涉及外排体的方法和组合物

本申请是申请号为201580025682.4的发明名称为“涉及外排体的方法和组合物”的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年05月15日提交的PCT国际申请PCT/US2015/031008于2016年11月18日进入中国国家阶段的申请。

相关申请

本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2014年5月18日提交、标题为“METHODS ANDCOMPOSITIONS RELATINGTO EXOSOMES”、序列号为61/994,974的美国临时申请的权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本申请的技术领域为涉及外排体的方法和组合物。

背景技术

外排体(exosome)是存在于很多并且可能所有生物流体(包括血液、尿和来自于细胞培养物的条件培养基)中的来自于细胞的囊泡。报道的外排体直径通常为30至100nm，相比之下这大于LDL但是显著小于红细胞。已知当多囊泡体(multivesicular body)与质膜融合时或者当它们从质膜直接释放时，从细胞释放外排体。越来越清楚的是，外排体具有特化功能并且在例如凝固、细胞间信号传导和废物处理(waste management)中发挥关键作用。因此，对外排体的临床应用的兴趣日益增长，所述外排体包括汇总有来自于细胞的外排体的多个方面的合成外排体。外排体可潜在地用于预后、治疗以及健康和疾病的生物标志物。

发明内容

本公开内容提供了包含外排体的组合物及其在治疗和/或预防多种疾病或病症中的使用方法。

因此，本公开内容的一个方面提供了分离的外排体。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体在透射电子显微术中负染色后具有球形形态并且显现射线可透(radiolucent)，和/或所述分离的外排体在负染色透射电子显微术中不具有杯形(cup shape)形态。所述分离的外排体的直径为约10至150nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至100nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体从间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、成纤维细胞或巨噬细胞分离。在一些实施方案中，所述MSC、成纤维细胞或巨噬细胞是人MSC、人成纤维细胞或人巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MSC从脐带胶质(Wharton’s jelly)、脐带血、胎盘、外周血、骨髓或脂肪组织分离。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含在组合物中。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。

根据本公开内容的另一个方面，提供了分离的外排体。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体在负染色透射电子显微术(negative staining transmission electron microscopy)中具有杯形形态，和/或在负染色透射电子显微术中不具有球形形态。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约10至250nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至200nm。

根据另一个方面，提供了用于治疗肺病、心血管病、肾病或缺血性神经病(ischemic neural disorder)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有或有风险患有肺病、心血管病、肾病或缺血性神经病的对象施用治疗有效量的分离的外排体。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体在透射电子显微术中负染色后具有球形形态并且显现射线可透，和/或所述分离的外排体在负染色透射电子显微术中不具有杯形形态。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约10至150nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至100nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体从间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞或巨噬细胞分离。在一些实施方案中，所述MSC、成纤维细胞或巨噬细胞是人MSC、人成纤维细胞或人巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MSC从脐带胶质、脐带血、胎盘、外周血、骨髓或脂肪组织分离。在一些实施方案中，所治疗的肺病是炎性肺病、肺血管病或急性肺损伤。在一些实施方案中，所述炎性肺病是缺氧诱导的肺炎症、肺动脉高压(pulmonary hypertension)、哮喘、支气管肺发育异常(bronchopulmonary dysplasia，BPD)、变态反应或特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis)。在一些实施方案中，所述急性肺损伤与脓毒症(sepsis)相关，或者是呼吸机(ventilator)诱导的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)。在一些实施方案中，根据所述方法治疗的心血管病是心肌梗死、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化或心力衰竭。在涉及治疗肾病的一些实施方案中，所述肾病是缺血性肾损伤、急性肾衰竭或肾纤维化。在涉及治疗缺血性神经病的方法的一些实施方案中，所述病症是缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy)或缺血性卒中(ischemic stroke)。

根据本公开内容的又一个方面，提供了分离的外排体用于治疗肺病、心血管病、肾病或缺血性神经病的用途。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体在透射电子显微术中负染色后具有球形形态并且显现射线可透，和/或所述分离的外排体在负染色透射电子显微术中不具有杯形形态。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约10至150nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至100nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体从间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞或巨噬细胞分离。在一些实施方案中，所述MSC、成纤维细胞或巨噬细胞是人MSC、人成纤维细胞或人巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MSC从脐带胶质、脐带血、胎盘、外周血、骨髓或脂肪组织分离。在一些实施方案中，所述肺病是炎性肺病、肺血管病或急性肺损伤。在一些实施方案中，所述炎性肺病是缺氧诱导的肺炎症、肺动脉高压、哮喘、支气管肺发育异常(BPD)、变态反应或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述急性肺损伤与脓毒症相关，或者是呼吸机诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一些实施方案中，所述心血管病是心肌梗死、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化或心力衰竭。在一些实施方案中，所述肾病是缺血性肾损伤、急性肾衰竭或肾纤维化。在一些实施方案中，所述缺血性神经病是缺氧缺血性脑病或缺血性卒中。

根据另一个方面，提供了分离的外排体在制备用于治疗肺病、心血管病、肾病或缺血性神经病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体在透射电子显微术中负染色后具有球形形态并且显现射线可透，和/或所述分离的外排体在负染色透射电子显微术中不具有杯形形态。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约10至150nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至100nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体从间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞或巨噬细胞分离。在一些实施方案中，所述MSC、成纤维细胞或巨噬细胞是人MSC、人成纤维细胞或人巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MSC从脐带胶质、脐带血、胎盘、外周血、骨髓或脂肪组织分离。在涉及外排体用于制备用于治疗肺病之药物的用途的一些实施方案中，所述病症是炎性肺病、肺血管病或急性肺损伤。在一些实施方案中，所述炎性肺病是缺氧诱导的肺炎症、肺动脉高压、哮喘、支气管肺发育异常(BPD)、变态反应或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述急性肺损伤与脓毒症相关，或者是呼吸机诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一些实施方案中，提供了外排体用于制备用于治疗心血管病的药物的用途，所述病症是心肌梗死、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化或心力衰竭。在涉及外排体用于制备用于治疗肾病之药物的用途的一些实施方案中，所述肾病是缺血性肾损伤、急性肾衰竭或肾纤维化。在涉及外排体用于制备用于治疗缺血性神经病之药物的用途的一些实施方案中，所述病症是缺氧缺血性脑病或缺血性卒中。

根据本公开内容的又一个方面，提供了用于产生外排体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括培养细胞以产生条件培养基并从所述条件培养基分离外排体。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物；和/或所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的2、3、4、5、6、7或8种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体包含标志物ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的2、3、4、5、6或7种标志物。在一些实施方案中，所述分离的外排体不包含标志物FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2。在一些实施方案中，所述分离的外排体在透射电子显微术中负染色后具有球形形态并且显现射线可透，和/或所述分离的外排体在负染色透射电子显微术中不具有杯形形态。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约10至150nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体的直径为约30至100nm。在一些实施方案中，所述分离的外排体从间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞或巨噬细胞分离。在一些实施方案中，所述MSC、成纤维细胞或巨噬细胞是人MSC、人成纤维细胞或人巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MSC从脐带胶质、脐带血、胎盘、外周血、骨髓或脂肪组织分离。在一些实施方案中，所述培养包括二维(2D)培养或三维(3D)培养。在一些实施方案中，所述3D培养包括悬滴培养(hanging drop culturing)、基质上培养(culturing on matrice)、微载体上培养(culturing on microcarriers)、合成细胞外支架上培养(culturing onsynthetic extracellular scaffold)、壳聚糖膜上培养(culturing on chitosanmembrane)、磁悬浮下培养(culturing under magnetic levitation)、旋转生物反应器中悬浮培养(suspension culture in rotating bioreactors)或非接触抑制条件下培养(culturing under non-contact inhibition condition)。在一些实施方案中，所述培养包括使用选自TGFβ超家族(TGFβ1、激活素(Activin)、BMP、GDF、GDNF、抑制素(Inhibin)、Nodal、Lefty、MIS)EGF、PDGF和FGF的一种或更多种生长因子。在一些实施方案中，相对于包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2中一种或更多种标志物的外排体，所述方法增强包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105中一种或更多种标志物的外排体的产生。在一些实施方案中，所述增强包括相对于包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2中一种或更多种标志物的外排体，包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105中一种或更多种标志物的外排体的产生提高1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或者更多。

本文中将对本公开内容的这些及另一些方面和实施方案进行更详细的描述。

附图说明

图1.通过I.V.注射间充质干细胞外排体(mesenchymal stem cell exosome，MEX)制备物处理小鼠下调与血管重构和肺动脉高压相关的信号传导的缺氧活化并且改善缺氧诱导的肺炎症。(图1A)向年龄匹配的FVB/n小鼠注射人MEX(200亿颗粒/小鼠)并使其暴露于缺氧2.5天。MEX处理降低AKT及其下游靶标mTOR的缺氧诱导的磷酸化。DNA结合/分化蛋白抑制剂ID1(直接的SMAD靶向基因和BMPR2的下游信号)的肺蛋白质水平因缺氧而受到抑制，但是在MEX下提高。α微管蛋白充当归一化对照。(图1B)MEX处理抑制CCL2(早期炎性标志物)的mRNA水平。RNA水平相对于RPS9归一化。

