用于通过操纵叶片质量基因生产具有改变的生物碱水平和期望的叶片质量的烟草植物和产品的组合物和方法

本申请要求于2019年10月10日提交的美国临时申请No.62/913,308的优先权，其通过引用以其整体并入本文。包含在名为“P34750WO00_SL.txT”的文件中的序列表是65,190字节(在MS-

技术领域

本公开包括具有改变的总生物碱和烟碱水平以及商业上可接受的叶等级的烟草植物，其通过育种或转基因方法的开发，以及从这些烟草植物生产烟草产品。

背景技术

烟碱是在烟叶中积聚的主要生物碱。烟碱和其它少量生物碱(例如，降烟碱、假木贼碱和安那他品)也是烟草特有亚硝胺(TSNA)的前体。需要开发具有较低烟碱水平的烟草栽培品种。

在商业烟草栽培品种中，烟碱占总生物碱库的90-95％或总叶片干重的2-5％。烟碱在根部合成，并通过木质部转移到植物的地上部分，在那里它在叶片中积聚并响应于昆虫食草性通过毛状体而渗出。烟碱生物合成受到遗传因素、植物发育、生物和非生物胁迫、植物激素信号和农艺管理实践(例如打顶和分株)的影响。烟碱生物合成的遗传调控与两个独立的基因座Nic1和Nic2相关，它们对烟碱水平具有协同作用，但Nic1的作用比Nic2的作用强约2.4倍。两个基因座还影响与烟碱生物合成途径不相关的许多其它基因的表达。转录分析显示Nic2基因座是编码至少七个乙烯响应转录因子(ERF)的基因簇。

一个或两个基因座的纯合突变可用于制备生物碱水平降低的近等基因Burley 21品系，即具有基因型nic2的高中级(HI)品种，具有基因型nic1的低中级(LI)品种和具有基因型nic1 nic2的低生物碱(LA)品种。LA Burley 21植物仅包含正常生物碱(NA)野生型品种中总生物碱水平的约5.7％。在LA植物中，nic1和nic2突变的协同作用还导致不利的叶表型，其特征是产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高以及熟化后的最终产品质量差。

需要鉴定在LA品种的烟草植物中恢复不利的叶表型的基因，并开发含有改变的烟碱水平(例如烟碱降低)，同时保持(如果不能使品质更优)烟叶片质量的烟草植物和产品。

发明内容

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其在叶片质量基因(LQG)或靶向LQG基因的转基因中包含突变。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含上调编码与选自由SEQID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少90％同一性或相似性的核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰。在另一个方面中，这样的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自由SEQID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少90％的同一性或相似性。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含上调编码与选自由SEQID NO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽的基因的表达或活性的遗传修饰。在另一个方面中，这样的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含下调编码与选自由SEQID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少90％同一性或相似性的核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰。在另一个方面中，这样的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其在与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少90％同一性或相似性的多核苷酸中包含非天然突变。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至mRNA，所述mRNA与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少90％同一性或相似性，其中所述非编码RNA分子抑制mRNA的水平或翻译。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含下调编码与选自由SEQID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽的基因的表达或活性的遗传修饰。在另一个方面中，这样的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含在多核苷酸中的非天然突变，所述多核苷酸具有编码与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽的核酸序列。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至编码多肽的RNA，所述多肽与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性，其中所述非编码RNA分子抑制所述多肽的表达。

在一个方面中，本公开提供了本文所述的烟草植物的种群，来自本文所述的烟草植物的熟化烟草材料，以及由熟化烟草材料制成的再造烟草、烟草混合物和烟草产品。

在一个方面中，本公开提供了用于改善生物碱降低的烟草植物中的叶片质量的方法，所述方法包括：(a)种植生物碱降低的烟草植物；(b)上调基因的表达或活性，所述基因编码(i)与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的序列具有至少90％同一性或相似性的核酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的序列具有至少90％同一性或相似性的多肽序列；和(b)从所述烟草植物收获叶片或种子。

在一个方面中，本公开提供了用于改善生物碱降低的烟草植物中的叶片质量的方法，所述方法包括：(a)种植生物碱降低的烟草植物；(b)下调基因的表达或活性，所述基因编码(i)与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的序列具有至少90％同一性或相似性的核酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的序列具有至少90％同一性或相似性的多肽序列；和(b)从所述烟草植物收获叶片或种子。

附图说明

图1A描述了各种白肋烟品种的烟碱水平和叶等级指数。图1B描述了各种烤烟品种的烟碱水平和叶等级指数。图1C描述了各种白肋烟品种的叶片质量。图1D描述了各种烤烟品种的叶片质量。

图2描述了携带nic1和nic2突变的低生物碱烟草品系的一些叶表型。

图3描绘了叶转录组和代谢物组采样矩阵。共计收集231个RNA-seq样品(收集自11个品种、7个阶段和每个时间点3个生物复制品)。同时，获得132个代谢物组样品(收集自11个品种、4个阶段和每个时间点3个生物复制品)。

图4描绘了叶片转录组和代谢物组数据分析流程图。

图5A描述了低生物碱白肋烟品种中差异表达的基因的功能分析。共计鉴定了218个基因，其属于35个功能类别。图5B描述了低生物碱烤烟品种中差异表达的基因的功能分析。共计鉴定了200个基因，其属于31个功能类别。图5C描绘了基于来自白肋烟和烤烟的组合数据的所有差异表达的基因的功能分析。418个基因属于38个功能类别。图5D描绘了在白肋烟数据系列和烤烟数据系列中均出现差别表达的73个基因。它们属于28种功能类别。

图6描绘了低生物碱品系中WRKY转录因子45的表达降低，如RNA-seq数据和RT-PCR验证所示。

图7描述了低生物碱品系中纤维素合酶的表达降低，如RNA-seq数据和RT-PCR验证所示。

SEQ ID No:1-17示出了用于改善叶片质量的示例性烟草靶基因的cDNA序列。

SEQ ID No:18-34示出了由用于改善叶片质量的示例性烟草靶基因编码的氨基酸序列。

各种序列包括核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如A、T、G、C，或一个或多个核苷酸的缺失或插入。在一些情况中会显示一串“N”。“N”的数目不一定与该位置上未确定的核苷酸的实际数目相关。实际的核苷酸序列可以长于或短于所示的“N”片段。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或多个氨基酸的缺失或插入。同样，“X”的数目不一定与该位置上未确定的氨基酸的实际数目相关。实际的氨基酸序列可以长于或短于所示的“X”片段。尽管在描述序列表中的任何SEQ ID时使用A、T、G、C(与A、U、G、C相比)，但取决于SEQ ID被提及的上下文，该SEQ ID也可以指RNA序列。

具体实施方案

除非另有定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本领域技术人员将认识到在本公开的实践中可以使用许多方法。实际上，本公开不限于所描述的方法和材料。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本公开的方面，且反之亦然。如果在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异，则本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。使用的其他技术术语在使用其的领域中具有其普通含义，如各种特定领域的词典所示，例如，“The American

本文引用的任何参考文献，包括，例如，所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用整体并入本文。

当呈现一组备选方案时，具体设想构成该备选方案分组成员的任何和所有组合。例如，如果从由A、B、C和D组成的组中选择一个项目，则发明人具体地单独设想每个备选方案(例如，单独的A、单独的B等)，以及诸如A、B和D；A和C；B和C等的组合。术语“和/或”在两个或多个项目列表中使用时，是指所列项目中的任何一个本身或者与任何一个或多个其他所列项目的组合。例如，“A和/或B”的表述旨在表示A和B中的一者或两者——即，单独的A、单独的B或者A和B的组合。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或者A、B和C的组合。

当在此提供一个数字范围时，将该范围理解为包括该范围的边缘以及该范围的定义边缘之间的任何数字。例如，“1至10之间”包括1至10之间的任何数字，以及数字1和数字10。

如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一个化合物”或“至少一个化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。

术语“约”在本文中用于表示大约、粗略地、左右或在其范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到所给的数值之上和之下来修饰该范围，并且应理解为意指加或减10％。例如，“约100”将包括90至110。

为了避免任何疑问，如本文所用，术语或短语诸如“约”、“至少”、“至少约”、“至多”、“小于”、“大于”、“在…内”等，当用于一系列百分比数字的列表时，这些术语或短语被认为可以修改该系列或列表中的每个百分比数字，而不管副词、介词或其它修饰短语是否在每个成员之前再现。

如本文所用，“叶片质量基因”(LQG)是指在烟草叶片质量中发挥作用，特别是在低生物碱品种中具有调节叶片质量的作用的基因。示例性LQG可以在表9和10中找到。

如本文所用，烟草的“低生物碱品种”(也称为“LA品种”)是指包含一种或多种遗传修饰的烟草品种，所述遗传修饰使除了所述一种或多种遗传修饰之外具有基本上类似遗传背景的对照烟草品种中的总生物碱(通过干重测量)降低至小于总生物碱水平的25％的水平。作为非限制性示例，KY171可用作低生物碱品种LA KY171的对照。不受限制地，低生物碱烟草品种包括LA Burley 21、LAFC53、LN B&W和LN KY171。类似地，烟草的“低烟碱品种”(也称为“LN品种”)是指包含一种或多种遗传修饰的烟草品种，所述遗传修饰将烟碱(通过干重测量)降低至小于在除了所述一种或多种遗传修饰之外具有基本上类似遗传背景的对照烟草品种中的烟碱水平的25％的水平。

如本文所用，“遗传修饰”是指植物或植物基因组的遗传组成中的改变。可以通过包括但不限于诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的方法引入遗传修饰。

如本文所用，“LQG遗传修饰”是指涉及LQG基因的遗传修饰，其中包括在LQG基因中的突变(例如，非天然突变)(例如，如在“LQG突变”中)或靶向LQG基因的转基因(例如，如在“LQG转基因”中)。如本文所用，“靶向”可以是直接上调或直接下调基因的表达或活性。如本文所用，在影响基因表达或活性的转基因的背景下，“直接”是指通过基因(例如启动子区域)或其中编码的产物(例如mRNA分子)与由转基因编码的产物(例如小的非编码RNA分子或蛋白)之间的物理接触或化学相互作用对基因施加的影响。

如本文所用，“突变”是指引入基因中以改变由基因的参考序列编码的产物的表达或活性的可遗传的基因修饰。此类修饰可以在基因的任何序列区域中，例如，在启动子、5’UTR、外显子、内含子、3’UTR或终止子区域中。在一个方面中，突变降低、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一个方面中，突变增加、提升、加强或增强基因产物的表达或活性。在一个方面中，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。应当理解，当鉴定突变时，参考序列应当来自相同的烟草品种或背景。例如，如果包含突变的修饰的烟草植物来自TN90品种，则相应的参考序列应当是内源性TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，K326)的同源序列。在一个方面中，突变是“非天然的”或“非天然存在的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”突变是指不是且不对应于没有人为干预产生的自发突变的突变。人类干预的非限制性示例包括诱变(例如，化学诱变、电离辐射诱变)和靶向基因修饰(例如，基于CRISPR方法、基于TALEN方法、基于锌指方法)。非天然突变和非天然发生的突变不包括自然产生的自发突变(例如，通过植物种系中的异常DNA复制)。

