片，贴附在载玻片上后，进行苏木精和伊红染色，对肺病理外观进行了解析。

<结果>

制备的RVV(rDIs-H7 HA)单次接种小鼠，虽然在H7N9流感病毒的攻击感染后表现出了暂时的体重减少，但之后迅速回复，表现出了100％的生存率(图3)。另一方面，疫苗非接种组(DIs接种组)表现出了急剧的体重减少，全体死亡(图3)。另外，对于H7N7高致病性禽流感病毒的感染，也表现出了体重减少抑制效果和100％的生存率，确认了本发明的疫苗不仅对H7N9禽流感，对H7N7高致病性禽流感也是有效的(图7)。进一步而言，在H7N9禽流感病毒的攻击感染的1周前或2周前进行了疫苗的单次接种的组也表现出了体重减少抑制效果，生存率在1周前的接种中为80％，在2周前的接种中为100％，这样的显著的发病防御效果得到了确认，表现出了其可作为预防疫苗，而应对急速的感染扩大(图8)。

在对于使用了食蟹猴的H7N9禽流感病毒感染的、重组牛痘病毒(rDIs-H7HA)的发病防御试验中，疫苗非接种组(DIs接种组)显示了双相热模式，而接种2次重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)的组获得了快速的退烧效果(图4)。进一步，在于感染攻击的2周前，将重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)以相同的方法进行了单次接种组(rapid)，也确认到了同样的退烧效果，即时性感染预防效果得到了确认(图4)。

对于所述使用了食蟹猴的、疫苗非接种组(DIs接种组)、重组牛痘病毒(rDIs-H7HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)，调查从其结膜、鼻腔、口腔和气管中采集的拭子样品中病毒去除效果的结果，疫苗非接种组(DIs接种组)显示了双相模式，而在重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)中，早期的病毒去除效果得到了确认(图5)。

对于所述使用了食蟹猴的、疫苗非接种组(DIs接种组)、重组牛痘病毒(rDIs-H7HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)，解析了其在攻击感染7天后的肺病理外观的结果，显示了在疫苗非接种组(DIs接种组)中观察到了局部性肺炎，与之相比，在重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)中，2组的肺胞腔都保持地很好，肺炎被显著减轻(图6)。

另外，对肺重量进行了测定的结果，在疫苗非接种组(DIs接种组)中观察到了肺湿重量的增加，而在重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)2次接种组和重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)1次接种组(rapid)中，肺湿重量的增加得到了抑制(图6)。由此，使用了本发明的重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)的H7亚型流感病毒用疫苗表现出了其对于H7N9禽流感是有效的，且其可作为预防疫苗，而应对急速的感染扩大。

<考察>

表达流感病毒HA蛋白质基因的DIs株来源的RVV，通过作为H7亚型流感病毒用疫苗(rDIs-H7 HA)，以1×10

[实施例2]

使用食蟹猴，将重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)的接种方法从皮肤擦过法变更为使用二段针的皮内接种法，对于疫苗的皮内接种法所带来的对H7N9禽流感病毒感染的防御效果进行了评价。

首先，在食蟹猴的两上腕部，以单次接种的形式进行了以下任一的接种：重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)的单价疫苗的使用了皮内接种法或皮肤擦过法的接种(1×10

对于所述使用了食蟹猴的、疫苗非接种组(DIs接种组；对照组)、重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)皮肤擦过接种组、重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)皮内接种组和四种混合疫苗(rDIs-H1、-H3、-H5-H7 HAs)皮内接种组，从攻击感染前开始，随时间进行了体温测定。

如图9所示，疫苗非接种组(DIs接种组；对照组)在感染的紧接之后和后期表现出发热，而重组牛痘病毒(rDIs-H7 HA)接种组在皮内接种法或皮肤擦过接种法的任一种的接种法中，都被观察到了良好的发热抑制和退烧效果。该结果显示，作为皮肤擦过的代替法，皮内接种法具有能够使用的可能性。

另外，在四种混合疫苗(rDIs-H1、-H3、-H5-H7 HAs)皮内接种组中，也观察到了和其他疫苗接种组同等的发热抑制和退烧效果。以上的结果显示了，开发能够同时赋予针对可以感染人类的四种血清型病毒的免疫的疫苗的可能性。

进一步，进行了所述疫苗接种和非接种食蟹猴的肺组织中的病毒感染滴度测定和肺病理解析。将采集到的肺组织浸泡在10％缓冲福尔马林溶液中，进行病毒灭活和组织固定后，制备了组织的石蜡块。制备4μm的薄切片，贴附在载玻片上后进行苏木精和伊红染色，对肺病理外观进行了解析。

在疫苗非接种组中，在多个肺叶上检测到了感染性病毒，其呈现伴随肺水肿的重症肺炎。与之相对，在单价疫苗皮内接种组、皮肤擦过组、四种混合接种组的任一组中，感染性病毒滴度都在检测界限以下，且肺炎也得到了显著的减轻(图10)。

以上的结果显示了，本发明的流感病毒HA蛋白质基因表达DIs株来源的RVV是对于H7亚型流感病毒安全并且有效的疫苗。另外，本发明的流感病毒HA蛋白质基因表达DIs株来源的RVV可作为预防疫苗，而应对急速的感染扩大。