图2.富集有a-MEX和f-MEX的外排体亚群的分离。将由单层WJ-MSC培养物条件化的培养基浓缩并调节至45％蔗糖。将这一制备物(prep)铺层在60％蔗糖垫上并用分步梯度(step gradient)的35％至5％蔗糖覆盖层。将制备物以180kxg离心20小时。以14x 1ml的级分收集梯度。通过Nanosight来测量每个级分中的颗粒数。通过Western针对ALIX、FLOT1、CAV1和SMAD 2/3的存在对每个级分的20μL进行分析。基于上述标志物鉴定到两个具有不同沉降速度和不同标志物组成的不同囊泡群(f-MEX和a-MEX)。

图3.通过western印迹来分析代表a-MEX和f-MEX的WJ-MSC制备物。在a-MEX中优先地富集有外排体生物发生标志物，例如Alix和Tsg101，而在f-MEX中富集有四跨膜蛋白CD9和CD81以及脂筏(lipid raft)标志物，例如flotilin 1和陷窝蛋白1(caveolin 1)。还对a-MEX具有特异性的是TGFBR2以及CD105和SMAD家族成员(在此未示出)。EGF受体和AKT家族成员(在此未示出)对f-MEX具有特异性。

图4.负染色电子显微术示出了a-MEX和f-MEX外排体亚群之间在尺寸、形状和射线可透性方面的差异。放大倍数：30,000X。

图5.如图1中使FVB/n小鼠暴露于缺氧并用富集有a-MEX或f-MEX的WJ-MSC外排体制备物进行处理。在缺氧下2.5天后收获肺，并使用RPS9作为归一化物(normalizer)通过RT-PCR来确定缺氧诱导的炎性标志物的mRNA水平。a-MEX而非f-MEX的处理导致CCL2、IL6和ADM的mRNA水平降低。

图6.球状体(spheroid)形成过程的示意图。向单层培养物添加TGFβb(10ng/ml)加速球状体形成。嵌图(insert)表示经甲苯胺蓝染色的WJ-MSC球状体的截面。

图7.WJ-MSC球状体主要分泌a-MEX。将标准单层培养物中的WJ-MSC用胰蛋白酶进行处理，并将单细胞悬液分成两等份，每份包含1500万个细胞。将一份在标准培养基和容器中作为单层增殖(2D培养)。将另一份通过悬滴方法来诱导球状体形成(3D培养)(30个球状体，每个球状体包含500,000个细胞)。通过Western印迹来测定由两种培养物条件化的等体积澄清培养基中指定标志物的存在。在由球状体条件化的培养基中富集有a-MEX特异性的标志物(SMAD 2/3、ALIX)，在通过单层条件化的培养基中主要观察到f-MEX特异性的FLOT1。

图8.由来自独立供体的MSC分泌的f-MEX与a-MEX比例与球状体形成效率成反相关。将来自两个不同供体(克隆D和克隆C)的WJ-MSC在非贴壁条件下(悬滴技术)培养24小时。(图8A)通过western印迹来测定由每种克隆之单层培养物条件化的等体积培养基中的a-MEX标志物SMAD 2/3和f-MEX标志物FLOT1。SMAD相对于FLOT1的比例指示，克隆D主要产生f-MEX，而克隆C的外排体产生包括显著量的a-MEX和f-MEX二者。(图8B)如通过光学显微术所检测的，克隆D的单细胞悬液在克隆C WJ-MSC的经相同处理悬液能够在24小时后形成紧凑球状体的条件下未表现出球状体形成能力。如通过锥虫蓝(trypan blue)所评估的，在24小时之后生存力高于95％。从悬滴收集条件培养基并分离外排体(如在方法中所述的)。克隆A外排体富集有flotilin 1，而克隆B富集有Alix，反映出外排体亚群在CM中的差别富集。

图9.向WJ-MSC的单层培养物添加TGFβ(10ng/ml)加速球状体形成的过程，并且导致a-MEX标志物(例如SMAD2/3)与f-MEX标志物(例如FLOT1)的比例提高，表明分泌群中a-MEX的比例提高。

图10.a-MEX具有TGFβ信号传导的功能模块。(图10A)向a-MEX制备物的等分试样添加PBS“C”、TGFβ、FGF或PDGF(10ng/ml)，之后在37℃下孵育30分钟。然后，将制备物裂解，并通过western印迹对其进行分析。外排体相关SMAD 2/3的磷酸化提高指示功能性TGFB2R受体复合物。通过用在其初级信号传导中不使用SMAD途径的生长因子FGF或PDGF处理未观察到所述效果。(图10B)将a-MEX或f-MEX制备物用TGFβ(10ng/ml)处理，孵育并如上进行分析。在a-MEX中特异性地观察到SMAD磷酸化。

图11.a-MEX而非f-MEX抑制TGFβ诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化和LPS介导的成纤维细胞活化。(图11A)用TGFβ刺激经3天血清饥饿(0.1％FBS)后的人肺成纤维细胞以经历肌成纤维细胞分化，所述肌成纤维细胞分化由α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscleactin，SMA)表达的提高来标志。用hMEX(2μg/ml)进行预处理消除TGFβ对α-SMA蛋白水平的作用。(图11B)用TGFβ刺激经24小时血清饥饿后的人肺成纤维细胞以诱导肌成纤维细胞标志物PAI1。用a-MEX进行处理阻止PAI1上调，这是用f-MEX处理未观察到的效果。(图11C)a-MEX处理在体外下调人肺成纤维细胞中的基线MCP-1和IL1βmRNA水平。

具体实施方式

本公开内容部分地基于以下出人意料的发现：由细胞(例如间充质干细胞)得到两种类型的外排体，并且所述外排体可基于分子标志物、尺寸、形态和功能相区分。例如，两个亚群中的一个包含独特的标志物并且在治疗某些病症中具有治疗效力，而另一亚群包含单独且独特的标志物组并且在治疗某些病症中缺乏治疗效力。

本公开内容广泛地涉及分离的外排体的组合物及其在治疗和/或预防某些疾病或病症中的使用方法，所述疾病或病症包括但不限于肺病、心血管病、肾病和缺血性神经病。

外排体及外排体制备物

本公开内容的外排体是从细胞(例如间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞和巨噬细胞)释放的膜(例如，脂质双层)囊泡。通过电子显微术，外排体通常被描述为具有杯形形态。然而，本公开内容的一些方面涉及以下新发现：与杯形相对，一些外排体(例如，如本文中所述的具有治疗效力的那些)在给定制备物中呈现出球形形态并且还是射线可透的(例如，半透明的)，如通过负染色透射电子显微术确定的。外排体在约100,000x g下沉积并且具有约1.10至约1.21g/ml的在蔗糖中的浮力密度(buoyant density)。可将外排体称为微囊泡或纳米囊泡。

本公开内容的一些方面涉及分离的外排体。本文中使用的分离的外排体是从其天然环境物理分离的外排体。分离的外排体可全部或部分地与其天然所存在的组织或细胞(所述细胞包括MSC、成纤维细胞和巨噬细胞)物理分离。在本公开内容的一些实施方案中，分离的外排体的组合物可不含细胞(例如MSC、成纤维细胞和巨噬细胞)，或者其可不含或基本不含条件培养基。通常来说，与未经操作的条件培养基中存在的外排体相比，分离的外排体以更高的浓度提供。

外排体可从来自于细胞培养物的条件培养基分离，所述细胞包括但不限于MSC、成纤维细胞和巨噬细胞。在实施例中提供了用于从MSC收获外排体的方法。简言之，这样的方法涉及首先将MSC在标准条件下进行培养直至其达到约70％汇合(confluency)，然后将细胞在无血清培养基中培养24小时，在此之后收集条件培养基并对其进行差速离心(400xg持续10分钟和12000xg持续10分钟)以除去细胞和细胞碎片。然后，使用100kDa MWCO过滤器(Millipore)通过超速离心对澄清的条件培养基进行浓缩，随后在12000xg下再离心10分钟。然后，使用尺寸排阻色谱如下分离外排体：将浓缩的条件培养基加载到经PBS平衡的Chroma S-200柱(Clontech)上，用PBS洗脱并收集350至550微升的级分。鉴定包含外排体的级分，并可将其合并。使用标准Bradford测定(Bio-Rad)来测量蛋白质浓度。可将经富集的外排体制备物的等分试样储存在-80℃。

还可通过将澄清的条件培养基在100,000x g下超速离心来纯化外排体。还可通过在蔗糖垫(sucrose cushion)上进行超速离心来纯化外排体。J Immunol Methods.2002；270:211-226中已描述了用于从树突细胞纯化外排体的GMP方法。

还可通过限定孔径的尼龙膜过滤器经由差别过滤来纯化外排体。通过大孔径的第一过滤将使细胞片段和碎片保留。通过较小孔径的后续过滤将使外排体保留并将其从较小尺寸的污染物中纯化。

在一些实施方案中，将外排体分级成两个富集有本文中所述的某些标志物的亚群。用于分级两个亚群的方法在实施例中进行了描述，并且包括例如在分步梯度的蔗糖(5％至60％)、碘克沙醇(iodixanol，OptiprepTM，0％至60％)或类似分离介质中进行速度超速离心。