如本文所用，烟草植物可以来自烟草(Nicotiana)属的任何植物，其包括但不限于普通烟草(Nicotiana tabacum)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)PI555478；毕基劳式烟草(Nicotiana bigelovii)PI555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；高烟草(Nicotiana excelsior)PI224063；粘烟草(Nicotiana glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)PI241012；哥西氏烟草(Nicotiana gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana hesperis)PI271991；奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；Nicotiana maritima PI555535；特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)PI555536；Nicotiana nudicaulis PI555540；圆锥烟草(Nicotiana paniculata)PI 555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana repanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；Nicotiana suaveolens PI 230960；林烟草(Nicotianasylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI266379；绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)PI 555572。在一个方面中，本文所述的烟草植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)植物。

在一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含上调或下调LQG基因的表达或活性的遗传修饰。如本文所用，通过比较具有遗传修饰的植物与不具有遗传修饰的相应的对照植物来测定遗传修饰对基因的上调或下调。

LQG上调

在一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含上调编码核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰，所述核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本文所述的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照低生物碱植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照低生物碱植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。在一个方面中，较高的USDA等级指数值比来自对照植物的可比叶的USDA等级指数值高至少200％、150％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％或5％。

在一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含上调编码多肽的基因的的表达或活性的遗传修饰，所述多肽与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽与选自由SEQ IDNO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本文所述的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照低生物碱植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照低生物碱植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。在一个方面中，较高的USDA等级指数值比来自对照植物的可比叶的USDA等级指数值高至少200％、150％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％或5％。

LQG下调

在一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含下调编码核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰，所述核酸序列与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本文所述的烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照低生物碱植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照低生物碱植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。在一个方面中，较高的USDA等级指数值比来自对照植物的可比叶的USDA等级指数值高至少200％、150％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％或5％。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其在与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多核苷酸中包含非天然突变。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至mRNA，所述mRNA与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性，其中所述非编码RNA分子抑制mRNA的水平或翻译。

在另一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含下调编码多肽的基因的表达或活性的遗传修饰，所述多肽与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，此类烟草植物处于低生物碱品种背景中，当熟化时，烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照低生物碱植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照低生物碱植物与烟草植物具有除遗传修饰以外基本上相同的遗传背景。在一个方面中，较高的USDA等级指数值比来自对照植物的可比叶的USDA等级指数值高至少200％、150％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％或5％。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其在多核苷酸中包含非天然突变，所述多核苷酸具有编码多肽的核酸序列，所述多肽与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性。

在另一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至编码多肽的RNA，所述多肽与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性，其中所述非编码RNA分子抑制多肽的表达。

低生物碱烟草背景

在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物可进一步包含赋予降低的烟碱水平的突变或转基因。在一个方面中，烟草植物来自低生物碱品种。在一个方面中，本公开的烟草植物包含nic1突变、nic2突变或两者。在一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱水平为对照植物的烟碱水平的低于1％、低于2％、低于5％、低于8％、低于10％、低于12％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％或低于80％，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱或总生物碱水平为对照植物的烟碱或总生物碱水平的低于1％、低于2％、低于5％、低于8％、低于10％、低于12％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％或低于80％。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含选自以下的总生物碱水平：对照植物的烟碱水平的小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含选自以下的烟碱或总生物碱水平：对照植物的烟碱或总生物碱水平的小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。

在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含直接抑制编码选自以下的蛋白的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十一个或更多个、十二个或更多个、十三个或更多个、十四个或更多个、十五个或更多个、十六个或更多个、十七个或更多个、十八个或更多个、十九个或更多个、二十个或更多个或全部二十一个基因或基因座的表达或活性的转基因或突变：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)、S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1_ERF、Nic2_ERF、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白。参见Dewey和Xie,Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in Nicotiana tabacum,Phytochemistry 94(2013)10–27。

在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含Nic2基因座的ERF基因(Nic2_ERF)中的突变。在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含选自ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或全部十个基因中的一个或多个突变。参见Shoji等，PlantCell,(10):3390-409(2010)；和Kajikawa等，Plant physiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，烟草植物还包含ERF189、ERF115或两者中的一个或多个突变。在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含一种或多种转基因，所述转基因靶向并抑制编码选自ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或全部十个蛋白的基因。

在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含Nic1基因座(Nic1_ERF)(或于2019年1月11日提交的PCT/US2019/013345中的Nic1b基因座，公开号为WO/2019/140297)的ERF基因中的突变。还参见WO/2018/237107。在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草还包含在选自ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、或七个或更多个基因中的一个或多个突变。参见WO/2019/140297和Kajikawa等，Plant physiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物在选自ERFnew、ERF199、ERF19、ERF29、ERF210和ERF91L2的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或全部六个基因中的一个或多个突变。在一个方面中，包含LQG突变或转基因的烟草植物还包含一种或多种转基因，所述转基因靶向并抑制编码选自ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、或七个或更多个蛋白的基因。

在一个方面中，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，所述第一基因组修饰包含在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)和S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1_ERF、Nic2_ERF、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白，并且还包含靶向一个或多个LQG基因的第二遗传修饰。在一个方面中，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，所述第一基因组修饰包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因或基因座的转基因：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)、S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1_ERF、Nic2_ERF、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白，并且还包含靶向一个或多个LQG基因的第二遗传修饰。

叶片质量/分级

在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其包含在具有商业上可接受的叶片质量的低生物碱品种背景中中的LQG遗传修饰。本公开还提供了具有改变的烟碱水平而对其他烟草性状(例如叶等级指数值)没有负面影响的LQG突变或转基因烟草植物。在一个方面中，低烟碱或无烟碱的LQG突变或转基因烟草品种提供了商业上可接受等级的熟化烟草。

基于以下因素评价烟草等级，所述因素包括但不限于叶茎位置、叶尺寸、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及光泽有关)、吸湿性(烟叶吸收并保持环境水分的能力)和绿色细微差别或落叶病(cast)。例如，可以使用美国农业部农业营销服务部公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来确定叶等级。参见例如Official Standard Grades for Burley Tobacco(U.S.Type 31and Foreign Type 93),1990年11月5日生效(55F.R.40645)；Official Standard Grades for Flue-CuredTobacco(U.S.Types 11,12,13,14and Foreign Type 92),1989年3月27日生效(54F.R.7925)；Official Standard Grades for PennsylvaniSeedleaf Tobacco(U.S.Type 41),1965年1月8日生效(29F.R.16854)；Official Standard Grades for OhioCigar-Leaf Tobacco(U.S.Types 42,43,and 44),1963年12月8日生效(28F.R.11719and28F.R.11926)；Official Standard Grades for Wisconsin Cigar-Binder Tobacco(U.S.Types 54and 55),1969年11月20日生效(34F.R.17061)；Official Standard Gradesfor Wisconsin Cigar-Binder Tobacco(U.S.Types 54and 55),1969年11月20日生效(34F.R.17061)；Official Standard Grades for Georgiand FloridShade-Grown Cigar-Wrapper Tobacco(U.S.Type 62),1971年4月生效。USDA等级指数值可根据行业认可的等级指数确定。参见例如Bowman等,Tobacco Science,32:39-40(1988)；Legacy TobaccoDocument Library(Bates Document#523267826-523267833,July 1,1988,Memorandum onthe Proposed Burley Tobacco Grade Index)；和Miller等,1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有上述参考文献通过引用以其全部并入)。除非另有说明，USDA等级指数是所接收的联邦等级的0-100数值表示，并且是所有茎位置的加权平均值。较高的等级指数指示较高的质量。可替代地，可以通过高光谱成像确定叶等级。参见，例如WO 2011/027315(于2011年3月10日公布，并通过引用以其整体并入)。

在一个方面中，当熟化时，本文所述的LQG突变或转基因烟草植物能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面中，当熟化时，烟草植物能够产生具有USDA等级指数值与在相似条件下生长和熟化的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为在相似条件下生长的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％至130％、70％至130％、75％至130％、80％至130％、85％至130％、90％至130％、95％至130％、100％至130％、105％至130％、110％至130％、115％至130％、或120％至130％的叶。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％至125％、75％至120％、80％至115％、85％至110％或90％至100％的叶。

在另一个方面中，当熟化时，本文所述的LQG突变或转基因烟草植物能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面中，当熟化时，烟草植物能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：50-95、55-95、60-95、65-95、70-95、75-95、80-95、85-95、90-95、55-90、60-85、65-80、70-75、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90以及90-95。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％至130％、70％至130％、75％至130％、80％至130％、85％至130％、90％至130％、95％至130％、100％至130％、105％至130％、110％至130％、115％至130％、或120％至130％的叶。在进一步的方面中，当熟化时，烟草植物能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％至125％、75％至120％、80％至115％、85％至110％或90％至100％的叶。

在一个方面中，本公开还提供了LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含选自以下的烟碱或总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％，其中当熟化时，该烟草植物能够产生USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的叶。在另一个方面中，这种LQG突变或转基因烟草植物包含低于2.0％的烟碱水平并且当熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。在进一步的方面中，这种LQG突变或转基因烟草植物包含低于1.0％的烟碱水平并且当熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

在一个方面中，本公开还提供了LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含非转基因突变，其中当在相似的生长条件下生长时，所述非转基因突变将烟草植物的烟碱或总生物碱水平降低至对照植物的烟碱水平的低于1％、低于2％、低于5％、低于8％、低于10％、低于12％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％或低于80％，其中当熟化时，烟草植物能够产生具有与对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，并且其中对照植物与烟草植物具有除非转基因突变之外基本上相同的遗传背景。

LA叶表型改良

LA Burley 21(也称为LA BU21)是低总生物碱烟草品系，其通过几次回交将来自古巴雪茄品种的低生物碱基因引入Burley 21中来生产。与其母本Burley 21的约3.5％(干重)相比，它具有约0.2％的总生物碱(干重)。LA BU21的叶等级远低于商业上可接受的标准。LA BU21还呈现其他不利的叶表型，其特征是产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高以及熟化后的最终制品质量差。LA BU21的叶还呈现例如较高的多胺含量、较高的叶绿素含量和每单位叶面积更多的叶肉细胞等性状。关于LA BU21叶表型的更多特征，参见US 2019/0271000。

在一个方面中，本文所述的LQG突变或转基因能够改善LA BU21叶片质量的一个或多个方面。在一个方面中，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言水平相当的一种或多种多胺的叶。在一个方面中，相当的一种或多种多胺含量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的一种或多种多胺含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的一种或多种多胺含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至5％、5％至10％或10％至20％。