序列表Free text

序列编号1:H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因

atgaacactcaaatcctggtattcgctctgattgcgatcattccaacaaatgcagacaaaatctgcctcggacatcatgccgtgtcaaacggaaccaaagtaaacacattaactgaaagaggagtggaagtcgtcaatgcaactgaaacagtggaacgaacaaacatccccaggatctgctcaaaagggaaaaggacagttgacctcggtcaatgtggactcctggggacaatcactggaccacctcaatgtgaccaattcctagaattttcagccgatttaattattgagaggcgagaaggaagtgatgtctgttatcctgggaaattcgtgaatgaagaagctctgaggcaaattctcagagaatcaggcggaattgacaaggaagcaatgggattcacatacagtggaataagaactaatggagcaaccagtgcatgtaggagatcaggatcttcattctatgcagaaatgaaatggctcctgtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatgactaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctctaatagtatgggggatccatcattccgtatcaactgcagagcaaaccaagctatatgggagtggaaacaaactggtgacagttgggagttctaattatcaacaatcttttgtaccgagtccaggagcgagaccacaagttaatggtctatctggaagaattgactttcattggctaatgctaaatcccaatgatacagtcactttcagtttcaatggggctttcatagctccagaccgtgcaagcttcctgagaggaaaatctatgggaatccagagtggagtacaggttgatgccaattgtgaaggggactgctatcatagtggagggacaataataagtaacttgccatttcagaacatagatagcagggcagttggaaaatgtccgagatatgttaagcaaaggagtctgctgctagcaacagggatgaagaatgttcctgagattccaaagggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaaggcctaattgatggttggtatggtttcagacaccagaatgcacagggagagggaactgctgcagattacaaaagcactcaatcggcaattgatcaaataacaggaaaattaaaccggcttatagaaaaaaccaaccaacaatttgagttgatagacaatgaattcaatgaggtagagaagcaaatcggtaatgtgataaattggaccagagattctataacagaagtgtggtcatacaatgctgaactcttggtagcaatggagaaccagcatacaattgatctggctgattcagaaatggacaaactgtacgaacgagtgaaaagacagctgagagagaatgctgaagaagatggcactggttgctttgaaatatttcacaagtgtgatgatgactgtatggccagtattagaaataacacctatgatcacagcaaatacagggaagaggcaatgcaaaatagaatacagattgacccagtcaaactaagcagcggctacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttctagccattgtaatgggccttgtcttcatatgtgtaaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatataa

序列编号2:H7N9禽流感病毒的HA蛋白质基因的一碱基置换型

atggacactcaaatcctggtattcgctctgattgcgatcattccaacaaatgcagacaaaatctgcctcggacatcatgccgtgtcaaacggaaccaaagtaaacacattaactgaaagaggagtggaagtcgtcaatgcaactgaaacagtggaacgaacaaacatccccaggatctgctcaaaagggaaaaggacagttgacctcggtcaatgtggactcctggggacaatcactggaccacctcaatgtgaccaattcctagaattttcagccgatttaattattgagaggcgagaaggaagtgatgtctgttatcctgggaaattcgtgaatgaagaagctctgaggcaaattctcagagaatcaggcggaattgacaaggaagcaatgggattcacatacagtggaataagaactaatggagcaaccagtgcatgtaggagatcaggatcttcattctatgcagaaatgaaatggctcctgtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatgactaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctctaatagtatgggggatccatcattccgtatcaactgcagagcaaaccaagctatatgggagtggaaacaaactggtgacagttgggagttctaattatcaacaatcttttgtaccgagtccaggagcgagaccacaagttaatggtctatctggaagaattgactttcattggctaatgctaaatcccaatgatacagtcactttcagtttcaatggggctttcatagctccagaccgtgcaagcttcctgagaggaaaatctatgggaatccagagtggagtacaggttgatgccaattgtgaaggggactgctatcatagtggagggacaataataagtaacttgccatttcagaacatagatagcagggcagttggaaaatgtccgagatatgttaagcaaaggagtctgctgctagcaacagggatgaagaatgttcctgagattccaaagggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaaggcctaattgatggttggtatggtttcagacaccagaatgcacagggagagggaactgctgcagattacaaaagcactcaatcggcaattgatcaaataacaggaaaattaaaccggcttatagaaaaaaccaaccaacaatttgagttgatagacaatgaattcaatgaggtagagaagcaaatcggtaatgtgataaattggaccagagattctataacagaagtgtggtcatacaatgctgaactcttggtagcaatggagaaccagcatacaattgatctggctgattcagaaatggacaaactgtacgaacgagtgaaaagacagctgagagagaatgctgaagaagatggcactggttgctttgaaatatttcacaagtgtgatgatgactgtatggccagtattagaaataacacctatgatcacagcaaatacagggaagaggcaatgcaaaatagaatacagattgacccagtcaaactaagcagcggctacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttctagccattgtaatgggccttgtcttcatatgtgtaaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatataa

序列编号3：牛痘病毒启动子mH5的序列

aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60

atcataaata 70

序列编号4：H7N9禽流感病毒的HA全长氨基酸序列

MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI

序列表

<110> Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Shiga

University of Medical Science; National Institute of Infectious

Diseases

<120> 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒

<130> G2076WO

<150> JP2018-213990

<151> 2018-11-14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 1

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacatccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300

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cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaaa 1500

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taa 1683

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 流感病毒

<400> 2

atggacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60