在一些实施方案中，本公开内容提供了基于分子标志物、尺寸、形态和功能来区别的两种不同类型的外排体。在本公开内容通篇，将这两种不同类型称为“a-型”和“f型”，并且当来自于MSC时，可互换地称为“a-MEX”(对于“a”型来自于

例如，在一些实施方案中，分离的a-型外排体包含选自以下的一种或更多种标志物(例如，蛋白质)：ALIX(还称为“程序性细胞死亡6相互作用蛋白”或PDCD6IP；HomoloGene：22614；例如NCBI参考序列：NP_001155901.1)、TSG101(肿瘤易感基因101；HomoloGene：4584；例如，NCBI参考序列：NP_006283.1)、TGFBR2(转化生长因子β受体II；HomoloGene：2435；例如，NCBI参考序列：NP_001020018.1)、SMAD1(SMAD家族成员1；HomoloGene：21196；例如，NCBI参考序列：NP_001003688.1)、SMAD2(SMAD家族成员2；HomoloGene：21197；例如，NCBI参考序列：NP_001003652.1)、SMAD3(SMAD家族成员3；HomoloGene：55937；例如，NCBI参考序列：NP_001138574.1)、SMAD5(SMAD家族成员5；HomoloGene：4313；例如，NCBI参考序列：NP_001001419.1)和CD105(还称为内皮联蛋白(Endoglin)或ENG；HomoloGene：92；例如NCBI参考序列：NP_000109.1、NP_001108225.1、NP_001265067.1)。在一些实施方案中，a-型包含这些标志物中的2、3、4、5、6、7或8种。在一些实施方案中，当外排体“包含”特定标志物时，意指所述外排体包含可检出水平(例如，如通过Western印迹确定的)的该标志物和/或水平足以在靶细胞或组织中引发特定应答或者在本文中所述的治疗方法的情况下在对象中引发特定应答。可见于a-型外排体中的这些标志物(例如，蛋白质)中的一些包含认为有助于其功能和治疗效果的TGF/BMP生长因子超家族中的一部分。在一些实施方案中，分离的a-型外排体不包含选自以下的一种或更多种标志物：FLOT1(flotillin 1；HomoloGene：31337；例如，NCBI参考序列：NP_005794.1)、CD9(CD9分子；HomoloGene：20420；例如，NCBI参考序列：NP_001760.1)、CD81(CD81分子；HomoloGene：20915；例如，NCBI参考序列：NP_004347.1)、CAV1(陷窝蛋白1；HomoloGene：1330；例如，NCBI参考序列：NP_001166366.1)、EGFR(表皮生长因子受体；HomoloGene：74545；例如，NCBI参考序列：NP_005219.2、NP_958439.1、NP_958440.1、NP_958441.1)、AKT1(v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1；HomoloGene：3785；例如，NCBI参考序列：NP_001014431.1)和AKT2(v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物2；HomoloGene：48773；例如，NCBI参考序列：NP_001229956.1)。在一些实施方案中，a-型不包含这些标志物中的2、3、4、5、6或7种。在一些实施方案中，当外排体“不包含”特定标志物时，意指所述外排体不包含该特定标志物，或者仅包含不显著量的该特定标志物。例如，不显著量可以是不可检出的量或者仅以痕量可检出的量。

在一些实施方案中，可基于形态来将a-型外排体与f-型外排体相区分。外排体通常被描述为具有杯形形态。出人意料的是，与杯形形态相对，本公开内容提供了具有球形的外排体(a-型)。用于评估外排体形态的方法在本领域中是已知的并且包括透射电子显微术以及透射电子显微术中的负染色。此外，使用透射电子显微术中的负染色发现a-型外排体是射线可透的(例如，半透明的)。相反，如通过透射电子显微术中的负染色确定的，f-型外排体呈现出杯形形态并且不是射线可透的。

在一些实施方案中，基于尺寸来将a-型外排体与f-型外排体相区分。例如，在一些实施方案中，a-型外排体的直径为约10至150nm、约20至120nm或者约30至100nm。

在另一些方面，本公开内容提供了分离的f-型外排体。在一些实施方案中，分离的f-型外排体包含选自FLOT1、CD9、CD81、CAV1、EGFR、AKT1和AKT2的一种或更多种标志物(例如，蛋白质)。在一些实施方案中，分离的f-型外排体包含这些标志物中的2、3、4、5、6或7种。在一些实施方案中，当外排体“包含”特定标志物时，意指所述外排体包含可检出水平(例如，如通过Western印迹确定的)的所述标志物和/或水平足以在靶细胞或组织中引发特定应答或者在本文中所述的治疗方法的情况下在对象中引发特定应答。可见于f-型外排体中的这些标志物(例如，蛋白质)中的一些包含FGF/PDGF生长因子超家族中的一部分。FGF/PDGF信号传导途径参与血管发生。因此，认为f-型外排体(例如，其组合物)可用于增强血管发生。在一些实施方案中，分离的f-型外排体不包含选自ALIX、TSG101、TGFBR2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和CD105的一种或更多种标志物。在一些实施方案中，f-型外排体不包含这些标志物中的2、3、4、5、6、7或8种。在一些实施方案中，当外排体“不包含”特定标志物时，意指所述外排体不包含所述特定标志物，或者仅包含不显著量的所述特定标志物。例如，不显著量可以是不可检出的量或者仅以痕量可检出的量。

如上文和实施例中所述的，如通过负染色透射电子显微术所确定的，f-型外排体展现出杯形形态。在一些实施方案中，f-型外排体的直径为约10至250nm、约20至230nm或者约30至200nm。在一些实施方案中，f-型外排体的直径不小于100nm。

外排体(包括a-型外排体和f-型外排体两种)由多种不同的细胞类型产生，所述细胞类型包括但不限于MSC、成纤维细胞和巨噬细胞。用于获得这样的细胞的方法是本领域中公知的。MSC的来源在本文中进行了更详细的描述。

本公开内容还考虑使用具有本文中所述的分离的外排体的一些或全部特征的合成外排体。这些合成外排体可在体外合成(而非从细胞或条件培养基得到和分离)。其可以是具有本文中提供的蛋白质中一种或更多种(包括2、3、4、5、6、7、8种或更多种)的合成脂质体。其可包含或者可不包含编码这些蛋白质中一种或更多种(包括2、3、4、5、6、7、8种或更多种)的核酸。脂质体合成在本领域中是已知的，并且脂质体可从商业来源购买。应理解，在合成外排体的情况中还考虑本文中涉及从细胞(或来自于细胞的条件培养基)得到和分离的外排体所述的多种组合物、制剂、方法和用途。

本公开内容考虑立即使用外排体，或者作为替选地在使用之前将外排体以例如冷藏保存状态短期和/或长期储存。在冷冻介质中通常包含蛋白酶抑制剂，因为其在长期储存期间提供外排体完整性。在-20℃下冷冻不是优选的，因为其与外排体活性的丧失提高有关。因为其保存活性，更优选在-80℃下快速冷冻。(参见例如Kidney International(2006)69,1471–1476.)可向冷冻介质使用添加剂以增强外排体生物活性的保存。这样的添加剂与用于冷藏保存完整细胞的添加剂类似，并且可包括但不限于DMSO、甘油和聚乙二醇。

细胞

间充质干细胞(MSC)是具有分化成神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、心脏组织以及其他内皮细胞和上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如Wang,StemCells 2004；22(7)；1330-7；McElreavey；1991Biochem Soc Trans(1)；29s；Takechi,Placenta 1993年3月/4月；14(2)；235-45；Takechi,1993；Kobayashi；Early HumanDevelopment；1998年7月10日；51(3)；223-33；Yen；Stem Cells；2005；23(1)3-9.)。这些细胞可通过基因或蛋白质表达来在表型方面进行限定。这些细胞已被表征为表达以下中的一种或更多种(并且由此对其呈阳性)：CD13；CD29；CD44；CD49a、b、c、e、f；CD51；CD54；CD58；CD71；CD73；CD90；CD102；CD105；CD106；CDw119；CD120a；CD120b；CD123；CD124；CD126；CD127；CD140a；CD166；P75；TGF-bIR；TGF-bIIR；HLA-A、B、C；SSEA-3、SSEA-4、D7和PD-L1。这些细胞还已被表征为不表达CD3；CD5；CD6；CD9；CD10；CD11a；CD14；CD15；CD18；CD21；CD25；CD31；CD34；CD36；CD38；CD45；CD49d；CD50；CD62E、L、S；CD80；CD86；CD95；CD117；CD133；SSEA-1和ABO(并且因此对其呈阴性)。因此，可根据MSC的分化潜能在表型和/或功能方面对其进行表征。

MSC可从多种来源收获，所述来源包括但不限于骨髓、血液、骨膜(periosteum)、真皮、脐带血和/或基质(例如，脐带胶质)和胎盘。用于收获MSC的方法在实施例中进行了更详细的描述。有关可用于本公开内容的其他收获方法，还可参考美国专利No.5486359。

成纤维细胞是合成细胞外基质和胶原(动物组织的结构构架(例如间质))并且在伤口愈合中发挥关键作用的细胞类型。成纤维细胞是动物的结缔组织中最常见的细胞。成纤维细胞通常具有围绕具有两个或更多个核仁的椭圆形的有斑点细胞核的分支细胞质。活跃的成纤维细胞可通过其丰富的粗面内质网来识别。不活跃的成纤维细胞(其还称为纤维细胞)较小并且是纺锤形的。其具有降低的粗面内质网。

