一种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3及其应用。

背景技术

果胶裂解酶(PELs,EC4.2.2.2)属于果胶解聚酶，参与果胶的非水解性分解，通过β-消除裂解低酯化度果胶的α-1,4-糖苷键，并且在新形成的寡聚半乳糖醛酸的非还原端形成不饱和的C4-C5双键。

碱性果胶裂解酶在纺织行业中具有广泛的应用前景，主要可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺，与传统的高温碱煮练方法相比，具有保护纤维、降低能耗和环境友好等优势。

此外，碱性果胶裂解酶催化果胶产生的产物聚半乳糖醛酸寡糖对动植物具有良好的生物活性。寡聚半乳糖醛酸能够诱导植物防御，对烟草花叶病毒、小麦白粉病、苹果花叶病、玉米大斑病、棉花黄萎等植物疾病有良好的抗性作用，还能活化、促进益生菌双歧杆菌的生长，对维护肠道菌群平衡，抑制有害肠菌，合成各类微量元素，治疗便秘、腹泻等疾病，助消化，降低胆固醇，预防高血压，增强机体抵抗力等具有良好的促进作用。化学法多糖水解是利用浓硫酸、醋酸等水解果胶，其降解速度较快，可控性差，极易得到单糖而不易得到寡糖，降解产物复杂，均一性差，引入的化学试剂使得寡糖的分离纯化过程复杂化，产率低。酶法水解果胶的反应条件温和且特异性强，无副反应，反应过程可控，产物均一性好，具有良好的商业化生产前景。

因此，通过简便、易操作的方法提高碱性果胶酶的活性和稳定性，低成本生产碱性果胶酶在纺织工业、植物防治、食品保健等应用上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种活性和热稳定性提高的环化碱性果胶裂解酶。

为此，本发明提供了一种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3，通过在碱性果胶裂解酶PelK47EV132FR272W的N端连接Spytag多肽，C端连接Spycatcher多肽制备。所述环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的分子量大小为65kDa；所述碱性果胶裂解酶PelK47EV132FR272W的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种Spytag-Pel3-Spycatcher基因，所述Spytag-Pel3-Spycatcher基因编码上述环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3；所述Spytag-Pel3-Spycatcher基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体携带有上述Spytag-Pel3-Spycatcher基因。

具体的，上述重组表达载体的出发载体为pET28a。

具体的，上述重组表达载体通过在表达载体pET28a的BamHI和XhoI位点间插入Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段制备。

本发明还提供了一种重组表达菌株，所述重组表达菌株转化/转染有上述重组表达载体。

本发明还提供了上述重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计引物，通过PCR分别扩增出碱性果胶裂解酶PelK47EV132FR272W和Spycatcher的基因片段，再用连接PCR将两个片段相连接；

(2)设计引物，利用搭桥PCR将Spytag基因片段和步骤(1)中获得的基因片段相连，得到Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段；

(3)将Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段经限制性内切酶酶切处理，与经过相同酶切处理的载体pET28a进行酶连，酶连产物转化至克隆菌株大肠杆菌gold感受态中，筛选出阳性重组子，抽提质粒并测序；

(4)将测序正确的重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21感受态中，筛选出阳性重组子，获得环化碱性果胶裂解酶的重组表达菌株。

具体的，上述步骤(1)中所用引物包括

Pel3-F:CCCACCAAGGGATCAGGTAGTGGTTCAGGAAGTGCTGATT TAGGCCACCAG；

Pel3-R:GAACTTCCAGACTACCTGATCCATTTAATTTACCCGCACCC G；

Spycatcher-F:CGGGTGCGGGTAAATTAAATGGATCAGGTAGTCTGG AAGTTC；

Spycatcher-R:GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATATGAGCGTCAC CTTTAGTTG。

具体的，上述步骤(2)中所用引物包括

pET28a-spytag-F:GGTGGACAGCAATGGGTCGCGGATCCGCTCACAT CGTGATGGTG；

Spytag-pel3-F:CCGCTCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCAC CAAGGGATCAGG。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的这种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3利用多肽自发形成异肽键相结合的特点制备，热稳定性有显著提高，55℃处理30min，残余活性提高了1.5倍，酶活性和抗热聚集性也明显提高。其良好的热稳定性和简捷的制备过程在纺织工业绿色生物制造和生产健康产品聚半乳糖醛酸寡糖等领域有良好的商业化应用前景。此外，本发明提供的环化碱性果胶裂解酶重组表达菌株制备方法简便，成本低，有良好的工业应用前景。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例1中构建的环化碱性果胶裂解酶重组表达质粒的DNA电泳分析图；M:Marker，1:pET28a，2:pET28a-cyc-pel3，3:质粒pET28a-cyc-pel3经BamHI和XhoI双酶切处理后的载体片段。