在一个方面中，本公开提供LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶绿素含量的叶。在一个方面中，相当的叶绿素含量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的叶绿素含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的叶绿素含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至5％、5％至10％或10％至20％。

在一个方面中，本公开提供LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶肉细胞数/单位叶面积的叶。在一个方面中，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至5％、5％至10％、或10％至20％。

在一个方面中，本公开提供了LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的表皮细胞大小的叶。在一个方面中，相当的表皮细胞大小是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的表皮细胞大小是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的表皮细胞大小是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的的0.5％至5％、5％至10％、或10％至20％。

在一个方面中，本公开提供LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶产量的叶。在一个方面中，相当的叶产量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的叶产量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的叶产量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至5％、5％至10％或10％至20％。

在一个方面中，本公开提供了LQG突变或转基因烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因，并且展现出相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的昆虫食草敏感性的叶。在一个方面中，相当的昆虫食草敏感性是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面中，相当的昆虫食草敏感性是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％或19％至20％。在另一个方面中，相当的昆虫食草敏感性是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％至5％、5％至10％或10％至20％。

可以通过本领域已知的方法，例如在昆虫饲喂试验中测定昆虫食草敏感性水平。简言之，将水中四分之一英寸的0.7％琼脂层添加到100mm培养皿中并使其固化。从培养皿盖上切下叶盘，将其放在培养皿中，然后轻轻推入琼脂中。叶盘取自4-5叶期的植物。从叶片中取出叶盘只是为了去除主要的中脉。从植物的4个最大叶片中的每个叶片中取出单个叶盘，每个植物产生4个重复。采样了四株植物，总共有16条生物学重复测试线。将第二龄期的单个芽虫(例如实夜蛾属(Heliothis sp.)、实夜蛾属(Helicoverpa sp.))添加到叶片中，并使其在环境温度下进食48小时。48小时后称重芽虫幼虫，并记录最终幼虫的重量。

在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的一个或多个选自以下的性状的第二基因组修饰：总叶片多胺水平、总根多胺水平、总叶片叶绿素水平、叶肉细胞数/叶面积单位和叶片表皮细胞大小，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总叶片多胺水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总根多胺水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总叶片叶绿素水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的叶肉细胞数/叶面积单位的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的叶片表皮细胞大小的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面中，第二基因组修饰位于或靶向LQG基因。

在一个方面中，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因、突变或两者。在一个方面中，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因。在一个方面中，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含突变。在一个方面中，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于转基因。在一个方面中，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于突变。

在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少的总缀合多胺含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。如本文所用，缀合多胺包括但不限于可溶性缀合多胺，例如含有由以下组成的骨架的酚酰胺：与一种或多种苯基丙烷(例如阿魏酸、咖啡酸和香豆酸)缀合的游离多胺(例如腐胺、精胺和/或亚精胺)。缀合多胺还包括但不限于整合入结构聚合物如木质素中的不溶性缀合多胺。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少的总游离多胺(例如腐胺、精胺和亚精胺)含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总缀合形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总缀合形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总游离形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总缀合形式。

在一个方面中，在选自以下的时间测量本文所述的烟草植物的特征或性状：紧接在开花前、打顶、打顶后(WPT)1周、2WPT、3WPT、4WPT、5WPT、6WPT、7WPT、8WPT，以及收获时。在一个方面中，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物能够产生具有与来自对照植物的叶片相当的叶等级的叶片。在一个方面，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物具有与对照植物相当的总叶产量。

化学测定

“生物碱”是在植物中天然存在的复杂的含氮化合物，并且在人和动物中具有药理学作用。“烟碱”是商品化香烟烟草中主要的天然生物碱，占普通烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假氧化烟碱、2,3联吡啶和其他。

在一个方面中，本文提供的LQG突变或转基因烟草植物包含遗传修饰，当在相似生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物提供较低水平的一种或多种选自可替宁、降烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱的生物碱。在一个方面中，较低水平的生物碱或烟碱是指对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的低于1％、低于2％、低于5％、低于8％、低于10％、低于12％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％或低于80％的的生物碱或烟碱水平。在另一个方面中，较低的生物碱或烟碱水平是指对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的约0.5％至1％、1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％、19％至20％、21％至22％、22％至23％、23％至24％、24％至25％、25％至26％、26％至27％、27％至28％、28％至29％或29％至30％。在进一步的方面中，较水平低的生物碱或烟碱是指生物碱或烟碱含量为对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％。

在一个方面中，本文提供的LQG突变或转基因烟草植物包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自以下：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面中，本文提供的烟草植物包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自以下：约0.01％至0.02％、0.02％至0.05％、0.05％至0.75％、0.75％至0.1％、0.1％至0.15％、0.15％至0.2％、0.2％至0.3％、0.3％至0.35％、0.35％至0.4％、0.4％至0.5％、0.5％至0.6％、0.6％至0.7％、0.7％至0.8％、0.8％至0.9％、0.9％至1％、1％至1.1％、1.1％至1.2％、1.2％至1.3％、1.3％至1.4％、1.4％至1.5％、1.5％至1.6％、1.6％至1.7％、1.7％至1.8％、1.8％至1.9％、1.9％至2％、2％至2.1％、2.1％至2.2％、2.2％至2.3％、2.3％至2.4％、2.4％至2.5％、2.5％至2.6％、2.6％至2.7％、2.7％至2.8％、2.8％至2.9％、2.9％至3％、3％至3.1％、3.1％与3.2％、3.2％至3.3％、3.3％至3.4％、3.4％至3.5％、和3.5％至3.6％。在进一步的方面中，本文提供的烟草植物包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自约0.01％至0.1％、0.02％至0.2％、0.03％至0.3％、0.04％至0.4％、0.05％至0.5％、0.75％至1％、0.1％至1.5％、0.15％至2％、0.2％至3％和0.3％至3.5％。

除非另有说明，否则本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱、多胺或烟碱水平(或另一种叶化学或特性表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包括例如单个植物的多个叶的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物群体的平均测量值。除非另有说明，本文所述的烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后2周在收集自打顶后3、4和5号叶的合并叶样品中测量。在另一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后在具有最高烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)的叶中测量。在一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平在打顶后在编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的叶中测量。在另一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后在具有连续叶编号的混合的两个或更多个叶中测量，所述连续叶编号选自由叶编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30组成的组。在另一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。在另一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的混合的两个或更多个叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。在另一个方面中，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的混合的三个或更多个叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。

生物碱含量可以通过本领域已知的方法测定，例如基于气相-液相色谱、高效液相色谱、放射性免疫测定和酶联免疫吸附测定进行定量。例如，烟碱生物碱水平可以通过基于CORESTA推荐方法No.7(1987)的GC-FID方法和ISO标准(ISO TC 126N 394E，也可参见Hibi等人，Plant Physiology 100:826-35(1992))的使用配备有毛细管柱和FID检测器的气相-液相色谱的方法来测量。除非另有说明，本文所述的所有生物碱水平使用符合CORESTA方法62(Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by GasChromatographic Analysis，2005年2月)以及美国疾病控制和预防中心在1999年3月23日在Federal Register第64卷第55期上发表的Protocol for Analysis of Nicotine,TotalMoisture and pH in Smokeless Tobacco Products(并且2009年1月7日在第74卷第4期上修订)中定义的方法来测量。

可替代地，可以使用为分析烟草样品而开发的分段流动比色法来测量烟草总生物碱，该方法由Skalar Instrument Co(West Chester，PA)改编，并由Collins等人，TobaccoScience 13:79-81(1969)描述。简而言之，在分析总生物碱和还原糖之前，可以对烟草的样本进行干燥、研磨和提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取和木炭用于脱色。总生物碱的测定基于：氯化氰与烟碱类生物碱在芳香胺的存在下的反应，形成在460nm下测量的有色复合物。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或烟碱水平基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。

如本文所用，叶子编号基于烟草茎上的叶子位置，叶子编号1是打顶后最老的叶子(在根部)，最高的叶子编号分配给最新的叶子(在尖端)。

用于测定平均测量值(例如生物碱或烟碱水平或叶等级)的烟草植物群或烟草叶集合可以具有任何大小，例如5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循行业认可的标准协议来测定平均测量或等级指数值。

如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养生长成熟或在生殖生长开始时去除茎尖，包括SAM、花、并且直至几片相邻的叶。通常，在现蕾期(在花开始出现后不久)将烟草植物打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放花时，可以将温室或田间种植的烟草植物打顶。烟草植物的打顶会导致顶端优势丧失，并导致生物碱产量增加。

通常，在打顶后约2周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一片叶化学或性质表征)。也可以使用其他时间点。在一个方面，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一片叶化学或性质表征)。在一个方面，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一片叶化学或性质表征)。

如本文所用，“相似的生长条件”是指用于生长的相似环境条件和/或农艺实践，其能够在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较，使得环境条件或农艺实践都不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。例如，环境条件包括光、温度、水(湿度)和营养(例如氮和磷)。例如，农艺实践包括播种、修剪、根切、移栽、打顶和分株。参见Tobacco,Production,Chemistry-Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford(1999),pp 70-103的第4B章和第4C章。

如本文所用，“可比叶”是指具有相似大小、形状、年龄和/或茎位置的叶。

香气/风味

在一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的LQG突变或转基因烟草植物包含相似水平的一种或多种选自由以下组成的组的烟草香气化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。

如本文所使用的，烟草香气化合物是与烟草烟雾的风味和香气相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷和labdenoid二萜以及糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物谱方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱法(GC-MS)、核磁共振光谱法、液相色谱-质谱联用。参见Weckwerth和Kahl编辑的“The Handbook of Plant Metabolomics”(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。

如本文所使用的，“还原糖”是具有游离的或潜在游离的醛基团或酮基团的任何糖(单糖或多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟气pH和有效地减少“游离的”未质子化的烟碱的量，在卷烟烟气中充当烟碱缓冲剂。还原糖例如通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感官影响来平衡烟气味道。已经报道在各种烟草品种之间、在同一品种内以及在同一植物品系内，因种植条件引起的糖含量与生物碱含量之间的反比关系。还原糖水平可以使用由SkalarInstrument Co(West Chester，PA)改良并如Davis,Tobacco Science 20:139-144(1976)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法来测量。例如，样品用碳酸钠溶液透析。将铜新亚铜试剂(Copper neocuproin)添加到样品中并且加热溶液。在糖的存在下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，形成在460nm处测量的有色复合物。

TSNA

在另一个方面中，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或多个基因座中缺少一个或多个突变的对照植物相比，所述突变赋予减少的降烟碱含量(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面中，当在可比条件下生长和熟化时，与对照植物相比，所描述的改良烟草植物还包含降低的烟碱脱甲基酶活性。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供升高水平的一种或多种抗氧化剂的一个或多个突变或转基因(参见美国专利申请号15/727,523和PCT申请号PCT/US2017/055618)。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供降低水平的一种或多种烟草特有亚硝胺(TSNA)(例如N'-亚硝基鸟烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N’-亚硝基安他那品(NAT)、N'-亚硝基钠(NAB))的一个或多个突变或转基因。

