可增强免疫力的渔用饲料添加剂及渔用饲料

技术领域

本发明涉及饲料添加剂领域。更具体地说，本发明涉及一种可增强免疫力的渔用饲料添加剂及渔用饲料。

背景技术

黄颡鱼是一种年产量高、肉质优良、经济效益好的淡水经济鱼种，近年来养殖规模日益增大。但黄颡鱼养殖过程中易受到细菌性传染病的影响，例如鲶爱德华氏菌感染引起的“裂头病”，维氏气单胞菌感染引起的腹水病等，给广大养殖户造成严重的经济损失。传统的抗生素治疗法存在药物残留和耐药性的风险，而疫苗预防法存在实际操作复杂和特异性强的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种可增强免疫力的渔用饲料添加剂及渔用饲料，采用营养调控方式，在饲料中添加有益于黄颡鱼免疫力的添加剂，增强黄颡鱼对抗病原的抵抗力。

本发明解决此技术问题所采用的技术方案是：一种可增强免疫力的渔用饲料添加剂，所述饲料添加剂包括牡丹籽种壳、牡丹籽油或两者的组合。

优选的是，所述饲料添加剂由牡丹籽种壳超微粉或牡丹籽油超微粉或两者的混合组成。

本发明还提供了一种添加所述饲料添加剂的渔用饲料，所述饲料中添加有质量分数为1％～5％的饲料添加剂。

优选的是，所述饲料的制备方法为称取对应质量的商品饲料和饲料添加剂混合，并在混合物中少量多次加入水，充分混匀，重新制成颗粒。

优选的是，所述水的添加量为所述饲料质量的10～30％。

本发明至少包括以下有益效果：本发明以药食兼用的功能性花卉——牡丹副产物为对象，将牡丹籽种壳和牡丹籽油按不同比例分别与商品化黄颡鱼饲料混合，探索牡丹副产物作为饲料添加剂的潜在价值，为解决牡丹副产物资源浪费和环境污染问题提供新的思路。

牡丹籽种壳和牡丹籽油安全、无毒、有效，可以作为替抗饲料或饲料添加剂使用，提高喂养物的机体免疫力，还能提高其抵抗环境压力和病菌感染的能力。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼血清超氧化物歧化酶活性的变化；

图2是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼血清溶菌酶活性的变化；

图3是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼血清补体C3含量的变化；

图4是饲喂对照组饲料的黄颡鱼肝脏组织图A；

图5是饲喂1％牡丹籽种壳的个别黄颡鱼肝脏组织图B；

图6是饲喂1％牡丹籽种壳的个别黄颡鱼肝脏组织图C；

图7是饲喂5％牡丹籽种壳的一尾黄颡鱼肝脏组织图D；

图8是饲喂5％牡丹籽种壳的另一尾黄颡鱼肝脏组织图E；

图9是饲喂1％牡丹籽油的一尾黄颡鱼肝脏组织图F；

图10是饲喂1％牡丹籽油的另一尾黄颡鱼肝脏组织图G；

图11是饲喂5％牡丹籽油的一尾黄颡鱼肝脏组织图H；

图12是饲喂5％牡丹籽油的另一尾黄颡鱼肝脏组织图I；

图13是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼肝脏超氧化物酶的活性的变化；

图14是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼肝脏过氧化氢酶的活性的变化；

图15是饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后黄颡鱼肝脏丙二醛的含量的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细、完整的说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。在结合实施例对本发明进行说明前，需要特别指出的是：本发明中在包括下述说明在内的各部分中所提供的技术方案和技术特征，在不冲突的情况下，这些技术方案和技术特征可以相互组合。

此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

600mL去离子水按少量多次的原则加入到1900g粉碎后的黄颡鱼商品饲料和100g牡丹籽种壳超微粉混合料中，充分混匀，直至所有超微粉和水与饲料混合均匀，立即制粒，即得。

实施例2

360mL去离子水按少量多次的原则加入到1764g粉碎后的黄颡鱼商品饲料和36g牡丹籽油超微粉混合料中，充分混匀，直至所有超微粉和水与饲料混合均匀，立即制粒，即得。

实施例3

360mL去离子水按少量多次的原则加入到1828g粉碎后的黄颡鱼商品饲料和72g牡丹籽油超微粉混合料中，充分混匀，直至所有超微粉和水与饲料混合均匀，立即制粒，即得。

一、材料和方法

1.材料

1.1材料和仪器

黄颡鱼商品饲料购自武汉大北农有限公司。超氧化物歧化酶、溶菌酶、补体C3、过氧化氢酶和MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

