L-plastin蛋白作为骨性关节炎疾病修饰药物的靶点的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉L-plastin蛋白作为骨性关节炎疾病修饰药物的靶点的应用。

背景技术

骨性关节炎(简称OA)发生发展过程中，软骨下骨髓水肿、骨囊肿形成及硬化。软骨下骨破骨细胞过度激活与OA进程密切相关。软骨下骨的骨重建活动和破骨细胞数量受到严格控制，破骨细胞数量在OA小鼠模型早期显著增加。有人提出：破骨细胞前体迁移到软骨层，并直接与肥大的软骨细胞接触，以降解骨软骨连接和关节软骨。目前用于OA治疗的药物主要有COX-2抑制剂用于延缓症状，尚无用于治疗OA的药物，我们研究发现，OA早期软骨下骨中破骨细胞诱导血管形成改变了关节缺氧环境，并导致软骨持续变性。研究表明，抑制破骨细胞异常激活可以从一开始就阻断异常的软骨下骨重建，延缓关节软骨退变。LPL是肌动蛋白捆绑蛋白，在破骨细胞融合中必不可少。我们发现，阻断LPL可有效延缓关节软骨退变。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了L-plastin蛋白作为骨性关节炎疾病修饰药物的靶点的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提出了L-plastin蛋白作为骨性关节炎疾病修饰药物的靶点的应用。

优选地，以L-plastin蛋白作为药物靶点在筛选延缓骨性关节炎软骨退变的应用。

优选地，针对L-plsatin蛋白为药物靶点在制备含有L-plastin蛋白抑制剂的药物的应用。

第二方面，本发明提出了L-plastin蛋白抑制剂在制备延缓骨性关节炎软骨退变的试剂中的应用。

第三方面，本发明提出了L-plastin蛋白作为药物靶点在制备诊断骨性关节炎软骨退变的试剂中的应用。

第四方面，本发明还提出了L-plastin蛋白作为药物靶点在制备防治骨性关节炎软骨软骨退变的试剂中的应用。。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明首先发现了L-plastin对OA软骨退变的影响，验证了L-plastin通过阻断破骨细胞成血管作用保持了软骨下骨及软骨的低氧环境稳定了HIF-1α含量与功能，从而维持了软骨的正常代谢延缓了OA软骨退变。

2、通过本发明的研究可进一步将L-plastin作为药物靶点用于骨关节炎的诊断与治疗。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。

图1为实施例1的ACLT组及WT组小鼠不同时间点关节软骨进行HE染色；

图2为实施例2的ACLT组及WT组小鼠不同时间点骨量分析发现；

图3为实施例3的ACLT组及WT组小鼠不同时间点抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)染色；

图4为实施例3的ACLT组及WT组小鼠不同时间点软骨及软骨下骨免疫组织化学(IHC)染色；

图5为实施例4的Lcp1敲除小鼠进行Micro CT骨量检测；

图6为实施例5的小鼠软骨及软骨下骨的破骨细胞TRAP染色；

图7为实施例6的小鼠软骨及软骨下骨HE染色；

图8为实施例7的小鼠软骨及软骨下骨Ⅱ型胶原免疫组化染色；

图9为实施例7小鼠软骨及软骨下骨软骨的ACAN+免疫组化染色；

图10为实施例8小鼠软骨及软骨下骨的MMP13免疫组化染色；

图11为实施例8小鼠软骨及软骨下骨的ADAMTS5蛋白免疫组化染色；

图12为实施例8小鼠软骨及软骨下骨的COLⅩ蛋白免疫组织化学染色；

图13为实施例9Lcp1基因敲除抑制破骨细胞诱导的血管生成；

图14为实施例10的Lcp1基因敲除血管生成情况；

图15为实施例11小鼠软骨下骨和软骨中的低氧状态；

图16为实施例11的基于18F-氟异硝唑(18F-FMISO)的PET/CT直接测量了活体小鼠关节中的O

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例通过前交叉韧带横断(ACLT)构建骨性关节炎小鼠模型，对ACLT组及WT组小鼠不同时间点关节软骨进行HE染色分析具体操作步骤如下：

ACLT骨关节炎造模：选在10％的水合氯醛的麻醉药,按照0.35ml/100g的浓度腹腔注射对小鼠进行麻醉。待小鼠麻醉后，将小鼠仰卧位固定于操作台上。选取右侧膝关节进行手术，用剃毛刀备皮，碘酒充分消毒后酒精脱碘。沿膝关节正中线做长约1cm纵行切口，切开皮肤，暴露膝关节。沿髌韧带内侧缘切开关节囊暴露膝关节，探查前交叉韧带的走行，切断前交叉韧带在胫骨平台前缘的止点，注意保护关节面，避免对关节软骨造成损伤。术后彻底止血后关闭关节囊及皮肤切口。