突变类型

在一个方面中，本公开提供了在LQG基因中包含非天然突变(例如，如在“LQG突变”中)的烟草植物或其部分。在一个方面中，非天然突变包括选自以下的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任何组合。如本文所用，“无义突变”是指通过核酸序列将提前终止密码子引入氨基酸序列的核酸序列突变。如本文所用，“错义突变”指导致核酸序列编码的氨基酸序列内的取代的核酸序列突变。如本文所用，“移码突变”指对核酸序列的插入或缺失，其移码以将核酸序列翻译成氨基酸序列。“剪接位点突变”指核酸序列中的突变，其导致内含子被保留用于蛋白翻译，或者，外显子被排除在蛋白翻译之外。剪接位点突变可导致无义、错义或移码突变。

当突变的信使RNA(mRNA)被翻译成蛋白或多肽时，基因编码区域的突变(例如，外显子突变)可导致截短的蛋白或多肽。在一个方面中，本公开提供了导致蛋白或多肽截短的突变。如本文所用，与内源性对照蛋白或多肽相比，“截短的”蛋白或多肽包含至少少一个氨基酸。例如，如果内源性蛋白A包含100个氨基酸，则蛋白A的截短形式可以包含1至99个氨基酸。

不受任何科学理论的限制，导致蛋白或多肽截短的一种方式是通过在内源性基因的mRNA转录物中引入提前终止密码子。在一个方面中，本公开提供了导致内源性基因的mRNA转录物中提前终止密码子的突变。如本文所用，“终止密码子”指mRNA转录物中的核苷酸三联体，其发出蛋白翻译终止的信号。“提前终止密码子”指定位于比内源性mRNA转录物中的正常终止密码子位置更早(例如，在5’侧)的终止密码子。不受限制地，本领域已知几种终止密码子包括“UAG”、“UAA”、“UGA”、“TAG”、“TAA”和“TGA”。

在一个方面中，本文提供的突变包括无效突变。如本文所用，“无效突变”指使由包含该突变的基因编码的蛋白完全丧失功能的突变，或者，使由基因组基因座编码的小RNA完全丧失功能的突变。无效突变可导致缺乏mRNA转录物产生、缺乏小RNA转录物产生、缺乏蛋白功能或其组合。

本文提供的突变可以位于内源性基因的任何部分。在一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的外显子内。在另一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的内含子内。在一个进一步的方面中，本文提供的突变位于内源性基因的5’非翻译区(UTR)内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的3’UTR内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的启动子内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的终止子内。

在一个方面中，与缺乏突变的内源性基因相比，内源性基因中的突变导致表达水平降低。在另一个方面中，与缺乏突变的内源性基因相比，内源性基因中的突变导致表达水平增加。

在一个方面中，与对照烟草植物中的基因表达相比，非天然突变导致表达水平降低。在一个方面中，与对照烟草植物中的基因表达相比，非天然突变导致表达水平增加。

在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的内源性基因编码的蛋白或多肽相比，内源性基因中的突变导致由具有突变的内源性基因编码的蛋白或多肽的活性水平降低。在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的内源性基因编码的蛋白或多肽相比，内源性基因中的突变导致由具有突变的内源性基因编码的蛋白或多肽的活性水平增加。

在一个方面中，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平降低。在另一个方面中，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平增加。

在一个方面中，本文提供的突变提供了激活目的基因(例如一个或多个LQG基因)的表达或提高其活性的显性突变体。

基因表达水平是本领域的常规研究。作为非限制性示例，可以使用定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、RNA测序或Northern印迹来测量基因表达。在一个方面中，使用qRT-PCR测量基因表达。在另一个方面中，使用Northern印迹测量基因表达。在另一个方面中，使用RNA测序测量基因表达。

LQG突变烟草植物可以通过本领域已知的任何方法制备，其中包括随机或靶向诱变方法。这种诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering和Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp317-320,1965)或UV-辐射、X-射线、和快中子辐照(例如，参见Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman,Breeding Field Crops,VanNostrandReinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)、转座子标签(Fedoroff等,1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)以及T-DNA插入法(Hoekema等,1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变包括在基因组长度上化学诱导随机点突变。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大量缺失。转座子标签包含在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。例如，可能存在于烟草基因中的突变类型包括点突变、缺失、插入、复制和倒置。该突变期望存在于烟草基因的编码区；但是，烟草基因的启动子区、和内含子、或非翻译区中的突变也可能是期望的。

此外，用于筛选化学诱导的突变的快速并且可自动化的方法，TILLING(在基因组中靶诱导局部病变)也适用于本公开，其使用变性HPLC或选择性核酸内切酶消化选择的PCR产物。参见McCallum等(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因功能的突变可以使用本领域公知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变。保守性残基中的突变可以特别有效地抑制蛋白的功能。在一个方面，烟草植物包含美国临时申请No.62/616,959和62/625,878(其两者的全文通过引用并入本文)中所述的一个或多个NCG基因中的无义(例如，终止密码子)突变。

在一个方面中，本公开还提供了具有改变的烟碱水平同时保持商业上可接受的叶片质量的烟草品系。在一个方面中，通过精确的基因组工程技术，例如转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、锌指核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISOR/Csm1系统及其组合，可以在nic1和/或nic2基因座的一个或多个基因中引入突变来制备这些品系(参见例如US专利申请公开2017/0233756)。例如参见Gaj等，Trends in Biotechnology,31(7):397-405(2013)。

诱变的烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、用于检测酶或多肽和多核苷酸的核酶活性的酶测定、以及蛋白凝胶电泳、蛋白印迹法、免疫沉淀法以及用于检测多肽的酶联免疫测定法。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。实施所有引用技术的方法是已知的。

在一个方面，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶、CRISOR/Csm1核酸酶的核酸酶进行突变或编辑。

如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个核苷酸的靶向诱变，或去除或替换内源植物基因组的核酸序列。在一个方面，所提供的经编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％，至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面中，提供的编辑的核酸序列与SEQ ID NO:1-17及其片段具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。

大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点诱导双链DNA断裂，其然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复。然后在切割位点发生序列修饰，其可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面中，所提供的方法包括用所提供的核酸酶经由HR和供体多核苷酸编辑植物基因组以突变植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个核苷酸。在一个方面，所提供的突变由使用核酸酶编辑基因组引起。在另一方面，所提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。

通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化版本通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中交织。已经使用专门的诱变方法和高通量筛选来产生新的大范围核酸酶变体，其识别独特序列并具有提高的核酸酶活性。

ZFN是合成蛋白质，其由与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成。ZFN可以设计成切割几乎任何长链的双链DNA，用于修饰锌指DNA结合结构域。ZFN由单体形成二聚体，所述单体由与工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列融合的FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割结构域组成。

ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。可以改变和定制相对于锌指∞-螺旋的起始位置-1、+2、+3和+6的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)以适合特定的靶标列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则是本领域中已知的。

FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个具有C末端区域的ZFN来结合切割位点的相对DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可以切割靶标位点。如本文所用，术语ZFN是广义的并且包括单体ZFN，其可以在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还用于指一对ZFN(被工程化以共同作用在同一位点切割DNA)的一个或两个成员。

不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一进行重新工程化，理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公众可得的方法包括依赖于上下文的装配(CoDA)、寡聚化池工程(OPEN)和模块化装配。

TALEN是通过将转录激活子样效应子(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶标位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并导致靶标位点处的双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括单体TALEN，其可以在没有另一个TALEN帮助下切割双链DNA。术语TALEN还用于指一对TALEN的一个或两个成员，它们共同作用在同一位点切割DNA。

可以工程化转录激活子样效应子(TALE)以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白质是衍生自黄单胞菌(Xanthomonas)属的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。黄单胞菌病原体在感染期间将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在那里它识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有13-28个重复的33-34个氨基酸的单体组成的中心DNA结合结构域。除第12位和第13位的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都高度保守。两种可变氨基酸称为重复可变的双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。

除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，其需要两个构建体，所述构建体具有对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特性的DNA结合结构域。TALENDNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高水平活性的参数。

氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等,.Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。

CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代方案。CRISPR系统基于RNA引导的工程化核酸酶，其使用互补碱基配对来识别靶标位点处的DNA序列。

CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免受入侵核酸如病毒的侵害。通过在CRISPR基因座近端的两个相邻重复序列之间整合称为间隔子的入侵DNA的短片段来获得免疫力。CRISPR阵列(包括间隔子)在随后与侵入性DNA相遇时被转录，并被加工成长度约为40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)结合以激活并引导Cas9核酸酶。这切割了入侵DNA中称为原型间隔子的同源双链DNA序列。切割的前提是在靶DNA下游存在保守的原型间隔子-邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，较少具有序列NAG。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，其必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。

转基因

本公开还提供了在植物中，特别是在烟草属的植物中，包括各种商业品种的烟草植物中用于激活或抑制的一种或多种LQG基因的表达或功能的组合物和方法。

如本文所用，术语“抑制(inhibit)”，“抑制(inhibition)”和“抑制(inhibiting)”定义为本领域已知的或本文所述的降低目标基因产物(例如，靶基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可用于比较两种植物，例如遗传改变的植物与野生型植物。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在相同植物内的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间或不同植物之间进行比较，并且包括在同一植物或植物组分内的发育阶段或时间阶段之间或在植物或植物部分之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”包括下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。在一个方面中，修饰的植物中一种或多种基因的mRNA或蛋白水平是在不是突变体或未经遗传修饰以抑制所述基因表达的植物中相同基因的mRNA或蛋白水平的小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。

术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

在一个方面中，本公开提供包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子在烟草细胞中具有功能，并且与编码RNA分子的多核苷酸可操作连接，所述RNA分子能够结合编码多肽的RNA，所述多肽具有与选自SEQ ID NO：18-34的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列及其片段，其中所述RNA分子抑制所述多肽的表达。在一个方面中，RNA分子选自microRNA、siRNA和反式作用siRNA。在另一个方面中，重组DNA构建体编码双链RNA。还提供包含三个重组DNA构建体的转基因烟草植物或其部分、熟化的烟草材料或烟草产品。在一个方面中，与不含重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、熟化的烟草材料或烟草产品包含减少的烟碱含量。还提供降低烟草植物的烟碱含量的方法，所述方法包括用这些重组DNA构建体的任一个转化烟草植物。

如本文所用，“可操作连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。

如本文所用并且当用于指示序列时，“异源”是指序列源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体旨在表示构建体源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。异源核酸构建体包括但不限于例如通过转化方法或随后用另一种目标植物育种转基因植物而已经引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体。在一个方面，使用的启动子与该启动子驱动的序列是异源的。在另一个方面，使用的启动子是烟草异源的。还在一个方面，使用的启动子对于烟草是天然的。