牡丹籽种壳和牡丹籽油均由武汉市农业科学院林业果树研究所提供。牡丹籽种壳由武汉中博水产生物技术有限公司(以下简称“中博公司”)粉碎为200目超微粉。牡丹籽种壳和牡丹籽油室温储存于阴凉、干燥、通风处。

制粒机购自九阳股份有限公司，超净工作台购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司，超纯水机购自德国Millipore公司，台式冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，自动制冰机购自日本SANYON公司。

1.2实验鱼

实验用黄颡鱼来自渔场，正式实验前将鱼在1×10

1.3实验饲料

实验用饲料由商品饲料粉碎再制所得。黄颡鱼商品饲料经粉碎机(中博公司提供)粉碎后，过2目筛网，选取颗粒均匀、无结块的粒质饲料与不同添加剂逐级混合，用双螺杆制粒机挤压成粒径1.5mm的颗粒饲料，60℃烘干2h，冷却后置于-20℃保存备用。具体如下：以1％牡丹籽种壳添加剂为例，准确称取1350g粉碎后商品饲料、15g牡丹籽种壳超微粉和300mL去离子水(辅助添加剂与饲料混合，用量为饲料总重量的20％)，按少量多次的原则将种壳超微粉和水加入饲料中，充分混匀，直至所有超微粉和水与饲料混合均匀，立即制粒。对照组饲料由1500g粉碎后商品饲料与300mL去离子水混匀，重新制成颗粒(原商品饲料为膨化饲料，再制饲料为沉性饲料)。

2.方法

2.1实验设计

实验采用武汉市农业科学院水产科学研究所中心实验室养殖系统。实验周期设置为21d，每7d换水一次，采取自然光照，水温14～16℃。每日投喂两次饲料(9:00和17:00)，采用饱食投喂策略。

饲养实验结束后，实验鱼禁食12h。取样前对所有实验鱼称重以计算终末体重。

2.2血清酶学指标测定

每组随机选取3尾黄颡鱼，用1mL注射器进行尾静脉取血。血液在室温静置2h后，转入4℃冰箱静置过夜。次日，4℃、3500rpm离心10min，收集血液上清作为血清样品，样品冻存于-80℃冰箱。采用黄嘌呤氧化酶法测定血清总超氧化物酶活性，采用比浊法测定血清溶菌酶活性，采用免疫浊度法测定血清补体C3含量，均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

2.3肝脏病理学观察

每组随机选取5尾黄颡鱼，从体侧线处解剖鱼体，取小块肝脏组织立即置入1.5mL4％多聚甲醛，室温固定24h以上。将肝脏小块从固定液中取出，在通风橱内用手术刀将组织修平整，将修切好的组织和对应标签放于脱水盒内。组织块经梯度酒精-二甲苯脱水、石蜡包埋，切成4μm薄片。载玻片捞起薄片后于60℃烘箱烘。切片经二甲苯-梯度酒精-水洗涤后，苏木素染细胞核、伊红染细胞质，最后将切片经梯度酒精-二甲苯脱水和透明，中性树胶封片。使用Pannoramic midi型全自动数字切片扫描系统拍摄肝脏组织，并放大20倍观察肝脏组织变化。

2.4肝脏酶学指标测定

肝脏切片样品取样结束后，剩余肝脏组织立即置入1.5mL离心管，于液氮中速冻，2h后转入-80℃冰箱保存。采用黄嘌呤氧化酶法测定肝脏总超氧化物酶活性，采用钼酸铵法测定肝脏过氧化氢酶活性，采用TBA(ThibabituricAcid，硫代巴比妥酸)法测定肝脏MDA(丙二醛)含量，均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

2.5数据处理

采用SPSS20.0统计软件处理实验数据。所有数值均以“平均值±标准差”表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05代表具有显著性差异，P<0.01代表具有极显著差异。

二、结果与分析

1.生长性能

饲养21d后，所有实验鱼均存活，没有出现死亡。如表1所示，对照组黄颡鱼体重没有明显增加，饲料中添加牡丹籽种壳或牡丹籽油的各实验组黄颡鱼体重也没有显著增加。由于饲养周期处于本年度11-12月，日均最低气温1～8℃，日均最高气温11～16℃，养殖水温14～16℃，温度偏低，不利于黄颡鱼摄食，可能是所有实验鱼体重增长不明显的主要原因。

表1饲料添加牡丹籽副产物对黄颡鱼生长性能的影响

2.血清酶学指标

2.1血清超氧化物歧化酶活性

图1显示了饲喂对照饲料和含有不同添加剂的饲料21天后，黄颡鱼血清超氧化物歧化酶活性的变化。饲料中添加牡丹籽种壳或牡丹籽油均能显著提高黄颡鱼血清超氧化物歧化酶的活性(P<0.01)，且5％剂量的提高效果优于1％剂量(P<0.01)，牡丹籽油的提高效果优于牡丹籽种壳。**代表P<0.01，*代表P<0.05，NS代表无显著性差异。