成纤维细胞的来源包括结缔组织，例如疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性结缔组织、网状结缔组织和脂肪结缔组织。另外，存在胚胎结缔组织，以及特化结缔组织，其包括骨、软骨和血液。其他来源包括皮肤。用于分离和培养成纤维细胞的方法是本领域中公知的(参见，例如Weber等,“Isolation and Culture of Fibroblasts,Vascular SmoothMuscle,and Endothelial Cells From the Fetal Rat Ductus Arteriosus.”PediatricResearch.2011；70,236–241；Huschtscha等,“Enhanced isolation of fibroblasts fromhuman skin explants.”Biotechniques.2012；53(4):239-44；其全部内容在此通过引用并入)。

在一些实施方案中，使用成纤维细胞或成纤维细胞条件培养基来产生和分离本文中所述的外排体。用于由成纤维细胞产生和分离外排体的方法在本领域中是已知的(参见，例如Luga等,“Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCPsignaling in breast cancer cell migration.”Cell.2012；151(7):1542-56；Bang等,“Cardiac fibroblast-derived microRNApassenger strand-enriched exosomesmediate cardiomyocyte hypertrophy.”J Clin Invest.2014；124(5):2136-46；Hoffman,“Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for thepromised niche.”Breast Cancer Research,2013；15:310；其全部内容在此分别通过引用并入)。

巨噬细胞是由组织中单核细胞的分化产生的细胞。巨噬细胞在非特异性防御(固有免疫)中发挥功能以及有助于引发脊椎动物的特异性防御机制(适应性免疫)。其是通过破坏和摄取来攻击外来物质、感染性微生物和癌细胞的特化吞噬细胞。其存在于所有的活组织中并且在再生中具有功能。巨噬细胞可通过流式细胞术、免疫组织化学染色或其他合适的方法由多种蛋白质的特异性表达来鉴定，所述蛋白质包括CD14、CD40、CD11b、CD64、F4/80(小鼠)/EMR1(人)、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和CD68。

巨噬细胞的来源包括几乎任何组织，并且可容易地从血液和骨髓来源。分离和培养巨噬细胞的方法是本领域中公知的(参见，例如，Bennet,“Isolation and cultivationin vitro of macrophages from various sources in the mouse.”Am J Pathol.1966年1月；48(1):165–181；Davies和Gordon,“Isolation and culture of murinemacrophages.”Methods Mol Biol.2005；290:91-103；Weischenfeldt和Porse,“BoneMarrow-Derived Macrophages(BMM):Isolation and Applications.”CSH Protoc.2008:pdb.prot5080.doi:10.1101/pdb.prot5080；其全部内容在此分别通过引用并入)。

在一些实施方案中，使用巨噬细胞或巨噬细胞条件培养基来产生和分离本文中所述的外排体。用于由巨噬细胞产生和分离外排体的方法在本领域中是已知的(参见，例如，Lee等,“Exosomes derived from human macrophages suppress endothelial cellmigration by controlling integrin trafficking.”Eur J Immunol.2014；44(4):1156-69；Yang等,“Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells.”Mol Cancer.2011；10:117；Lee等,“Exosome release of ADAM15 and the functional implications of humanmacrophage-derived ADAM15 exosomes.”FASEB J.2012；26(7):3084-95；其全部内容在此分别通过引用并入)。

设想用于本公开内容的方法的MSC、成纤维细胞和/或巨噬细胞以及由此得到的外排体可来自于同一待治疗对象(并且因此将其称为该对象自体同源的)，或者其可来自于不同对象，优选同一物种的不同对象(并且因此将其称为该对象同种异体的)。

如本文中所用，应理解，除非另外指出，否则本公开内容的一些方面和实施方案涉及细胞及细胞群。因此，除非另外指出，否则当提及细胞时，应理解细胞群也在考虑之内。

本文中使用的分离的细胞(例如，MSC、成纤维细胞和/或巨噬细胞)是已与其天然环境物理分离的细胞，所述物理分离包括与其天然环境的一种或更多种组分物理分离。因此，分离的细胞或细胞群涵盖已进行体外或离体操作的细胞或细胞群。作为一个实例，分离的细胞(例如，MSC、成纤维细胞和/或巨噬细胞)可以是已与该细胞所收获自的组织中至少50％、优选至少60％、更优选至少70％并且甚至更优选至少80％的细胞物理分离的细胞。在一些情况下，如本文中在表型和/或功能方面所限定的，分离的细胞存在于为至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％细胞的群体中。优选地，与起始细胞群相比，在分离的制备物中MSC、成纤维细胞和/或巨噬细胞与其他细胞的比例提高。

MSC可基于其对组织培养塑料的黏附性使用本领域中已知的方法从例如骨髓单个核细胞、脐带血、脂肪组织、胎盘组织来分离。例如，可从可商购获得的骨髓抽出物(bonemarrow aspirate)来分离MSC。MSC在细胞群中的富集可使用本领域中已知的方法来实现，所述方法包括但不限于FACS。

可使用可商购获得的培养基来生长、培养和维持MSC、成纤维细胞和巨噬细胞。这样的培养基包括但不限于Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，DMEM)。可用于生长、培养和维持MSC、成纤维细胞和巨噬细胞的此类培养基中的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然的)、盐、糖、来自于植物的水解产物、丙酮酸钠、表面活性剂、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸盐或有机物、DMSO、来自于动物的产品、基因诱导剂、非天然糖、细胞内pH调节剂、甜菜碱或渗透保护剂(osmoprotectant)、痕量元素、扩物质、非天然维生素。可用于补充可商购获得组织培养基的其他组分包括例如动物血清(例如，胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)、胎小牛血清(fetal calf serum，FCS)、马血清(horse serum，HS))、抗生素(例如，包括但不限于青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟素(blasticidin)、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博莱霉素、头孢菌素、金霉素(chlortetracycline)、吉欧霉素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如，L-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长也依赖于合适有氧环境、pH和温度的维持。MSC可使用本领域中已知的方法来维持(参见例如Pittenger等,Science,284:143-147(1999))。

本公开内容的某些方面涉及以下出人意料的发现：培养条件可偏向外排体类型的产生。例如，如实施例中所述的，培养条件可偏向a-型外排体相对于f-型外排体的产生。在一些实施方案中，与常规的二维(例如，单层)培养相比，三维(3D)培养增强a-型外排体相对于f-型外排体的产生。用于3D培养的方法是本领域中公知的，并且包括但不限于悬滴培养、基质上培养、微载体上培养、合成细胞外支架上培养、壳聚糖膜上培养、磁悬浮下培养、旋转生物反应器中悬浮培养或非接触抑制条件下培养。参见，例如Haycock JW.(2011)."3Dcell culture:a review of current approaches and techniques.".Methods MolBiol.695:1–15；Lee,J；Cuddihy MJ,Kotov NA.(2008年3月14日).Three-dimensionalcell culture matrices:state of the art..doi:10.1089/teb.2007.0150；Pampaloni,Francesco(2007年10月)."The third dimension bridges the gap between cellculture and live tissue".Nature Reviews 8:839–845；and Souza,Glauco(2010年3月14日)."Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation".Nature Nanotechnology:291–296；每一篇的全部内容在此分别通过引用并入。另外，还出人意料地发现，某些生长因子的添加增强a-型外排体相对于f-型外排体的产生。例如，添加选自TGFβ超家族(TGFβ1、激活素、BMP、GDF、GDNF、抑制素、Nodal、Lefty、MIS)EGF、PDGF或FGF的更多种生长因子可增强a-型外排体相对于f-型外排体的产生。

在一些实施方案中，所述增强(例如，在3D培养和/或添加生长因子的情况下)包括a-型外排体相对于f-型外排体提高1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、12.0倍、15.0倍或20.0倍或者更多。

对象

本公开内容的方法可对可能从所述方法受益的任何对象进行，所述对象包括人对象、农业牲畜(例如，牛、猪等)、珍贵动物(prized animal)(例如，马)、伴侣动物(例如，狗、猫等)等。在本公开内容的多个方面，优选人对象。在一些方面，使用人对象和人MSC外排体。

所述对象可以是能够使用本公开内容中所述的外排体来进行治疗的患有本文中所述的疾病(或病症)的那些，或者所述对象可以是处于发生这样的疾病(或病症)的风险之中的那些。这样的对象包括新生儿，特别是低胎龄出生的新生儿。本文中使用的人新生儿指从出生到约4周龄的人。本文中使用的人婴儿是指从约4周龄到约3岁龄的人。本文中使用的低胎龄是指在给定物种的正常妊娠期之前发生的出生(或分娩)。在人中，完整妊娠期为约40周，并且范围可以是37周至超过40周。人中类似于早产的低胎龄限定为发生在妊娠37周之前的出生。因此，本公开内容考虑预防和/或治疗在妊娠37周之前出生的对象，所述对象包括在甚至更短妊娠期时(例如，妊娠36周之前、妊娠35周之前、妊娠34周之前、妊娠33周之前、妊娠32周之前、妊娠31周之前、妊娠30周之前、妊娠29周之前、妊娠28周之前、妊娠27周之前、妊娠26周之前或妊娠25周之前)出生的那些。通常，这样的早产儿在新生儿时进行治疗，然而，本公开内容考虑其在甚至超过新生儿期之外和进入童年期和/或成年期的治疗。某些对象可具有本文中所述的某些疾病(或病症)形式(例如肺动脉高压)的遗传倾向，并且这些对象也可根据本公开内容来进行治疗。