HE染色：切片标本经烤片、脱蜡、梯度酒精水化后苏木紫染色10秒，流水冲洗30秒；1％盐酸酒精分化液分化10秒，流水冲洗至光学显微镜下观察到细胞核呈蓝色为止；伊红染色1分钟，流水冲洗1分钟；显微镜下观察切片细胞核呈蓝色，细胞质呈红色为止。切片自然风干，中性树脂封片。

结果表明，在OA进展过程中，透明软骨(HC)的厚度减少，而钙化软骨(CC)的厚度逐渐增加，HC/CC的比率在8周时降至平均0.81(结果参见图1)。

实施例2

对造模后不同时间点骨量分析，在ACLT骨关节炎造模后0周、2周、4周、8周后使用MicroCT检测小鼠右下肢骨量。结果表明，ACLT后2周软骨下骨的骨量减少，骨体积/总体积(BV/TV)在34.3％-55.8％之间，但在ACLT后4周和8周，BV/TV增加至56.6％-76.2％(结果参见图2)。

实施例3

骨关节炎造模后不同时间点抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)染色及LPL免疫组化染色检测，在ACLT造模后0周、2周、4周、8周后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)染色及LPL+细胞数目的计算检测软骨及软骨下骨中破骨能力，发现，ACLT后的前两周迅速增加，并在2周后减少(结果参见图3)；软骨下骨中LPL+细胞的数量与TRAP+细胞的数量一致，即ACLT后的前两周迅速增加，并在2周后减少(结果参见图4)。

实施例4

本实施例在C57BL/6背景下，用CRISPR-Cas9基因编辑技术产生了Lcp1基因敲除小鼠。利用非同源重组修复引入突变的方式，造成Lcp1基因蛋白读码框移码，功能缺失。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经PCR产物测序确认，共获得1只目的基因蛋白读码框移码的F0代小鼠；F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得1个品系，共计6只阳性F1代小鼠。将获得的基因敲除杂合子小鼠(gene+/-，即后续所称的Lcp+/-)分成两部分：一部分杂合子小鼠与野生型小鼠交配，扩群繁育较多的杂合子小鼠；一部分杂合子小鼠自交，获得基因敲除纯合子小鼠(gene-/-，即后续所称的Lcp-/-本案所称的基因敲除小鼠。)，进行基因敲除效果验证和后续的表型分析。

对Lcp1

实施例5

TRAP染色用于观察软骨下骨的破骨细胞。具体操作步骤如下，取各组的软骨及软骨下骨石蜡切片，烤片：65℃恒温箱中烤片1-2小时；二甲苯脱蜡：二甲苯Ⅰ，10分钟；二甲苯Ⅱ，10分钟；水化：100％乙醇Ⅰ，10分钟；100％乙醇Ⅱ，10分钟；95％乙醇溶液，8分钟；80％乙醇溶液，8分钟；70％乙醇溶液，5分钟；50％乙醇溶液，5分钟；清洗去除乙醇：PBS冲洗3次，每次5分钟。然后进行TRAP染色。

TRAP染色结果显示：在ACLT后2周和4周，Lcp1-/-小鼠软骨下骨中的TRAP+细胞数量明显少于野生型组的(结果参见图6)。

实施例6

对Lcp1基因敲除小鼠进行HE染色，具体操作步骤如下：取不同组软骨及软骨下骨切片标本经烤片、脱蜡、梯度酒精水化后苏木紫染色10秒，流水冲洗30秒；1％盐酸酒精分化液分化10秒，流水冲洗至光学显微镜下观察到细胞核呈蓝色为止；伊红染色1分钟，流水冲洗1分钟；显微镜下观察切片细胞核呈蓝色，细胞质呈红色为止。切片自然风干，中性树脂封片。结果显示，在ACLT后4周和8周，Lcp1基因敲除小鼠的HC/CC比WT小鼠分别增加1.42和1.71倍(图7)。

实施例7

为了检测关节软骨的退变情况，对关节软骨进行了Ⅱ型胶原及ACAN+免疫组化染色。具体操作步骤如下，切片经过烤片、脱蜡、梯度酒精水化后进行抗原修复：置于0.01M枸橼酸缓存液(PH＝6.0)中进行修复，修复温度为60℃，时间为18-24小时。待修复结束，自然冷却至室温后取出切片；清洗去除抗原修复液：PBS冲洗3次，每次5分钟；灭活内源性过氧化物酶：3％H

结果显示：在ACLT后4周和8周，Lcp1敲除小鼠Ⅱ型胶原含量明显少于野生型组(结果参见图8)。在ACLT后4周和8周，Lcp1敲除小鼠ACAN+区域明显少于野生型组(结果参见图9)。