在一个方面，所述的改良烟草植物是同源转基因植物。如本文所用，“同源转基因”或“顺基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。在一个方面，本文提供的改良植物、植物细胞或植物基因组是顺基因的。本文提供的顺化基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。在另一个方面，本文提供的改良烟草植物不包含非烟草的遗传物质或序列。

如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。

在一个方面，重组DNA构建体或表达盒可包含用于选择转基因细胞的选择性标记基因。选择性标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物，例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、磺酰脲类(例如氯磺隆和甲嘧磺隆)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。

在一个方面，重组DNA构建体或表达盒包含选自组成型启动子、诱导型启动子和组织优先启动子(例如叶特异性或根特异性启动子)的启动子。示例性的组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；泛素(Christensen等，1989)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J 3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。示例性的化学诱导型启动子包括由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学诱导型启动子包括类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.US88:10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子和四环素诱导型启动子(参见例如，Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)。可用于本文的其他示例性启动子是那些负责热调节的基因表达、光调节的基因表达(例如豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；在豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或者阿拉伯苏启动子)、激素调节的基因表达(例如，来自小麦Em基因的脱落酸(ABA)反应序列；ABA诱导型HVA1和HVA22，以及大麦和拟南芥的rd29A启动子；和伤口诱导的基因表达(例如wunl)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性储存蛋白基因；来自玉米的23kDa玉米醇溶蛋白基因；或法国豆(β-菜豆蛋白基因)或病原体-诱导型启动子(例如PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子，以及线虫诱导型启动子，烟草和欧芹的TobRB7-5A和Hmg-1)。

在一个方面中，提供的烟草植物还包括参与烟碱生物合成或运输的基因的增加或减少的活性或表达。参与烟碱生物合成的基因包括精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尚未阐明催化烟碱酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间的缩合步骤的烟碱合成酶，尽管已经提出了两个候选基因(A622和NBB1)。参见US 2007/0240728 A1和US 2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。另外，几种转运蛋白可能参与烟碱的转运。已经克隆并表征了称为MATE的转运蛋白基因(Morita等,PNAS 106:2447-52(2009))。

在一个方面中，与对照烟草植物相比，所提供的烟草植物还包含编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的mRNA、蛋白或两者水平的升高或降低。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含直接抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的表达的转基因。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含过表达编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的转基因。

还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法用本文所述的重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指其中引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物中并且仅在时间上表达或仅瞬时存在于植物中。

将多核苷酸引入本公开的植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Shillito等(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.US83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomes等(1995)in Plant Cell,Tissue,andOrgCultureFundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology6:923-926)。还可以参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-674(soybean)；McCabe等(1988)Bio/Technology6:923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)InVitro CellDev.Biol.27P:175-182(soybean)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(soybean)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman等(Longman,N.Y.),pp.197-209(花药)；Kaeppler等(1990)Plant CellReports9:415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)。

在另一个方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文提供的重组构建体或表达盒引入植物。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒整合入病毒DNA或RNA分子中。已经认识到，用于本文提供的表达盒的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶的转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并表达在其中编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。

可以用重组构建体或表达盒转化可以使用克隆方法随后繁殖(无论是通过器官发生还是胚胎发生)的任何植物组织。“器官发生”是指从分生组织中心依次发育芽和根的过程。“胚胎发生”是指芽和根从体细胞或配子以协调方式(不是依次)一起发育的过程。适用于本文所述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、已有的分生组织(例如茎尖分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。

启动子

在一个方面中，本公开提供了包含靶向LQG基因的转基因的烟草植物或其部分(例如，如在“LQG转基因植物”中)。本文描述的LQG转基因或重组核酸中可以使用各种类型的启动子，它们根据与可操作地连接至该启动子的编码序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的各种标准进行分类，例如组成型、发育型、组织特异性、组织优先性、诱导型等。在植物的所有或大多数组织中起始转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中表达增强的启动子被称为“组织增强性”或“组织优先性”启动子。因此，“组织优先性”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但是在植物的其他组织中引起较低的表达水平。在植物的特定组织内表达而在其他植物组织中表达很少或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。在植物的某种细胞类型中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(例如冷、干旱、热或光照，或其他刺激例如受伤或化学施用)而起始转录的启动子。启动子也可以按照其起源分类，例如是异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同起源的启动子序列，和/或在要转化的植物物种中不是天然存在的启动子序列。术语“异源”更广泛地包括两个或更多个DNA分子或序列的组合，当这种组合在自然界中通常不存在时。例如，如果两个或更多个DNA分子或序列通常在不同的基因组中或在同一基因组的不同基因座处发现，或者如果它们在自然界中不是相同组合，则它们彼此之间是异源的。

一方面，LQG转基因包含诱导型启动子。一方面，诱导型启动子是打顶诱导型启动子。在一个方面中，诱导型启动子也是组织特异性或组织优先启动子。在一个方面中，组织特异性或组织优先启动子对于选自以下的一种或多种组织或器官是特异性的或优先的：芽、根、叶、茎、花、烟杈、根尖、叶肉细胞、表皮细胞和脉管系统。在进一步的方面中，打顶诱导型启动子包含来自烟草烟碱去甲基化酶基因的启动子序列，例如CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10。在一个方面中，诱导型启动子提供根特异性或优先的表达。示例性的根特异性或优先的诱导型启动子可以在美国专利申请公开号2019/0271000中找到。在一个方面中，诱导型启动子提供叶特异性或优先的表达。示例性的叶特异性或优先的诱导型启动子可以在美国专利申请公开号2019/0271000中找到，其通过引用以其整体并入本文。

在一个方面中，诱导型启动子与可操作连接的可转录DNA序列是异源的。在一个方面中，可转录的DNA序列编码选自microRNA(miRNA)、反义RNA，小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(tA-siRNA)和发夹RNA(hpRNA)的非编码RNA。在一个方面中，非编码RNA包含与选自SEQ ID NO:1-17的序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％同一性的核苷酸序列及其任何部分。

烟草类型

在一个方面中，所提供的烟草植物来自选自以下的烟草类型：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草、深色明火烤制熟化烟草、

在一个方面中，提供的烟草植物在烤制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种烤制熟化烟草特性。烤制熟化烟草(也称为“弗吉尼亚烟”或“金黄色”烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“浅色烟烟草”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高并且油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表1所列品种的烤制熟化烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。参见WO2004/041006A1。在在一个进一步的方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子的选自K326、K346和NC196的烤烟品种。

表1.烤制熟化烟草品种

在一个方面中，提供的烟草植物在晾制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种晾制熟化烟草特性。晾制熟化烟草包括“白肋”、“马里兰”和“深色”烟草。将晾制熟化烟草联系起来的共同因素是熟化主要没有人工的热源和湿度。白肋烟的颜色是浅棕色至深棕色，油含量高，糖含量低。白肋烟通常在仓房中晾制熟化。白肋烟的主要种植国家包括阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。

马里兰烟草非常蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性香气。马里兰的主要种植国包括美国和意大利。

在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表2中所列烟草品种的白肋烟品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。在一个进一步的方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子是选自以下的白肋烟品种：TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488。

表2.白肋烟品种

在另一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表3中所列烟草品种的马里兰烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。

表3.马里兰烟草品种

在一个方面中，所提供的烟草植物处于深色晾制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种深色晾制熟化烟草特性。深色晾制熟化烟草与其他烟草类型的区别主要在于其熟化过程，这使得深色晾制熟化烟草中具有中棕色至深棕色的颜色和独特的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产咀嚼烟和鼻烟。在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子是选自以下的深色晾制熟化烟草品种：Sumatra、Jatim、Dominican Cubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginia sun-cured和Paraguan Passado，以及基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种。

在一个方面中，所提供的烟草植物是在深色明火烤制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种深色明火烤制熟化烟草特性。深色明火烤制熟化烟草通常在封闭的熟化室底板上用低燃烧木火熟化。深色明火烤制熟化烟草通常用于制作管烟、卷烟、咀嚼烟草、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区是美国的田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或修饰的烟草植物或种子是选自在表4中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种的深色烤烟品种。

表4.深色明火烤制熟化烟草品种

在一个方面中，提供的烟草植物在东方烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种东方烟草特征。东方烟草也被称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们通常生长在东地中海地区，如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚。东方烟草品种的株型小、叶型小和独特的香气特性是其适应所生长的贫瘠的土壤和恶劣气候条件的结果。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表5中所列烟草品种的东方烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。

表5.东方烟草品种。

在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表6中所列烟草品种的雪茄烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。

表6.雪茄烟品种

在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表7中所列烟草品种的烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。

表7.其他烟草品种

在一个方面中，本文所述的修饰的烟草植物、种子或细胞来自选自由表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7中列出的烟草品种组成的组中的品种。

在一个方面中，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上来源于或在以下的遗传背景下：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、窄叶Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal SmithMadole、OXFORD 207、`Perique`tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309、或VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。

所有前述提及的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方烟草类型的特定品种仅出于示例性目的列出。在本申请中还考虑了任何另外的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化、东方品种。

还提供了所描述的烟草植物的种群。在一个方面中，烟草植物的种群具有以下种植密度：每英亩约5,000至约8,000、约5,000至约7,600、约5,000至约7,200、约5,000至约6,800、约5,000至约6,400、约5,000至约6,000、约5,000至约5,600、约5,000至约5,200、约5,200至约8,000、约5,600至约8,000、约6,000至约8,000、约6,400至约8,000、约6,800至约8,000、约7,200至约8,000或约7,600至约8,000株植物。在另一个方面中，烟草植物的种群处于低至中等肥力的土壤类型中。

还提供了所述的来自烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可以包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以容纳至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或更多的种子。或者，容器可容纳至少或大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000克或更多的种子。烟草种子的容器可以是本领域可获得的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒、袋、包、小袋、带卷、管或瓶。

熟化/产品

还提供了由所述低生物碱或低烟碱烟草植物制成的熟化烟草材料。还提供了由所述的具有较高水平的总生物碱或烟碱的烟草植物制成的熟化烟草材料。

“熟化”是减少水分并导致叶绿素的破坏的陈化过程，使烟叶呈现金黄色，淀粉转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面中，本文提供的烟草植物或烟草组分可以使用常规方法进行熟化，例如，烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于不同类型的熟化方法的描述，参见，例如，Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry andTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％至约25％的压缩条件下在木桶(例如，大桶)或纸板箱中陈化数年(例如，2至5年)。参见，美国专利号4,516,590和5,372,149。然后可以进一步加工熟化和老化的烟草。然后，可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制烟草。发酵的典型特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10％到20％。参见，例如，美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国专利公开号2005/0178398；以及Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。可以进一步对熟化、陈化和发酵的烟草进行加工(例如，切割、切碎、膨化或混合)。参见，例如，美国专利号4,528,993；4,660,577；4,987,907。在一个方面中，本公开的熟化烟草材料是晒制熟化。在另一个方面中，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化、晾制熟化或明火烤制熟化。