预防和治疗疾病的方法

本公开内容考虑预防和治疗某些疾病或病症。预防疾病意指降低疾病自身显现的可能性和/延迟疾病的发生。治疗疾病意指减轻或消除疾病的症状。本文中所述的a-型外排体包含TGF/BMP途径的功能信号传导组分，并且在治疗涉及该途径的病症中具有治疗效力。这样的病症包括某些肺病和血管病，如本文中所述(参见，例如,Cai等,“BMP signaling invascular diseases”FEBS Lett.2012(14):1993-2002.；Davies等,“TGF-β/BMP Signalingin Pulmonary Vascular Disease.”Vascular Complications in HumanDisease.Springer,2008,第46-59页；Alejandre-Alcázar等,“Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia.”Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol.2007；292(2):L537-49；Stumm等,“Lung Remodeling ina Mouse Model of Asthma Involves a Balance between TGF-β1and BMP-7.”PLoSOne.2014；DOI:10.1371/journal.pone.0095959；每一篇的全部内容均在此通过引用并入)。事实上，如实施例中所证明的，通过I.V.注射a-型外排体制备物来处理小鼠下调与血管重构和肺动脉高压相关的信号传导的缺氧活化并且改善缺氧诱导的肺炎症。

因此，本公开内容的一些方面提供了预防和/或治疗多种肺(或肺部)疾病的组合物和方法。这些疾病包括炎性肺病，例如但不限于肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)(其还称为肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH))、哮喘、支气管肺发育异常(bronchopulmonary dysplasia，BPD)、变态反应、结节病和特发性肺纤维化。这些疾病还包括可不具有炎性组分的肺血管疾病。可根据本公开内容进行治疗的另一些肺病症包括可与脓毒症或者与通气(ventilation)相关的急性肺损伤。该后一种病症的一个实例是发生于较大儿童和成人中的急性呼吸窘迫综合征。

肺动脉高压是以肺动脉中的血压远远高于正常水平为特征的肺病。症状包括短气(shortness of breath)；胸痛，特别是在身体活动期间；虚弱；疲劳；昏厥；头晕目眩(lightheadedness)，特别是在运动期间；眩晕；异常心音和杂音；颈静脉充盈；腹部、腿和踝中体液潴流(fluid retention)；以及甲床变蓝(bluish coloring in the nail bed)。

支气管肺发育异常是折磨已给予氧或已在呼吸机上的新生儿或者过早出生的新生儿，特别是极其过早出生的那些(例如，在妊娠32周之前出生的那些)的病症。还将其称为新生儿慢性肺病。BPD的原因包括机械性损伤(例如由通气引起)、氧毒性(例如由氧治疗引起)和感染。所述疾病可随时间从非炎性的发展成炎性的。症状包括青色皮肤(bluishskin)、久咳(chronic cough)、快速呼吸(rapid breathing)和短气。患有BPD的对象更易遭受感染，例如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)感染。患有BPD的对象可发生肺动脉高压。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(还称为呼吸窘迫综合征(respiratory distresssyndrome，RDS)或成人型呼吸窘迫综合征)是因为肺损伤或急性疾病而发生的病症。所述肺损伤可由通气、创伤、烧伤和/或吸气引起。所述急性疾病可以是感染性肺炎或脓毒症。其认为是急性肺损伤的一种严重形式，并且其通常是致命的。其以肺炎症、气体交换受损以及释放炎性介质、低氧血症和多器官衰竭为特征。ARDS还可限定为在胸部X射线上两侧浸润存在下动脉血氧分压(arterial partial oxygen tension)(PaO

特发性肺纤维化以肺原因不明地发生瘢痕形成或增厚为特征。其通常发生于50至70岁的人中。其症状包括短气、经常咳嗽(通常为干咳)、胸痛和活动水平降低。

变态反应是免疫系统的超敏反应病症，其中症状包括目赤(red eye)、搔痒以及流鼻涕(runny nose)、湿疹、荨麻疹(hives)或哮喘发作。变态反应在例如哮喘的病症中发挥主要作用。针对环境或饮食变应原或者针对药物的严重变态反应可导致称为过敏反应的威胁生命反应。当个人免疫系统对通常为环境中的常规无害物质的物质作出反应时，可发生变态反应。变态反应是四种超敏反应形式之一并且有时称为I型(或速发型)超敏反应。变态反应因某些白细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)被免疫球蛋白E(IgE)过度活化而独特。该反应导致可从轻度不适到危险的炎性应答。存在多种诊断变应性病症的测试。测试包括在皮肤上放置可能的变应原并观察例如肿胀的反应，以及寻找变应原特异性IgE的血液测试。

缺氧诱导的肺炎症是通常由急性肺损伤和/或ARDS引起的病症，在此炎性应答由长期暴露于缺氧条件引起。这样的炎性应答包括在暴露于低压缺氧(hypobaric hypoxia)的人的支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞、嗜碱性粒细胞和炎性细胞因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)提高。

能够使用a-型外排体(例如，通过增强TGF/BMP途径)来进行治疗的其他病症包括心血管病，例如心肌梗死、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化和心力衰竭(参见，例如Pardali等,“TGFβSignaling and Cardiovascular Diseases.”Int J Biol Sci 2012；8(2):195-213；Garside等,“Coordinating Notch,BMP,and TGF-βsignaling during heartvalve development.”Cell Mol Life Sci.2013；70(16):2899-917；Wang等,“BmpSignaling in Congenital Heart Disease:New Developments and FutureDirections.”Birth Defects Res A Clin Mol Teratol.2011；91(6):441–448；Ruiz-Ortega等,“TGF-beta signaling in vascular fibrosis.”Cardiovasc Res.2007；1；74(2):196-206；Bujak等,“The role of TGF-βSignaling in Myocardial Infarction andCardiac Remodeling.”Cardiovasc Res.2007；74(2):184–195；Chang等,“Impact ofmyocardial infarct proteins and oscillating pressure on the differentiationof mesenchymal stem cells:effect of acute myocardial infarction on stem celldifferentiation.”Stem Cells.2008；26(7):1901-12；Koitabashi等,“Pivotal role ofcardiomyocyte TGF-βsignaling in the murine pathological response to sustainedpressure overload.”J Clin Invest.2011；121(6):2301–2312；和Blann等,“Serumlevels of the TGF-beta receptor are increased in atherosclerosis.”Atherosclerosis.1996；120(1-2):221-6；每一篇的全部内容在此分别通过引用并入)。

心肌梗死是通常称为心脏病发作(heart attack)的事件的医学术语。当血液停止向心脏的一部分适当流动并且心肌由于未接受足够的氧而受到损伤时，发生心肌梗死。当向心脏供应血液的冠状动脉之一由于白细胞、胆固醇和脂肪的不稳定积累而发生阻塞时，常常引起这种情况。如果事件是突发且严重的，将其称为“急性的”。急性心肌梗死的症状包括在胸骨后面感觉到并且有时发展至左臂或颈部左侧的突发胸痛。另外，个体可具有短气、出汗、恶心、呕吐、异常心跳和焦虑。与男性相比，女性经历较少的这些症状，但是通常具有短气、虚弱、消化不良感(feeling of indigestion)和疲劳。

心血管疾病是指影响心血管系统的任何疾病，主要是心脏病、脑和肾的血管病以及外周动脉疾病。心血管疾病的原因不同，但是最常见的是动脉粥样硬化和/或高血压。另外，随着年龄的增长，出现多种生理变化和形态变化，其改变心血管功能并且导致心血管疾病的风险提高，甚至在健康的无症状个体中也如此。

动脉粥样硬化是其中动脉壁由于白细胞的入侵和累积而增厚并且包含活的活跃WBC(炎症)和残余的死细胞二者的特定动脉硬化形式，其在最外面且最老的斑块中包含胆固醇和甘油三酯，最后是钙和其他结晶材料。由于动脉肌壁在斑块的位置扩大，因此在数十年内这些变化降低动脉壁的弹性但不影响血流量。然而，壁变硬最终可增大脉压；脉压变宽是主动脉内晚期疾病的一个可能原因。症状可由冠状动脉(其负责向心脏提供氧合血(oxygenated blood))的显著变窄引起，从而产生例如以下症状：心绞痛胸痛和短气、出汗、恶心、眩晕或头晕目眩、呼吸困难(breathlessness)或心悸。颈动脉显著变窄还可伴随着例如以下症状：虚弱感；不能够清晰思考；说话困难；变得眩晕且难以行走和或直立；视力模糊；面部、臂和腿麻木；严重头痛和丧失意识。这些症状还与卒中(即，脑细胞的死亡)相关。卒中由进入脑的动脉的显著变窄/闭合引起；缺乏充分的血液供应导致受影响组织中的细胞死亡。向腿、臂和骨盆供应血液的外周动脉由于斑块破裂和凝块也经历显著变窄。显著变窄的症状是臂或腿麻木，以及疼痛。斑块形成的另一显著位置是向肾供应血液的肾动脉。斑块发生和累积导致肾血流量降低和慢性肾病，其与所有其他部位类似通常是无症状的，直至晚期。