2.2血清溶菌酶活性

由图2可知，饲料中添加牡丹籽种壳或5％牡丹籽油均能显著提高黄颡鱼血清溶菌酶的活性(P<0.05或P<0.01)。与超氧化物歧化酶的变化不同的是，牡丹籽种壳提高溶菌酶活性的效果优于牡丹籽油。

2.3血清补体C3含量

由图3可知，饲料中添加5％牡丹籽种壳或牡丹籽油(1％、5％)均能显著提高黄颡鱼血清补体C3的含量(P<0.05或P<0.01)，且两者的提高效果没有太大差异。

对照组和各实验组已检测的黄颡鱼血清超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性和补体C3的含量汇总如表2。

表2

对照组和镉私聊添加剂组均检测3尾黄颡鱼血清。

3.肝脏病理学观察

如图4所示，饲喂对照组饲料的黄颡鱼肝脏组织致密紧实，肝细胞沿肝索排列整齐、结构清晰，偶见肝细胞空泡化(

与对照组黄颡鱼相比，饲喂各组添加剂的黄颡鱼肝脏组织整体情况良好，偶见个别鱼体肝脏的异常变化。具体而言，饲喂1％牡丹籽种壳的黄颡鱼(图5和6)，有个别出现黑色素沉积(

对照组和各实验组已检测的黄颡鱼肝脏组织学观察结果汇总如表3。ND代表未检测。对照组检测3尾黄颡鱼肝脏组织，各饲料添加剂组检测5尾黄颡鱼肝脏组织。

表3黄颡鱼肝脏组织病理学结果统计

4.肝脏酶学指标

4.1肝脏超氧化物酶活性

由图13可知，饲料中添加牡丹籽种壳或牡丹籽油均能显著提高黄颡鱼肝脏超氧化物酶的活性(P<0.01)，提高效果随着添加剂含量增加呈上升趋势。此外，1％剂量的牡丹籽种壳与1％剂量的牡丹籽油提高效果相当，当剂量提高至5％时，牡丹籽种壳的提高效果略优于牡丹籽油。

4.2肝脏过氧化氢酶活性

由图14可知，饲料中添加牡丹籽种壳或牡丹籽油均能显著提高黄颡鱼肝脏过氧化氢酶的活性(P<0.01)，提高效果随着添加剂含量增加也呈上升趋势。牡丹籽种壳和牡丹籽油提高黄颡鱼肝脏过氧化氢酶活性的效果没有太大差异。

4.3肝脏MDA含量

由图15可知，与肝脏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性增加相反的是，饲料中添加牡丹籽种壳或牡丹籽油均能显著降低黄颡鱼肝脏丙二醛的含量(P<0.01)，表明牡丹籽副产物能显著降低黄颡鱼肝脏的氧化损伤。对于牡丹籽种壳，5％剂量的降低效果优于1％剂量；对于牡丹籽油，剂量变化对于改善黄颡鱼肝脏氧化水平没有明显的区别。**代表P<0.01，NS代表无显著性差异。

对照组和各实验组已检测的黄颡鱼肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性和丙二醛(MDA)的含量汇总如表4，对照组和各饲料添加剂组均检测5尾黄颡鱼血清。

表4黄颡鱼肝脏酶学指标统计

三、讨论与结论

研究表明，饲料中添加牡丹籽种壳和牡丹籽油能有效提高黄颡鱼血清和肝脏抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶，血清中非特异性免疫指标溶菌酶活性和补体C3含量也比饲喂对照组饲料的黄颡鱼有所提高。牡丹籽种壳富含低聚芪类化合物，主要由白藜芦醇衍生物组成，具有抗氧化、降血糖、抗菌、抗癌和神经保护等生物活性；牡丹籽油含有较高的不饱和脂肪酸，也具有降血糖、降血脂、抗氧化和保护肝脏的作用。本试验以21天为周期，饲喂牡丹籽种壳和牡丹籽油的黄颡鱼血清和肝脏抗氧化酶活性和非特异性免疫指标均显著提高，表明黄颡鱼机体免疫力得到了有效增强，可能提高其抵抗环境压力和病菌感染的能力。对于肝脏的组织结构，饲喂牡丹籽副产物不会对黄颡鱼肝脏结构造成明显的影响。因此，牡丹籽种壳和牡丹籽油安全、无毒、有效，可以作为替抗饲料或饲料添加剂使用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。