从本公开的烟草品系、品种或杂种获得的烟草材料可用于制造烟草产品。如本文所用，“烟草产品”被定义为任何由烟草制成或衍生的供人类使用或消费的产品。

本文提供的烟草产品包括但不限于卷烟产品(例如，卷烟和比迪烟)、雪茄产品(例如，雪茄包皮烟和小雪茄)、烟斗烟产品、衍生自烟草的产品、来自烟草的烟碱产品、无烟烟草产品(例如，湿鼻烟、干鼻烟、嚼烟)、膜、可嚼的、标签、成形部分、凝胶、消费品单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号US 2006/0191548。

如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草产品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。

如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以模拟烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。

如本文所用，““膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。其减少了卷烟中使用的烟草的重量。

来自本公开的植物的烟草产品还包括卷烟和其他吸烟产品，特别是那些包括过滤元件的吸烟产品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。在一个方面中，本公开的烟草产品选自小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、烟叶、水烟烟草、切碎的烟草和生切烟丝。在另一个方面中，本公开的烟草产品是无烟烟草产品。无烟烟草产品不燃烧，并且包括但不限于咀嚼烟草、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其通常包装在大袋状包装中并用于塞子或捻。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且通常包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或放置在成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或用于鼻腔的精细研磨的烟草。在另一个方面中，本公开的烟草产品选自以下：电子加热的卷烟、电子烟和电子雾化装置。

在一个方面中，本公开的烟草产品可以是混合烟草产品。在一个方面中，混合烟草产品包含熟化烟草材料。在一个方面中，熟化烟草材料占烟草混合物中熟化烟草重量的约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个方面中，熟化烟草材料占烟草混合物中熟化烟草体积的约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一个方面中，本公开的烟草产品可以是低烟碱烟草产品。在另一个方面中，本公开的烟草产品可包含小于约3mg/g的降烟碱。例如，该产品中降烟碱含量可为约3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750μg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g、或不可检测。

在一个方面中，提供的熟化烟草材料或烟草产品包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自以下：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面中，所提供的熟化烟草材料或烟草产品包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自以下：约0.01％至0.02％、0.02％至0.05％、0.05％至0.75％、0.75％至0.1％、0.1％至0.15％、0.15％至0.2％、0.2％至0.3％、0.3％至0.35％、0.35％至0.4％、0.4％至0.5％、0.5％至0.6％、0.6％至0.7％、0.7％至0.8％、0.8％至0.9％、0.9％至1％、1％至1.1％、1.1％至1.2％、1.2％至1.3％、1.3％至1.4％、1.4％至1.5％、1.5％至1.6％、1.6％至1.7％、1.7％至1.8％、1.8％至1.9％、1.9％至2％、2％至2.1％、2.1％至2.2％、2.2％至2.3％、2.3％至2.4％、2.4％至2.5％、2.5％至2.6％、2.6％至2.7％、2.7％至2.8％、2.8％至2.9％、2.9％至3％、3％至3.1％、3.1％至3.2％、3.2％至3.3％、3.3％至3.4％、3.4％至3.5％和3.5％至3.6％。在另一个方面中，所提供的熟化烟草材料或烟草产品包含的平均烟碱或总生物碱水平(基于干重)选自：约0.01％至0.1％、0.02％至0.2％、0.03％至0.3％、0.04％至0.4％、0.05％至0.5％、0.75％至1％、0.1％至1.5％、0.15％至2％、0.2％至3％和0.3％至3.5％。

本公开还提供了一种制造烟草制品的方法，所述烟草制品包含来自所提供的烟草植物的烟草材料。在一个方面，方法包括调制由本文提供的烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其水分含量从约12.5％至约13.5％增加至约21％，混合经调制的烟草材料以产生所需的混合物。在一个方面，制备烟草制品的方法进一步包含将所述混合物进行加料(casing)或调味。通常，在加料工序中，在混合物中加入加料或调味的材料，通过平衡化学组成来提高它们的质量并开发某些期望的风味特征。加料工艺的进一步细节可见于L.Davis和M.Nielsen主编的Tobacco Production,Chemistry和Technology,Blackwell Science,1999。

所提供的烟草材料也可以使用包括但不限于热处理(例如烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法进行加工。可以使用这些技术加工发酵和非发酵烟草。合适的加工烟草的实例包括深色晾制熟化的、深色明火烤制熟化的、白肋烟、烤制熟化的和雪茄填料或包装纸，以及来自整个叶片干燥操作的制品。在一个方面，烟草纤维包括基于鲜重高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述，可通过加热、出汗和/或巴氏杀菌步骤来调制烟草。

所提供的烟草材料可以进行发酵。通常，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373和5,372,149。除了改变叶片的香气外，发酵还可以改变叶片的颜色和质地。同样在发酵过程中，可以产生演化气体，可以吸收氧气，可以改变pH值，可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,ChemistryandTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。在加入口腔用制品之前，可以进一步加工(例如切割、膨化、混合、研磨或粉碎)熟化或熟化并发酵的烟草。在某些情况下，烟草是长切发酵的熟化湿烟草，在与共聚物和任选的食用香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。

在一个方面，本文提供的烟草材料可以加工成所需的尺寸。在某些方面，烟草纤维可以加工成平均纤维尺寸小于200微米。在一个方面，烟草纤维为75至125微米。在另一个方面，将烟草纤维加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切割或切碎成宽度为约10切/英寸(cut/inch)直至约110切/英寸，长度为约0.1英寸至约1英寸。双切烟草纤维可具有一定范围的颗粒尺寸，使得约70％的双切烟草纤维落在-20目至80目的筛目尺寸之间。

本文提供的烟草材料可以加工成总烘箱挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％至约25重量％；约20重量％至约30重量％；约30重量％至约50重量％；约45重量％至约65重量％或约50重量％至约60重量％。本领域技术人员将理解，“潮湿”烟草通常是指烘箱挥发物含量为约40重量％至约60重量％(例如约45重量％至约55重量％，或约50％重量)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”通过计算在预热的强制通风烘箱中于110℃干燥样品3.25小时后样品的失重百分比来确定。口腔用制品的总烘箱挥发物含量可与用于制备口腔用制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同。本文描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。

育种

本公开还提供用于育种包含所需含量的总生物碱或烟碱(例如低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培种或品种的方法。育种可以通过任何已知的方法进行。可以在标记-辅助选择(MAS)育种项目中使用DNA指纹图谱、SNP作图、单倍型作图或相似技术以将所需的性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可以使用F1杂交植物在F2代或回交世代中生成分离群体，或者进一步将F1杂交种植物与其他具有农艺上所需基因型的供体植物杂交。可以使用本领域已知的技术或本文列出的技术之一筛选F2或回交世代的植物的所需农艺性状或所需化学特征。取决于预期的遗传模式或使用的MAS技术，可以在每个回交周期之前对所选植物进行自花授粉，以帮助鉴定所需的单个植株。回交或其他育种程序可重复进行，直到轮回亲本的所需表型恢复。本公开中的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种或东方品种。例如，其它育种技术可以在Wernsman,E.A.,和Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan PublishingGo.,Inc.,New York,N.Y.中找到，其全部内容通过引用并入本文。

使用所描述的烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用的品系、栽培种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有将其与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。品种通常是，尽管并不总是，商业化销售的。尽管具有一个或多个区别性状，品种的进一步特征是在该品种内的个体之间的总体差异非常小。可以通过数代自花受粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖生成“纯品系”品种。品种可以基本上衍生自另一个品系或品种。根据国际公约对植物新品种保护所定义的(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；c)除了由衍生行为产生的差异，它在由所述初始品种的基因型或基因型组合导致的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变异、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化获得基本上衍生的品种。第一烟草品种和第二烟草品种(第一烟草品种基本衍生自第二烟草品种)被认为具有基本相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业化使用，例如用于植物研究的一组植物。品系通常在个体间的一个或多个目标性状显示非常小的总体差异，尽管在个体间的其他性状可能存在一些差异。

应当理解，本公开的任何烟草植物可以进一步包含额外的农艺上所需的性状，例如，通过使用本领域已知的技术用遗传构建体或转基因进行转化。非限制性地，所需性状的示例是除草剂抗性、抗虫性、抗病性；高产率；高等级指数值；可熟化性；熟化质量；机械收获性能；耐熟能力；叶片质量；高度、植物成熟(例如早熟、早熟到中熟、中熟、中晚熟或晚熟)；茎的大小(例如小的、中等的或大的茎)；或每株植物的叶数(例如少的(例如5-10叶)、中等的(例如11-15叶)或多的(例如16-21)叶数)或任意组合。在一个方面中，本公开的低烟碱或无烟碱的烟草植物或种子包含表达一种或多种杀虫蛋白的一种或多种转基因，所述杀虫蛋白例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体蛋白或来自蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的营养型杀虫蛋白，诸如VIP3(例如，参见Estruch等.(1997)Nat.Biotechnol.15:137)。在其它方面中，烟草植物进一步包含赋予对棕色茎腐病的抗性(美国专利号5,689,035)或对抗囊胞线虫的抗性(美国专利号5,491,081)的基因渗入性状。

本公开还提供了烟草植物，其包含改变的烟碱或总生物碱水平，但其产量与没有该改变的烟碱含量的相应的初始烟草植物的产量相当。在一个方面中，低烟碱或无烟碱烟草品种提供选自下组的产量：约1200-3500、1300-3400、1400-3300、1500-3200、1600-3100、1700-3000、1800-2900、1900-2800、2000-2700、2100-2600、2200-2500和2300-2400lbs/英亩。在其他方面中，低烟碱或无烟碱烟草品种提供的产量选自下组的产量：约1200-3500、1300-3500、1400-3500、1500-3500、1600-3500、1700-3500、1800-3500、1900-3500、2000-3500、2100-3500、2200-3500、2300-3500、2400-3500、2500-3500、2600-3500、2700-3500、2800-3500、2900-3500、3000-3500和3100-3500lbs/英亩。在进一步的方面中，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供的产量为对照植物的产量的65％至130％、70％至130％、75％至130％、80％至130％、85％至130％、90％至130％、95％至130％、100％至130％、105％至130％、110％至130％、115％至130％、或120％至130％，所述对照植物除了提供低烟碱或无烟碱性状的遗传修饰之外具有基本相同的遗传背景。在进一步的方面中，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供的产量为对照植物的产量的70％至125％、75％至120％、80％至115％、85％至110％、或90％至100％，所述对照植物除了提供低烟碱或无烟碱性状的遗传修饰之外具有基本相同的遗传背景。

在一个方面中，低生物碱背景中的LQG突变或转基因烟草植物表现出选自下组的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的性状：与低生物碱背景对照相比增加的产量、与低生物碱背景对照相比加速的成熟和衰老、与低生物碱背景对照相比降低的对昆虫食草性的敏感性，以及与低生物碱背景对照相比在打顶后降低的多胺含量。在一个方面中，低生物碱背景中的LQG突变或转基因烟草植物表现出选自下组的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的性状：与LA BU21相比增加的产量、与LA BU21相比加速的成熟和衰老、与LA BU21相比降低的对昆虫食草性的敏感性、以及与LA BU21相比在打顶后降低的多胺含量。