高血压(有时称为动脉高血压)是其中动脉中的血压升高的慢性医学病症。高血压分类为原发性(自发性)高血压或继发性高血压；约90％至95％的情况归类为“原发性高血压”，其意指无明显潜在医学原因的高血压。剩余的5％至10％情况(继发性高血压)由影响肾、动脉、心脏或内分泌系统的其他病症引起。高血压向心脏施加应力，如果不进行治疗的话导致高血压性心脏病和冠状动脉疾病。高血压还是卒中、动脉瘤(例如主动脉瘤)、外周动脉疾病的主要风险因素，并且是慢性肾病的原因。高血压很少伴随有任何症状，并且其鉴定通常通过筛选，或者当因为不相关问题而寻求医疗时。一部分患有高血压的人报道头痛(特别是在头部后面和早晨)以及头晕目眩、眩晕、耳鸣(耳中嗡嗡响(buzzing)或有嘶嘶声(hissing))、视力改变或晕厥发作。

心力衰竭(通常用于意指慢性心力衰竭)发生在当心脏不能够提供足够的泵作用来维持满足机体需求的血流量时。当除上述之外还存在水肿时，将其称为充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)或充血性心衰(congestive cardiac failure，CCF)。心力衰竭可引起多种症状，包括短气、腿肿胀和运动不耐受(exercise intolerance)。心力衰竭的常见原因包括心肌梗死(心脏病发作)以及其他形式的冠状动脉疾病、高血压、心脏瓣膜病和心肌病。有时将术语心力衰竭不正确地用于心肌梗死(其可引起心力衰竭，但本身不是心力衰竭)或者用于心脏停搏(其中血流有效地一起停止)。

能够使用a-型外排体(例如，通过增强TGF/BMP途径)来进行治疗的又一些病症包括肾病，例如缺血性肾损伤、急性肾衰竭和肾纤维化(参见，例如Meng等,“Role of theTGF-β/BMP-7/Smad pathways in renal diseases.”Clin Sci(Lond).2013；124(4):243-54；Zerisberg等,“BMP-7counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymaltransition and reverses chronic renal injury.”Nat Med.2003；9(7):964-8；和Yanagita,“Inhibitors/antagonists of TGF-βsystem in kidney fibrosis.”NephrolDial Transplant.2012；27(10):3686-91；每一篇的全部内容均在此通过引用并入)。

当向肾的血流量不足(灌注不足(hypoperfusion))时，发生缺血性肾损伤或缺血性肾病。灌注不足可导致肾功能丧失和肾萎缩(缩小)。但该过程损伤两个肾时，导致肾衰竭。缺血性肾病中通常存在以下临床情形中的一种：双侧肾动脉狭窄(RAS；供应两个肾的大动脉变窄)；仅具有一个功能肾的人中的单侧RAS；或者对另一个肾具有高血压性损伤的单侧RAS。缺血性肾损伤的症状包括尿毒症(蛋白质副产物(例如尿素)的高血液水平)；由肺中突然累积流体引起的急性呼吸困难(呼吸费力或困难)发作；并且基于损伤的严重程度，可存在高血压。可在颈部(颈动脉杂音)、腹部(其可反映肾动脉变窄)和腹股沟(股动脉杂音)中检测到由动脉中的血液湍流引起的杂音(用听诊器听到的声音或杂音)。

急性肾衰竭或急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是肾功能的突然丧失，其通常在7天内发生。其发生一般由以下所致的肾组织损伤引起：由任何原因(例如低血压)引起的肾血流量降低(肾缺血)、暴露于对肾有害的物质、肾中的炎性过程或者妨碍尿流动的尿道梗阻。急性肾衰竭基于例如以下特征性实验室结果来进行诊断：血尿素氮和肌酐升高，或者肾不能够产生足够量的尿。急性肾衰竭可导致很多并发症，包括代谢性酸中毒、高钾水平、尿毒症、体液平衡改变以及对其他器官系统的影响。急性肾损伤的症状包括尿素累积，并且血流中的其他含氮物质导致很多症状，例如疲劳、食欲不振(loss of appetite)、头痛、恶心和呕吐。钾水平升高可导致心跳不规律，其可以是严重的且威胁生命的。流体平衡通常受到影响，但是高血压较为罕见。在一些病症(例如，肾血管的血栓形成或肾炎症)中遭受胁部疼痛；这是纤维组织包膜围绕肾延伸的结果。如果肾损伤是由脱水引起，则在身体检查时可能存在口渴以及流体消耗的迹象。身体检查还可提供关于肾问题的潜在原因的其他线索，例如间质性肾炎爆发和可触及的膀胱(palpable)。从机体排泄足够流体的能力降低可导致流体在肢体(外周性水肿)和肺(肺水肿)中累积，以及由流体渗出物引起的心脏压塞(cardiac tamponade)。

肾纤维化由发生在几乎每种类型的慢性肾病中的细胞外基质的过度累积引起。肾纤维化的发病机理是通常导致末期肾衰竭的进行性过程。在一些方面，肾纤维化表示在慢性的持续损伤之后肾组织的伤口愈合过程失效。很多细胞途径(例如系膜和成纤维细胞活化以及管状上皮-间充质转化)已鉴定为在患病状态中生成基质产生细胞(matrix-producing cell)的主要原因。调节肾纤维化过程的纤维发生因子(例如转化生长因子(TGF))有助于该病症。有关内源抗纤维变性因子(antifibrotic factor)的最近发现已发展了旨在拮抗TGF-/Smad信号传导的纤维发生作用的新策略。

能够使用a-型外排体(例如，通过增强TGF/BMP途径)来进行治疗的又一些病症包括缺血性神经病，例如缺氧缺血性脑病或缺血性卒中(参见，例如Harvey等,“Stroke andTGF-beta proteins:glial cell line-derived neurotrophic factor and bonemorphogenetic protein.”Pharmacol Ther.2005；105(2):113-25；Krampert等,“Smad7regulates the adult neural stem/progenitor cell pool in a transforming growthfactor beta-and bone morphogenetic protein-independent manner.”Mol CellBiol.2010；30(14):3685-94；和Yin等,“Effect of hyperbaric oxygen on neurologicalrecovery of neonatal rats following hypoxic-ischemic brain damage and itsunderlying mechanism.”Int J Clin Exp Pathol.2013；6(1):66–75；每一篇的全部内容均在此通过引用并入)。

缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)或围产期窒息以由窒息引起的急性或亚急性脑损伤的临床和实验室证据为特征。该病症的主要原因是全身性血氧过少和/或脑血流量降低。在世界范围内，出生窒息导致所有新生儿死亡中的840,000例或23％。轻度缺氧-缺血性脑病的迹象和症状包括：肌张力略有提高；并且可观察到短暂的行为异常(例如，喂养不良、易怒或者过度哭闹或睡眠)。中等严重缺氧-缺血性脑病的症状包括：婴儿昏睡以及显著的张力过低(hypotonia)和深度腱反射减弱；抓握反射、莫洛(Moro)反射和吸吮反射可迟缓或者不存在；婴儿可经历偶尔的呼吸短暂期；并且在出生后的前24小时内早期可发生癫痫发作(seizure)。严重缺氧-缺血性脑病的症状包括延迟且严重的并且可初始对常规治疗产生抗性的癫痫发作。癫痫发作通常是全身性的，并且其频率可在发作后的24至48小时期间提高，这与再灌注损伤的时期相关。其他症状包括：木僵(stupor)或昏迷(婴儿可对除最有害刺激之外的任何物理刺激无应答)；呼吸不规律；全身性张力过低和深度腱反射降低；不存在新生儿反射(例如，吮吸、吞咽、抓握、莫罗反射)；眼部运动失调(例如，眼睛偏斜、眼球震颤、眼球浮动(bobbing))；瞳孔散大、固定或对光反应性差；以及心率和血压不规律。

缺血性卒中是由向脑的血液供应受到干扰而引起的脑功能丧失。缺血由血管因血栓形成或动脉栓塞而堵塞或者由大脑灌注不足引起。因此，受影响的脑区域不能正常发挥功能，这可导致不能够移动身体一侧的一个或更多个肢体、无法理解或表达言语或者视野一侧的视力受损。

在一些情况下，预防和/或治疗可涉及单独地或者与一种或更多种第二药剂一起使用a-型外排体。在存在或不存在外源性氧施用的情况下，还可对对象进行机械干预，例如通气。

对于新生儿并且特别是低胎龄新生儿，本公开内容考虑在出生4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内施用a-型外排体。在一些紧要情况下，在出生1小时内施用a-型外排体。