图2是本发明实施例2中环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3重组表达SDS-PAGE分析图；M:Marker，1:环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3，2:碱性果胶裂解酶Pel3。

图3是本发明实施例3中碱性果胶裂解酶Pel3与环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3最适温度。

图4是发明实施例3中碱性果胶裂解酶Pel3与环化碱性果胶裂解酶最适pH测定结果。

图5是本发明实施例4中碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的热稳定测定结果。

图6是本发明实施例5中碱性果胶裂解酶Pel3(a)和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3(b)的抗热聚集性测定结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

本发明提供了一种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3，以Bacillussubtilis168来源的碱性果胶酶PEL168经分子改造后比酶活和热稳定性均有所提高的突变体PelK47EV132FR272W(简称Pel3)作为改造对象，在Pel3的N端连接Spytag多肽，在其C端连接Spycatcher多肽，Spytag与Spycatcher通过自发形成异肽键而相结合，使碱性果胶裂解酶Pel3在宿主表达细胞中以环化的形式进行过表达，得到环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3。碱性果胶裂解酶Pel3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备得到的环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的分子量大小为65kDa，编码环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的Spytag-Pel3-Spycatcher基因序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1序列为：

/>

SEQ ID NO.2序列为：

本发明还提供了一种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的重组载体，通过在表达载体pET28a的BamHI和XhoI位点间插入Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段制备。

本发明还提供了一种酶活性和热稳定性提高的环化碱性果胶酶的重组表达菌株，该重组表达菌株以大肠杆菌BL21为宿主菌，含有环化碱性果胶裂解酶编码基因Spytag-Pel3-Spycatcher的重组表达载体。

本发明还提供了上述重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计引物，包括

Pel3-F:CCCACCAAGGGATCAGGTAGTGGTTCAGGAAGTGCTGATT TAGGCCACCAG(SEQ IDNO.3)；

Pel3-R:GAACTTCCAGACTACCTGATCCATTTAATTTACCCGCACCC G(SEQ ID NO.4)；

Spycatcher-F:CGGGTGCGGGTAAATTAAATGGATCAGGTAGTCTGG AAGTTC(SEQ IDNO.5)；

Spycatcher-R:GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATATGAGCGTCAC CTTTAGTTG(SEQ IDNO.6)；

利用上述引物，通过PCR分别扩增出碱性果胶裂解酶Pel3K47EV132FR272W和Spycatcher的基因片段，再用连接PCR将两个片段相连接；

(2)设计引物，包括

pET28a-spytag-F:GGTGGACAGCAATGGGTCGCGGATCCGCTCACAT CGTGATGGTG(SEQ IDNO.7)；

Spytag-pel3-F:CCGCTCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCAC CAAGGGATCAGG(SEQID NO.8)；

利用搭桥PCR将Spytag基因片段和步骤(1)中获得的连接后基因片段相连，得到Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段；

(3)将Spytag-Pel3-Spycatcher基因片段经限制性内切酶酶切处理，与经过相同酶切处理的载体pET28a进行酶连，酶连产物转化至克隆菌株大肠杆菌gold感受态中，筛选出阳性重组子，抽提质粒并测序；

(4)将测序正确的重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21感受态中，筛选出阳性重组子，获得环化碱性果胶裂解酶的重组表达菌株。

下面通过具体实施例对本发明的环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3、重组表达载体、重组表达菌株的效果进行研究。

实施例1：构建环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的表达载体

根据Pel3-F/Pel3-R和Spycatcher-F/Spycatcher-R的核苷酸序列合成引物对，引物序列如下：

Pel3-F:CCCACCAAGGGATCAGGTAGTGGTTCAGGAAGTGCTGATT TAGGCCACCAG；

Pel3-R:GAACTTCCAGACTACCTGATCCATTTAATTTACCCGCACCC G；

Spycatcher-F:CGGGTGCGGGTAAATTAAATGGATCAGGTAGTCTGG AAGTTC；

Spycatcher-R:GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATATGAGCGTCAC CTTTAGTTG。