在一个方面中，LQG突变或转基因烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面中，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的两个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面中，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的三个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面中，与LA BU21、LAFC53或LN KY171相比，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示较低水平的选自以下的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面中，与LA BU21、LAFC53或LN KY171相比，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示较低水平的选自以下的两个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面中，与LA BU21、LAFC53或LN KY171相比，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示较低水平的选自以下的三个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。

在一个方面中，修饰的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含LQG遗传修饰和赋予预期性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)而基本上不影响选自以下的性状的进一步遗传修饰：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、叶肉细胞数/单位叶面积和熟化后的最终制品质量。

在一个方面中，LQG突变或转基因烟草植物包含赋予预期性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且还包含与未修饰的对照植物基本上相当的性状，其中所述性状选自以下：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、叶肉细胞数/单位叶面积和熟化后的最终制品质量。

在一个方面中，提供的烟草植物是杂交种植物。杂交种可以通过以下来产生：阻止第一品种的雌性亲本植物(例如，种子亲本)自花受粉，允许第二品种的雄性亲本植物的花粉受精雌性亲本植物，并允许F1杂交种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育早期将花去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可以使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，可以通过雄性不育(MS)或其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育或自交不亲和来产生雄性不育。包含MS的雌性亲本植物尤其有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可以从雄性可育植物收获花粉，并人工授至MS雌性亲本植物的柱头，并收获所得的F1种子。

植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自雄性亲本植物的花粉人工转移至去雄的雌性亲本植物或雄性不育的雌性亲本植物以形成F1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作母本并与不同的父本杂交。作为另一种选择，可以产生双交杂交种，其中两个不同单交的F1子代与其自身杂交。当形成双交杂交种时，自交不亲和可以特别有利地用于阻止雌性亲本的自花授粉。

在一个方面中，低烟碱或无烟碱烟草品种是雄性不育的。在另一个方面中，低烟碱或无烟碱的烟草品种是细胞质雄性不育的。雄性不育的烟草植物可以通过本领域已知的任何方法产生。产生雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.CropSpecies.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp。

在一个方面中，本文提供的烟草部分包括，但不限于，叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、豆荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。在一个方面中，所提供的烟草部分不包括种子。在一个方面中，本公开提供了烟草植物细胞、组织和器官，其不是繁殖材料，也不介导植物的自然繁殖。在另一个方面中，本公开还提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是繁殖材料并介导植物的自然繁殖。在另一个方面中，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。

细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、芽、茎、荚、花、花序、茎、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物叶绿体。在一个进一步的方面中，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、叶毛或根毛、贮藏根或块茎。在另一个方面中，本公开提供了烟草原生质体。

技术人员理解，烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。在一个方面中，本公开提供烟草胚乳。在另一个方面中，本公开提供烟草胚乳细胞。在进一步的方面中，本公开提供一种雄性或雌性不育的烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。本领域技术人员还理解，熟化的烟草不构成活的生物体并且不能生长或繁殖。

核酸/多肽

在一个方面中，本公开提供了包含与选自由SEQ ID NO:1-17组成的组的序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸分子及其片段。在一个方面中，本公开提供的多肽或蛋白包含与选自由SEQ ID NO:18-34组成的组的氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性。在另一个方面中，本公开提供了具有选自SEQ ID NO:18-34的氨基酸序列的蛋白的生物活性变体。本公开的蛋白的生物活性变体与所述蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸残基。还提供了包含选自SEQ ID NO:1-34的序列的基因或蛋白的直系同源基因或蛋白。“直系同源物”是衍生自共同祖先基因的基因，其由于特定化而发现于不同的物种。直系同源物在核苷酸序列和/或蛋白序列水平具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性或相似性。直系同源物的功能通常在物种中高度保守。

如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”指的是当在指定的比较窗口上比对最大对应性时两个序列中的残基相同。当对蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常通过保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代上不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。

所提供的核酸分子、多肽或蛋白可以是分离的或基本纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白或其生物活性部分实质上或基本上不含通常与其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白相伴或相互作用的组分。例如，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。

设想了以下示例性、非限制性的实施方案：

1.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含上调编码与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰。

2.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性。

3.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含上调编码与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽的基因的表达或活性的遗传修饰。

4.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽。

5.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含下调编码与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列的基因的表达或活性的遗传修饰。

6.一种修饰的烟草植物或其部分，其在与选自SEQ ID NO:16-17的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的多核苷酸中包含非天然突变。

7.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至mRNA，所述mRNA与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性，其中所述非编码RNA分子抑制所述mRNA的水平或翻译。

8.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含下调编码与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽的基因的表达或活性的遗传修饰。

9.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含在多核苷酸中的非天然突变，所述多核苷酸具有编码与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽的核酸序列。

10.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合至编码多肽的RNA，所述多肽与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性，其中所述非编码RNA分子抑制所述多肽的表达。

11.根据实施方案1至10中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是普通烟草(nicotiana tabacum)植物。

12.根据实施方案11所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含突变或转基因，其相对于不具有所述突变或转基因的对照植物赋予降低的烟碱水平。

13.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是低生物碱烟草植物。

14.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中当熟化时，所述烟草植物产生的叶的USDA等级指数值高于在相似条件下生长和熟化的对照植物的可比叶的USDA等级指数值，其中所述对照植物与烟草植物具有除所述遗传修饰、所述重组核酸构建体或所述非天然突变以外基本上相同的遗传背景。

15.根据实施方案14所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述较高的USDA等级指数值比对照植物的所述可比叶高至少200％、150％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％或5％。

16.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述突变包含nic1突变、nic2突变或两者。

17.根据实施方案16所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述nic1突变、所述nic2突变或两者基因渗入或来源于选自以下的品种：LA Burley 21、LAFC53、LN B&W和LNKY171。

18.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述突变包含编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)、S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1_ERF、Nic2_ERF、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白。

19.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述突变包含编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。

20.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述突变包含编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

21.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)、S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1_ERF、Nic2_ERF、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白。

22.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。

23.根据实施方案12所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予降低的烟碱水平的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

24.根据实施方案21至23中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述转基因编码选自由microRNA(miRNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)和发夹RNA(hpRNA)组成的组的非编码RNA。

25.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物能够产生包含相当水平的一种或多种多胺的叶。

26.根据实施方案25所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述相当水平是在对照植物的所述可比叶中的水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。

27.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物能够产生包含相当的叶绿素水平的叶。

28.根据实施方案27所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述相当的叶绿素水平是在对照植物的所述可比叶中的水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。

29.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物能够产生包含每单位叶面积相当的叶肉细胞数的叶。

30.根据实施方案29所述的修饰的烟草植物或其部分，其中每单位叶面积相当的叶肉细胞数是在对照植物的所述可比叶中每单位叶面积的叶肉细胞的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。

31.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物能够产生包含相当的表皮细胞大小的叶。

32.根据实施方案31所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述相当的表皮细胞大小是在对照植物的所述可比叶中的表皮细胞大小的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。

33.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物产生包含相当的叶产量的叶。

34.根据实施方案33所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述相当的叶产量是在对照植物的所述可比叶的叶产量的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。

35.根据实施方案12至24中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不包含赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的可比叶，所述烟草植物表现出相当的昆虫食草性敏感性。

36.根据实施方案5和8中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述遗传修饰包含或编码非编码RNA。

37.根据实施方案36所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非编码RNA选自由microRNA(miRNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)和发夹RNA(hpRNA)组成的组。

38.根据实施方案1至5、7、8、10和至11中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述遗传修饰或异源启动子包括诱导型启动子。

39.根据实施方案1至5、7、8、10和11中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述遗传修饰或异源启动子包括组织特异性或组织优先启动子。

40.根据实施方案1至5、7、8、10和11中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述遗传修饰或异源启动子包括组成型启动子。

41.根据实施方案38所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述诱导型启动子是打顶诱导型启动子。

42.根据实施方案38所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述诱导型启动子也是组织特异性或组织优先启动子。

43.根据实施方案39或42所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述组织特异性或组织优先启动子对选自以下的一种或多种组织或器官是特异性的或优先的：芽、根、叶、茎、花、烟杈、根尖、叶肉细胞、表皮细胞和脉管系统的一种或多种组织或器官是特异性的或优选的。

44.根据实施方案38所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述诱导型启动子调节根特异性或优先的表达。

45.根据实施方案38所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述诱导型启动子调节叶特异性或优先的表达。

46.根据实施方案1、3、5、8和11中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述遗传修饰包含在被上调或下调的所述基因的基因组序列中的非天然突变。

47.根据实施方案46所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述突变在启动子区域或蛋白编码区域内。

48.根据实施方案12至47中任一项所述的烟草植物或其部分，其中当熟化时，所述烟草植物能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

49.根据实施方案12至47中任一项所述的烟草植物或其部分，其中当熟化时，所述烟草植物能够产生具有USDA等级指数值与在相似条件下生长和熟化的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物具有除赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因以外基本上相同的遗传背景。

50.根据实施方案12至47中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物能够产生具有与来自不具有赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的叶相当的叶等级的叶。

51.根据实施方案12至50中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物具有与不具有赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物相当的总叶产量。

52.根据前述权利要求中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含选自以下的烟碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。

53.根据实施方案12至52中任一项所述的烟草植物或其部分，其中当在相当的生长条件下生长时，所述烟草植物包含的烟碱水平是不具有赋予降低的烟碱水平的所述突变或转基因的对照植物的烟碱水平的低于1％、低于2％、低于5％、低于8％、低于10％、低于12％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％或低于80％。

54.根据实施方案1至53中任一项所述的烟草植物的种群。

55.来自实施方案1至53中任一项所述的烟草植物的熟化烟草材料。

56.根据实施方案55所述的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料是通过选自以下的熟化工艺制成：烤制熟化、晾制熟化、明火烤制熟化和晒制熟化。

57.一种再造烟草，其包含根据实施方案55所述的熟化烟草材料。

58.一种烟草混合物，其包含根据实施方案55所述的所述熟化烟草材料。

59.根据实施方案58所述的烟草混合物，其中所述熟化烟草材料占所述烟草混合物中熟化烟草重量的约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

60.根据实施方案58所述的烟草混合物，其中所述熟化烟草材料占所述烟草混合物中熟化烟草体积的约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

61.一种烟草产品，其包含根据实施方案55所述的熟化烟草材料。

62.根据实施方案61所述的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。

63.根据实施方案61所述的烟草产品，其中所述烟草产品选自香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。

64.根据实施方案61所述的烟草产品，其中所述烟草产品选自再造烟草、散叶咀嚼烟草、塞式咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟和口含烟。