本公开内容还考虑甚至在不存在指示本文中所述的疾病或病症的症状的情况下施用a-型外排体。

本公开内容还考虑重复施用a-型外排体，包括两次、三次、四次、五次或更多次地施用a-型外排体。在一些情况下，a-型外排体可连续施用。基于所治疗病症的严重程度，重复施用或连续施用可发生在数小时(例如1至2、1至3、1至6、1至12、1至18或1至24小时)、数天(例如，1至2天、1至3天、1至4天、1至5天、1至6天或1至7天)或数周(例如，1至2周、1至3周或1至4周)的时间内。如果重复但不连续地施用，施用之间的时间可以是数小时(例如，4小时、6小时或12小时)、数天(例如，1天、2天、3天、4天、5天或6天)或数周(例如，1周、2周、3周或4周)。施用之间的时间可以相同或者其可不同。作为一个实例，如果疾病的症状显示正在恶化，则可更频繁地施用a-型外排体，然后一旦症状得以稳定或者减轻，则可较不频繁地施用a-型外排体。

在一些紧要情况下，在出生24小时内施用a-型外排体至少一次，然后在出生1周内再施用a-型外排体至少一次。甚至更优选地，在出生1小时内施用a-型外排体至少一次，然后在出生3至4天内再施用a-型外排体至少一次。

在一些情况下，可重复地静脉内施用低剂量的a-型外排体。因此，本公开内容考虑重复施用低剂量形式的a-型外排体以及单次施用高剂量形式的a-型外排体。低剂量形式的范围可以是但不限于1至50微克/千克，而高剂量形式的范围可以是但不限于51至1000微克/千克。应理解，基于疾病的严重程度、对象的健康状况和施用途径等，低剂量或高剂量a-型外排体的单次或重复施用也在本公开内容的考虑之内。

施用、药物组合物、有效量

a-型外排体可以以可药用制剂(或可药用组合物)使用(例如，施用)(通常当与可药用载体组合时)。这样的制剂可常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体并且可任选地包含另一些(例如，第二)治疗剂。

可药用载体是参与运送或运输预防活性剂或治疗活性剂的可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。就与制剂中的其他成分相容并且对对象无害而言，每种载体必须是“可接受的”。可充当可药用载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等张盐水(isotonic saline)；林格液(Ringer’s solution)；乙醇；磷酸缓冲溶液；以及用于药物制剂中的其他无毒的相容性物质。

第二治疗剂。可将外排体与一种或更多种第二治疗剂一起施用。本文中使用的治疗剂是指可用于预防、治疗和/或控制肺病(例如本文中所述的那些)的任何药剂。这些包括但不限于表面活性剂、吸入性一氧化氮、二甲磺酸阿米三嗪、免疫调节剂和抗氧化剂。免疫调节剂的实例包括类固醇和皮质类固醇，例如但不限于甲泼尼龙。抗氧化剂的实例包括但不限于超氧化物歧化酶。

用于治疗或控制某些肺病和血管病(包括但不限于肺动脉高压)的某些第二治疗剂包括氧；抗凝剂，例如华法令(香豆定)；利尿剂，例如呋塞米

表面活性剂。可将a-型外排体与肺表面活性剂一起施用。肺表面活性剂是可用于使肺气道保持敞开(例如，通过防止肺泡壁彼此黏附)的脂蛋白混合物。肺表面活性剂可包含：磷脂，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)；胆固醇；和蛋白质，例如SP-A、B、C和D。肺表面活性剂可从天然来源(例如牛或猪的肺组织)获得。实例包括Alveofact

有效量。本公开内容的制剂以有效量施用。有效量是单独刺激期望结果的药剂量。绝对量将取决于多种因素，包括所选择的用于施用的材料、施用是否以单剂量或多剂量进行以及个体患者的参数，包括年龄、身体状况、身材(size)、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且仅用常规实验就可解决。

施用途径。a-型外排体可通过实现递送至肺或其他组织的任何途径来施用。合适的有全身性施用途径，例如静脉内推注或连续输液。更直接的途径(例如鼻内施用、气管内施用(例如，通过插管术)和吸入(例如，通过气溶胶(aerosol)经由嘴或鼻))也在本公开内容的考虑之内，并且在一些情况下可能更合适，特别是在必需迅速起效时。本文中使用的气溶胶是作为小颗粒分散在气体中的液体的混悬物(suspension)，并且其包括含有这样的颗粒的细雾(fine mist)或喷雾(spray)。本文中使用的气溶胶化(aerosolization)是通过将液体混悬物转变成小颗粒或液滴来产生气溶胶的过程。这可使用气溶胶递送系统(例如加压包装或喷雾器)来进行。喷雾器包括喷气式喷雾器(即，气动式喷雾器)、超声喷雾器和振动筛喷雾器，例如通过使用合适的抛射剂，例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体。除喷雾器外，用于经肺递送的其他装置包括但不限于计量剂量吸入器(metered dose inhaler，MDI)和干粉吸入器(dry powder inhaler，DPI)。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(cartridge)(例如，明胶胶囊或药筒)可配制成包含冻干的外排体和合适的散剂基质，例如乳糖或淀粉。

外排体当期望将其全身递送时可配制成用于通过注射(包括例如通过推注或连续输液)来肠胃外施用。注射用制剂可以以呈现为有或没有添加防腐剂的单位剂量形式，例如安瓿或多剂量容器。

所述组合物可采用例如在油性或水性载剂中的水溶性混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射用混悬剂可包含提高混悬剂的黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，混悬剂还可包含合适的稳定剂或提高溶解度的物质。或者，外排体可以是用于在使用之前与合适的载剂(例如，无菌的无热原水)重构的冻干或者其他粉末或固体形式。

应理解，根据本公开内容向所治疗对象施用的其他药剂可通过任何合适的途径施用，所述途径包括经口施用、鼻内施用、气管内施用、吸入、静脉内施用等。本领域普通技术人员将知晓用于这样的第二药剂的常规施用途径。

药盒

本公开内容还涵盖经包装且贴有标签的药物产品。这种制品(article ofmanufacture)或药盒(kit)包含在合适器皿或容器(例如玻璃小瓶或塑料安瓿或气密地密封的其他容器)中的合适单位剂量形式。单位剂量形式应适用于经肺递送，例如通过气溶胶。优选地，所述制品或药盒还包含关于如何使用(包括如何施用)药物产品的说明书。所述说明书还可包含向医学从业者、技术人员或对象建议如何适宜地预防或治疗所讨论疾病或病症的信息材料。换言之，所述制品包含指示或建议用于使用的给药方案(包括但不限于实际剂量、监测程序以及其他监测信息)的说明书。

对于任何药物产品，包装材料和容器均被设计成在储存和运输期间保护产品的稳定性。

所述药盒可包含在无菌水性混悬剂中的外排体，所述无菌水性混悬剂可直接使用或者可用生理盐水稀释以用于静脉内注射或用于喷雾器、或者用表面活性剂稀释或与表面活性剂组合以用于气管内施用。因此，所述药盒还可包含稀释溶液或稀释剂，例如盐水或表面活性剂。因此，所述药盒还可包含经肺递送装置，例如喷雾器或一次性组件(disposablecomponent)，例如嘴形件(mouthpiece)、鼻形件(nosepiece)或面罩(mask)。

实施例

从人脐带脐带胶质分离人MSC。来自于人脐带的脐带胶质的MSC(hUC-MSC)根据公开的方法(Mitchell,K.E.等,2003,Stem Cells21:50-60；和Penolazzi,L.等,2011,J CellPhysiol)并稍作修改来分离。将脐带用冰冷的无菌PBS清洗两次，纵向切开并移除动脉和静脉。将软凝胶组织刮出，精细地切碎(2至3mm

条件培养基的制备。为了排除来自血清源性微囊泡的污染，将用于增殖细胞培养物并收集条件培养基的血清通过在100,000x g下超速离心18小时来使其澄清。将MSC在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS,Hyclone)、10％(v/v)马血清(Hyclone)和5mM L-谷氨酰胺(Gibco)的α-MEM培养基中进行培养。在70％汇合时，将培养物用PBS清洗两次并与补充有2mM L-谷氨酰胺的无血清培养基在标准培养条件下孵育24小时。经过24至48小时或者经过3至4天的时间，从人MSC的几乎汇合培养物收集条件培养基(在微粒消耗的FBS培养物中)，并通过差速离心来除去细胞和碎片：400x g下5分钟，2,000x g下10分钟和13,000x g下30分钟。随后，将澄清的条件培养基通过0.2μm过滤器单元过滤并使用切向流过滤系统采用100kD或300kD或500kD的截留值浓缩至少10倍。通过Bradford测定(Bio-Rad)来确定条件培养基中的蛋白质水平。

外排体的分离。MSC外排体通过以100kxg离心3.5小时在10％至60％分步梯度的碘克沙醇上显带来从浓缩的条件培养基分离。通过差速离心，有时接着是30％蔗糖垫或蔗糖速度梯度来从条件培养基进一步分离外排体。分离的外排体制备物的颗粒数通过Nanosight来确定。

外排体的Western印迹。将外排体制备物在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移到0.45μm PVDF膜(Millipore)上。使用山羊多克隆抗CD63(1:1,000；Santa Cruz)抗体、多克隆兔抗CD81(1:1,000,Santa Cruz)和单克隆抗Dicer(1:1,000,Abcam)。还使用针对ALIX、FLOT-1、TSG101、TGFβR2、SMAD、CD105、CD9、CD81、CAV1、EFGR和AKT的一抗来鉴定外排体亚群。以1:20,000的稀释度使用过氧化物酶缀合的抗兔二抗(Santa Cruz)通过增强化学发光试剂(Pierce)或Lumi-LightPLUS(Roche)来可视化免疫反应性条带。使用NIH的ImageJ程序在适当的背景减去之后通过光密度分析(densitometric analysis)来进行量化。