实施例8

对小鼠关节软骨及软骨下骨退变相关蛋白的检测，在ACLT造模后4周、8周对Lcp1敲除后小鼠及野生型小鼠检测MMP13、ADAMTS5、COLⅩ蛋白，通过免疫组化染色的方法进行检测，一抗MMP13(1:200；Proteintech,18165-

1-AP)、ADAMTS5(1:500；Thermo,PA5-27165)、COLⅩ(1:500；Abcam,ab260040)。结果显示：ACLT4周和8周后，在Lcp1敲除后，MMP13阳性的区域减少(结果参见图10)。ACLT4周和8周后，在Lcp1敲除后小鼠ADAMTS5蛋白阳性区域减少(结果参见图11)。ACLT4周和8周后，在Lcp1敲除后小鼠COLⅩ蛋白阳性区域减少(结果参见图12)。

实施例9

为了验证Lcp1基因敲除抑制破骨细胞诱导的血管生成，并阻止氧从软骨下骨向软骨的扩散的假设，我们首先对软骨下骨进行了微血管成像，具体操作如下：

首先，准备了10％的水合氯醛溶液，按照0.35ml/100g的浓度腹腔注射对各组小鼠进行麻醉；(2)然后用剪刀将小鼠胸腔剪开，暴露心脏；(3)用眼科剪轻轻剪开小鼠心脏的右心耳；(4)准备好20mL注射器，抽取生理盐水，将针头从小鼠心脏左心室刺入，进行注射，冲洗出小鼠体内的血液，此步骤重复两次；(5)准备好20mL注射器，抽取4％的多聚甲醛溶液，将针头从小鼠左心室刺入，进行注射，对小鼠股骨内血管进行内固定；(6)准备好5mL注射器，抽取配置好的血管染料，将针头从小鼠左心室刺入，进行注射，使小鼠血管中充满造影剂；(7)将小鼠放于4度恒温冰箱中过夜；(8)从恒温冰箱中取出小鼠，用剪刀分离小鼠股骨，并去除股骨上附着的软组织，(9)通过Micro CT对股骨进行扫描，检测其血管生成情况，并对其进行数据分析。

结果显示，在ACLT后4周和8周，野生型小鼠的血管体积增加，Lcp1敲除后的小鼠血管容积没有变化(结果参见图13)。

实施例10

为了进一步鉴定Lcp1基因敲除血管生成情况，我们评估了CD31hiEMCNhi血管的水平。具体操作如下：取各组切片在抗原修复后清洗去除抗原修复液：PBS冲洗3次，每次5分钟；灭活内源性过氧化物酶：3％H2O2溶液覆盖标本，室温避光孵育10分钟；清洗去除H2O2：PBS冲洗3次，每次5分钟；封闭：正常山羊血清专用封闭液覆盖标本，室温孵育30分钟；一抗孵育CD31(1:200；Abcam,ab182981)，EMCN(1:50；Santa Cruz,sc-65495)，：轻轻擦去封闭液，将稀释好的一抗溶液(用抗体稀释液)覆盖标本，于湿盒中4℃孵育过夜；次日，置于37℃孵箱复温30分钟；清洗富余的一抗：PBS冲洗3次，每次5分钟；二抗孵育：Alexa Fluor488绿色荧光二抗孵育CD31，Alexa Fluor 568红色荧光蛋白孵育EMCN。于湿盒中37℃孵育1小时；清洗富余二抗：PBS冲洗3次，每次5分钟；在共聚焦显微镜下观察，结果显示在ACLT后4周和8周，WT小鼠中CD31和EMCN阳性细胞的数量显著增加，而相比来说，Lcp1缺失中的小鼠中增加较少(结果参见图14)。此结果与血管体积水平验证结果一致。

实施例11

接下来，我们使用低氧探针测量软骨下骨和软骨中的低氧状态。使用匹莫硝唑试剂盒检测软骨及软骨下骨氧含量。各实验组小鼠处死前1小时腹腔注射吡莫硝唑60mg/kg。一级抗体与FITC试剂盒结合，以1:100稀释度检测吡莫硝唑。

匹莫硝唑免疫染色结果显示，在ACLT后4周和8周，在Lcp1小鼠中匹莫硝唑荧光强度高于WT小鼠的荧光强度(结果参见图15)。

为了进一步证实这些结果，我们使用基于18F-氟异硝唑(18F-FMISO)的PET/CT直接测量了活体小鼠关节中的O

以上结果表明，Lcp1基因敲除可阻止H型血管的形成，并维持软骨下骨和软骨中的缺氧环境。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海禾麦医学科技有限公司

<120> L-plastin 蛋白作为骨性关节炎疾病修饰药物的靶点的应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgccaccact gcccggcaag agg 23

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