65.一种用于改善降低的生物碱的烟草植物中的叶片质量的方法，所述方法包括：

(a)培育降低的生物碱的烟草植物；

(b)上调编码以下的基因的表达或活性

(i)与选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列，或者

(ii)与选自由SEQ ID NO:18-32组成的组的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽序列；以及

(c)从所述烟草植物收获叶或种子。

66.一种用于改善降低的生物碱的烟草植物中的叶片质量的方法，所述方法包括：

(a)培育降低的生物碱的烟草植物；

(b)下调编码以下的基因的表达或活性

(i)与选自由SEQ ID NO:16-17组成的组的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列，或者

(ii)与选自由SEQ ID NO:33-34组成的组的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性或相似性的多肽序列；以及

(iii)从所述烟草植物收获叶或种子。

现在已经总体上描述了本公开，通过参考以下实施例将更容易理解本公开，所述实施例以说明方式提供，除非另有说明，否则并不旨在限制本公开。

实施例1：具有不同降低的烟碱水平的烟草品系的叶取样

通过抑制各种烟碱生物合成基因或通过突变调节基因座，获得具有不同程度的降低的烟碱水平的烟草植物(表8)。7个白肋烟草品系(BU21、HI BU21、LI BU21、LA BU21、TN90LC、TN90 PMT-RNAi和TN90 PR50-RNAi)和4个烤制熟化烟草品系(K326、K326PMT-RNAi、LAFC53和Brown&Williams低烟碱(“LN B&W”))在田间生长。表8提供了这11个品系的基因型和背景。

源自低生物碱古巴雪茄品种在两个基因座(即Nic1和Nic2)中的突变为低生物碱育种提供了来源。与BU21对照植物相比，LA BU21(同时携带nic1和nic2突变的低生物碱Burley 21)表现出90-97％的生物碱降低。与BU21对照植物相比，HI BU21(携带nic2突变的高中级Burley 21)表现出20-30％的生物碱降低。与BU21对照植物相比，LI BU21(携带nic1突变的低中级Burley 21)表现出65-75％的生物碱降低。PMT和PR50均参与烟碱的生物合成。相对于对照植物，PR50 RNAi和PMT RNAi品系分别表现出80％和～95％的烟碱降低(图1A和1B)。

这些低生物碱品系表现出不同的叶片质量(图1A至1D)。通常，低生物碱品系，特别是携带nic1和nic2双突变的低生物碱品系，导致了不利的叶表型，其特征是，例如产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高以及熟化后的最终产品质量差(图2)。例如，与TN90-RNAi和PR50-RNAi白肋烟品系相比，LA BU21显示出较差质量的紧密叶结构。相比之下，PMT-RNAi和PR50-RNAi白肋烟品系相对于LA BU21显示出改善的叶等级指数(图1A和1C)。与LA BU21相似，来自烤制熟化的LAFC53和LN B&W的叶片是薄体的、光滑的、深绿色的，并且质量差。此外，K326 PMT-RNAi品系显示出波状、中度成熟和阔叶，并且表现出相比于LAFC53更高的叶片质量(图1B和1D)。

在7个不同的时间点，其中包括开花和打顶后的6个时间点(打顶后1天、打顶后3天、打顶后1周、打顶后2周、打顶后3周和收获)，收集叶片编号8用于下一代测序分析(图3)。在4个不同的时间点，其中包括layby、开花、收获和熟化叶片样品，收集叶片编号5-7用于代谢物分析(图3)。每个时间点由三个独立收集的样品表示。这些三个样品用作生物复制品。

表8：转录和代谢谱分析中使用的烟草品系。

实施例2：具有不同降低的烟碱水平的烟草品系的RNA测序和代谢物分析

使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，MA)从实施例1所述的叶片样品中分离RNA。使用Agilent Plant RNA Nano Kit和2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Calif)检测RNA质量。构建231个cDNA文库，并使用TrueSeq RNA Library Prep Kit v.2(Illumina)进行索引。将由相同生物复制品制备的cDNA文库汇集在一起，并在Illumina HiSeq 2000上分析每一个汇集的复制品，生成100-bp的单读数，其中每个样品最少有3千万个读数。分析来自11个品种和7个时间点的样品的基因表达数据以鉴定叶片质量相关基因。将基因读数映射到内部烟草基因组数据库。使用CLC基因组工作台中的EdgeR执行差异基因表达分析。针对低生物碱品系与其相应的正常烟碱对照之间的差异表达过滤基因表达数据(图4)。对所有p值进行FDR调节，并且使用FDR校正的p值<0.05的截止值。

基于转录组分析，鉴定了来自白肋烟品种系列的218个基因和来自烤烟品种系列的200个基因在低生物碱品系和对照之间差异表达。这些基因属于38个功能类别(图5A-C)。418种基因功能中，有73种在烤烟品种和白肋烟品种中是共有的(图5D)。

同时进行代谢物分析以确定通过低生物碱品系的代谢途径的氮通量，并使代谢物数据与基因表达数据相关联(图4)。通过Metabolon Inc.使用UHPLC-MS/MS和GC-MS的组合进行鸟枪法代谢物组学。评估来自叶片的～900种化合物的相对水平。以高置信度鉴定这些化合物的子集，即来自白肋烟叶片的114种化合物(TN90和BU21系列组合)和来自烤烟叶片的62种化合物。然后将相关代谢物用于筛选和验证从转录组分析观察到的基因表达差异。

实施例3：选定的候选基因表达的确认

基于上述转录组和代谢物组的组合方法来鉴定差异表达的候选基因的列表。为了确定选定的候选基因的表达模式，在10-16个不同的组织样品(6个腋芽样品(打顶前和打顶后2小时、6小时、12小时、24小时和72小时)、打顶后24小时的幼叶、成熟叶、衰老叶、中脉、打顶前的茎、打顶后24小时的茎、茎端分生组织和两个根样品(打顶前和打顶后24小时))中进一步分析它们的表达。

简言之，使用TRI Reagent(Sigma-Aldritch,St.Louis,Mo)分离总RNA。为了去除DNA杂质，用无RNase的DNase(Turbo DNA-free,Ambion,Austin,TX)处理纯化的RNA。为了合成第一cDNA链，使用高容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)转录大约10μg的总RNA。为了测量样品中选定的基因转录物的水平，使用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)和基因特异性引物进行RT-PCR。通过实时基因表达验证，鉴定了在低生物碱和对照品系之间具有确定的差异表达的候选基因列表(表9和10)。这些基因提供了示例性的叶片质量基因(LQG)。

表9：用于通过过表达改善叶片质量的靶LQG基因。

表10：用于通过抑制改善叶片质量的靶LQG基因。

实施例4：含有RNAi或过表达构建体的转基因植物的开发

为了探究候选基因的功能，产生表达过表达候选基因的全长编码序列(表9)或用于下调抑制候选基因的RNAi序列(表10)的转基因植物。使用表达载体p 45-2-7(参见，例如US 2015/0173319中的SEQ ID NO:57)，该表达载体具有CsVMV启动子和NOS终止子，以及具有在actin2启动子指导下的卡那霉素选择标记物(NPT II)和NOS终止子的盒。使用农杆菌转化方法将携带目的转基因的核酸构建体引入烟草叶盘。参见，例如Mayo等，2006,NatProtoc.,1(3):1105-11和Horsch等，1985,Science 227:1229-1231。

简言之，苦行烟草植物(Tennessee 90(TN90))在洋红色盒生长，叶盘被切成15×150mm的板。通过在50ml离心管中以3500rpm离心20ml细胞悬液10分钟来收集包含靶质粒的根癌农杆菌。去除上清液，在40ml液体重悬培养基中重悬农杆菌细胞沉淀。将约25ml溶液转移到每个15×100mm培养皿中。在那些15×150mm的板中，将烟叶(避开中脉)被切成0.6cm的盘。倒置叶盘，加入MS/B5液体重悬浮培养基的薄层，并用#15剃须刀片制成切片。用细尖针均匀地戳叶盘。将8个盘倒置在每个再生板(15×100mm)中。加入根癌农杆菌悬浮液并孵育叶盘10分钟。

将叶盘转移至共培养培养皿(1/2MS培养基)，将盘倒置，使其与覆盖在共培养TOM培养基(含有20g/L蔗糖的MS培养基；0.1mg/L NAA和2.5mg/L BAP)上的滤纸接触。用封口膜密封培养皿并贴上适当标签。在24℃下，在暗光(60-80mE/mS)和18/6光周期中孵育培养皿三天。将叶盘转移到再生/选择TOMK培养基培养皿(具有300mg/l卡那霉素的TOM培养基)中，并在24℃下每两周在暗光中传代培养至相同的新鲜培养基中，直到嫩芽成为可切除的。用镊子从叶子中取出嫩芽，并插入含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中，在24℃和18/6光周期下以6080mE/mS的光强度生根。

当包含嫩芽和根的秧苗长到足够大时(例如，超过GA7盒子的一半)，将它们转移到土壤中以适应生长。在转移过程中，用自来水从根组织中洗涤凝胶。将建立的幼苗转移到温室中用于进一步分析和结种子。

实施例5：低生物碱品系中改善的叶片衰老。

与正常生物碱品系相比，低生物碱品系保持绿色更长时间。引发叶片衰老可导致叶绿素分解。叶片衰老可由各种环境刺激(environmental stressor)、发育线索和内源激素信号触发和促进。据报道，WRKY转录因子调节叶片衰老。特别地，提出拟南芥WRKY45通过调节一系列衰老相关基因(SAG)来加速衰老。参见Chen等，Molecular Plant,2017,10(9):1174-1189。

WRKY DNA结合蛋白45(WRKY45，g15911)在低生物碱品系中差异表达，并且在低生物碱烟草品系(例如，LA BU21或通过基因编辑敲除全部5个PMT基因的突变品系)中过表达，如实施例4中所述。在过表达品系中监测叶片衰老表型和叶片质量。

实施例6：低生物碱烟草叶片中细胞壁相关基因的修饰

植物细胞被富含多糖的细胞壁包围，所述细胞壁有助于确定植物体的整体形式、生长和发育。大多数植物细胞壁由纤维素微纤丝的框架组成，所述纤维素微纤丝通过被称为半纤维素和果胶的支链杂多糖彼此交联。疏水性木质素也沉积在整个次生壁，这导致细胞壁隔室脱水。该组合物增加了壁的强度并降低了它们的柔韧性。木葡聚糖是双子叶植物初生壁中的主要半纤维素，木聚糖是次生细胞壁中的主要半纤维素酶，并且木葡聚糖和木聚糖均交联纤维素微纤丝。如实施例4所述，细胞壁相关基因(g7893、gl7067和g67849)在低生物碱品种(例如，LA BU21或通过基因编辑敲除全部5个PMT基因的突变品系)中过表达。在过表达品系中测量叶片质量以表明这些细胞壁相关基因在烟草叶片质量中发挥作用。