通过PCR扩增获得果胶裂解酶Pel3基因片段和Spycatcher基因片段。将所获取的两个目的片段在不加引物的前提下，PCR进行10轮循环扩增。再添加前后引物进行18轮循环扩增。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小正确后，利用DNA纯化试剂盒回收连接目的片段spycatcher-pel3。利用引物pET28a-spytag-F、Spytag-pel3-F、Spycatcher-R，将Spytag基因片段与spycatcher-pel3基因片段通过搭桥PCR连接。

pET28a-spytag-F序列为:GGTGGACAGCAATGGGTCGCGGATCCGCT CACATCGTGATGGTG；

Spytag-pel3-F序列为:CCGCTCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCACCAAGGGATCAGG。

PCR反应体系与扩增spycatcher-pel3基因片段相同。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA纯化试剂盒回收目的基因Spytag-pel3-Spycatcher片段。

将上述纯化的目的基因片段Spytag-pel3-Spycatcher用dPN1酶进行去甲基化处理，同时将质粒pET28a用BamH1和XhoI双酶切处理并琼脂糖电泳回收酶切后的线性载体。将目的基因片段和线性载体通过同源重组进行连接，连接产物转化大肠杆菌Gold后涂布于含有100μg/mLKana的LB平板，37℃过夜培养。将得到的转化子用引物pET28a-spytag-F和Spycatcher-R进行菌落PCR，筛选到含有果胶裂解酶基因的重组菌，抽提重组菌的质粒并进行测序验证。结果如图1所示，在pET28a的BamH1和XhoI酶切位点之间插入了Spytag、果胶裂解酶、Spycatcher的DNA片段，将该重组质粒命名为pET28a-cyc-pel3。

实施例2：环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的表达纯化

将实施例1中构建正确的表达质粒pET28a-cyc-pel3转入大肠杆菌BL21中，获得重组菌株E.coliBL21/pET28a-cyc-pel3。挑取适量的单菌落接种于含有100μg/mLKana的LB培养基中，37℃培养到菌体OD

实施例3：碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的酶活性测定

取等浓度的碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3，分别加入到2mL含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中启动酶促反应，55℃反应15min后，用3mL0.03M的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光值。

改变反应温度，在40-70℃之间测酶活，实验结果如图3所示，碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3最适反应温度均为55℃。

改变Tris-HCl和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH值，在7.5-10.5之间测酶活，实验结果如图4所示，碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3最适反应pH均为9.5。

实施例4、碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的热稳定性测定

取等浓度的碱性果胶裂解酶Pel3和环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3，在55℃水浴锅中分别孵育15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min。

55℃处理后的酶以上述实施例3的方法分别测定其酶活。以0h为100％，计算其他样品的残余酶活。实验结果如图5所示，环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel355℃处理30min后仍有将近75％的相对酶活，而碱性果胶裂解酶Pel3只剩约50％的残余活性，表明环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的热稳定性有显著提高。

实施例5、碱性果胶裂解酶Pel3与环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3的抗热聚集性测定

将等浓度的碱性果胶裂解酶Pel3与碱性环化果胶裂解酶cyc-Pel3分别置于55℃、65℃、75℃、85℃、90℃干浴锅中孵育20min。

SDS-PAGE分析样品的上清，结果如图6所示，碱性果胶裂解酶Pel3上清蛋白含量很低(图6a)，而碱性环化果胶裂解酶cyc-Pel3上清还有较为明显的蛋白，并伴随着产生了一定量的多聚体(图6b)。结果表明，相较于碱性果胶裂解酶Pel3，环化果胶裂解酶cyc-Pel3的抗热聚集性明显提高。

综上所述，本发明提供的这种环化碱性果胶裂解酶cyc-Pel3由碱性果胶裂解酶Pel3与一对能通过异肽键相结合的多肽Spytag/Spycatcher重组，分子量大小为65KDa，最适反应温度为55℃，最适pH9.5，相较于碱性果胶裂解酶Pel3，热稳定性有显著提高，55℃处理30min，残余活性提高了1.5倍，在纺织工业、植物防治、食品保健等应用上具有重要的意义。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。