微RNA的量化。总外排体RNA通过Chomczynski和Sacchi(1987Anal Biochem 162:156-159)的方法提取，并且使用750ng作为逆转录酶与每种靶微RNA的特异性引物的模板(TaqMan逆转录试剂盒,Applied Biosystems,Foster City,CA)。每个逆转录反应还包括用作内部对照的小核RNA(small nuclear)sno202的引物。对每个20μl qPCR反应使用37.5ngcDNA，所述反应在指定微RNA和内部对照特异性的探针(TaqMan微RNA测定,AppliedBiosystems)存在下具有无UNG的TaqMan通用主混合物II(universal master mix II)(Applied Biosystems)。扩增在StepOne Plus平台(Applied Biosystems)上如下进行：50℃下2分钟；95℃下10分钟；接着是40个循环：95℃下15秒，60℃下1分钟。

动物和缺氧暴露。将8周龄的FVB雄性小鼠从查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)(Wilmington,MA)获得或者饲养于波士顿儿童医院(Children’s HospitalBoston)的动物设施中。使每组的小鼠在Plexiglas室(OxyCycler,BioSpherix,Redfield,NY)中暴露于8.5％氧，持续不同的实验时间。调整通气以除去CO

两种不同的来自于间充质干细胞的外排体群的鉴定和表征

累加的证据支持MSC在肺内稳态和修复中的关键作用。先前已报道，MSC外排体(MEX)介导间充质干细胞对缺氧诱导的肺动脉高压的细胞保护作用。在鼠PH模型中，静脉内小鼠MEX递送抑制巨噬细胞的缺氧性肺流入以及促炎介质和促增殖介质的诱导，并最终抑制血管重构和缺氧性肺动脉高压。

该研究的目的是为了研究从人脐带间质分离的MSC是否分泌展现出类似保护特性的微囊泡，以及表征治疗性MSC外排体的生化特性并研究其对由起始肺血管重构之信号触发的血管细胞表型变化的作用。

MEX的分离

从由人间充质干细胞(MSC)条件化的组织培养基分离外排体(MEX)。在此，人MSC的来源是脐带胶质(WJ)，但是其他可能的来源是脐带血、骨髓、脂肪或其他组织。将MSC分离，免疫选择，培养并评估其分化潜能。用于人WJ-MSC的阴性选择包括CD34和CD45。MSC对CD90、CD73、CD105和CD44呈阳性。

用MEX处理小鼠

通过尾静脉注射向动物递送一个剂量的MEX，并使接受者小鼠暴露于常压性缺氧(8％至10％O

结果

通过I.V.注射MEX制备物处理小鼠下调与血管重构和肺动脉高压相关的信号传导的缺氧活化(图1A)，并且改善缺氧诱导的肺炎症(图1B)。图1A显示，WJ-MEX处理降低AKT及其下游靶标mTOR的缺氧诱导的磷酸化。如图1B中所示，DNA结合/分化蛋白抑制剂ID1(直接的SMAD靶向基因和BMPR2的下游信号)的肺蛋白质水平因缺氧而受到抑制，但在MEX下提高。α微管蛋白充当归一化对照。

通过密度和速度超速离心考察超过一个MEX亚型群的存在。通过密度和速度超速离心分析MEX制备物揭示，由MSC产生的细胞外微囊泡群基于分子标志物由两种类型构成(图2和图3)。将这两种类型称为a-MEX和f-MEX。在级分12至14(a-MEX)中优先地富集有外排体生物发生标志物，例如ALIX和TSG101，而在级分5至8(f-MEX)中富集有四跨膜蛋白CD9和CD81以及脂筏标志物，例如flotilin 1(FLOT1)和陷窝蛋白1(CAV1)。表1示出了a-MEX和f-MEX的特异性标志物：

表1

通过EM，a-MEX或f-MEX的制备物显示出不同的形态(图4)。f-MEX的直径为30至200nm并且展现出外排体的典型深杯形形态，而a-MEX为30至100nm，具有半透明且球形的形态。

为了由从生长于单层培养物中的MSC获得的大批(bulk)外排体制备物制备高度富集有a-MEX或f-MEX的外排体亚群，将所述大批外排体制备物调节至45％蔗糖，铺层在60％蔗糖垫上并用分布梯度的35％至5％蔗糖覆盖层。将制备物以180kxg离心20小时以分离a-MEX和f-MEX亚群。将包含a-MEX或f-MEX的梯度级分通过超速离心(100kxg，3小时)浓缩并重悬于PBS中或者通过切向流过滤。

将分离的a-MEX或f-MEX施用于暴露于缺氧的小鼠揭示，仅a-MEX类型存在MEX残余物的免疫抑制特性(图5)。用a-MEX进行处理引起缺氧诱导的炎性标志物(包括CCL2、IL6和ADM)的mRNA水平显著降低。

在3-D培养物中提高a-MEX的产生

MSC和某些其他细胞类型可形成称为球状体的细胞聚集体。图6示出了描绘在2-D和3D培养条件下的MSC球状体形成的显微术图像。与二维单层培养物相比，认为球状体形成代表更具生理性的条件。对于MSC，认为球状体状态代表更加未分化的干细胞样状态。增强形成球状体的倾向的三维培养系统是可商购获得的(特定膜)。MSC在高密度下可自发地从单层培养物长出形成球状体，并且如果混悬于培养基中的话可被诱导形成球状体(悬滴技术)。

悬滴技术是用于很多细胞类型的公知培养方法。简言之，将生长于单层培养物中的MSC用胰蛋白酶处理以产生单细胞悬液。将含有500,000个细胞的30μL该悬液施加至培养皿(petri dish)盖的内表面并将盖放置在包含少量PBS的皿上以保持湿度。将具有悬滴的皿放置到组织培养箱中1至2天，在此时间期间MSC聚集成球状体。典型的球状体制备物由分成30滴的1500万个细胞组成。

数据表明，与培养于2D培养物(单层)中的同一代的相同MSC克隆相比，培养于3D培养物(球状体)中的MSC产生显著更多的a-MEX(图7)。a-MEX之产生的提高通过样品对SMAD2/3和ALIX抗体具有强免疫反应性但对FLOT1无强免疫反应性得到证明，如图7中所示。

还发现，a-MEX的产生在不同MSC克隆之间可变，并且产生细胞可通过3D培养和/或生长因子补充来富集。表征多种独立来源的MSC克隆的相对a-MEX产生(确定在2D培养期间其条件培养基中FLOT1相对于ALIX(或SMAD)标志物的比例并观察实质性变化)(图8A)。某些克隆(例如克隆D)不产生显著量的SMAD(a-MEX标志物，与FLOT1(f-MEX标志物)相比)。克隆D的这种特性与使用悬滴技术的效率极低的球状体形成相关(图8B)。

显著地，当将由克隆D细胞形成的极少球状体以单层扩增时，所得的2D培养物以高比例产生a-MEX并且以高效率形成球状体。这些观察结果表明，通过球状体形成进行选择可用作富集低效MSC克隆以获得保留其干性(stemness)并且以高比例产生a-MEX的细胞亚群的工具。朝着这一目标，观察到控制生长因子(例如TGFβ1)的浓度可加速球状体形成并且增强a-MEX的产生(图9)。在10ng/ml的浓度下实现TGFβ1刺激。

a-MEX和f-MEX携带特定生长因子的不同信号转导模块

a-MEX具有TGF受体和下游转录因子SMAD(图2和图3)。向分离的a-MEX制备物添加TGFβ1揭示，该信号传导模块是功能性的，因为a-MEX内的SMAD模块在体外被高效且特异性地磷酸化(图10A)。这一特性是a-MEX特异性的(图10B)。f-MEX包含EGF受体并且可在体外磷酸化内源AKT(未示出)。

数据表明，MSC产生两种不同类型的外排体：a-MEX类型携带TGF/BMP生长因子超家族的功能性信号传导模块，而f-MEX携带相应的FGF/PDGF超家族模块。这些外排体将模块转移至靶细胞并增强相应的信号传导途径，并且其相对分泌比例取决于产生它们的MSC群的编程。

此外，发现a-MEX而非f-MEX能够抑制人肺细胞中TGFβ诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，如图11中所示。用TGFβ刺激经3天血清饥饿(0.1％FBS)之后的人肺成纤维细胞以经历肌成纤维细胞分化，肌成纤维细胞分化由α-平滑肌肌动蛋白(SMA)表达的提高来标志。图11A显示，用hMEX(2μg/ml)进行预处理消除TGFβ对α-SMA蛋白水平的作用。为了进一步检测该发现，用TGFβ刺激经24小时血清饥饿后的人肺成纤维细胞以诱导肌成纤维细胞标志物PAI1。用a-MEX进行处理阻止PAI1上调，这是用f-MEX处理未观察到效果(图11B)。还发现，a-MEX处理在体外下调人肺成纤维细胞中的基线MCP-1和IL1βmRNA水平(图11C)。

等同方案

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