剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品及用途。

背景技术

舒芬太尼是临床常用于术后镇痛治疗的阿片类镇痛药，为芬太尼N

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)是一种遗传标记，是指基因组水平上由于单核苷酸的变异，而引起的DNA序列的多态性。在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等形式表现，是一种新的遗传标志，可以为疾病的预测、诊断、治疗以及新型药物的研制提供可靠的有效的科学根据。

目前，还未有关于剖宫产患者术后镇痛用药尤其是舒芬太尼镇痛的个体化差异的相关报道，为此，本发明提供了剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品和检测方法，为剖宫产患者术后镇痛用药种类和剂量提供指导。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品及用途，为剖宫产患者术后镇痛用药种类和剂量提供指导。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品，包括检测CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343和/或OPRM1基因的SNP位点rs73568641的基因分型的产品。

可选的，包括用于扩增CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343的PCR扩增引物组1；和/或

用于扩增OPRM1基因的SNP位点rs73568641的PCR扩增引物组2；

可选的，所述PCR扩增引物组1包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

可选的，所述PCR扩增引物组2包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

可选的，还包括单碱基延伸引物组；

针对CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；和/或

针对OPRM1基因的SNP位点rs73568641的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

可选的，还包括PCR缓冲液、反应启动剂、dNTPs、PCR酶、碱性磷酸酶缓冲液、碱性磷酸酶、延伸酶、延伸缓冲液和/或反应终止液。

可选的，包括：

PCR扩增反应体系为：

2.5mM，dTTP和dUTP的浓度均为1.25mM

dNTPs去磷酸化反应体系：

单碱基延伸反应体系为：

度按照分子量设置，分子量为4000-6000

的引物浓度为7μM，分子量为6001-6500

的引物浓度9.3μM，分子量为6501-7100

的引物浓度为11.6μM，分子量为≥7101

的引物浓度为14μM

SBS-Polymerase,Terminator III 0.2；

总体积2.472。

可选的，所述产品包括引物组、检测试剂或试剂盒。

一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的方法，包括利用所述的剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品检测。

可选的，包括如下步骤：

以待测样品的基因组DNA为模板，加入PCR扩增反应体系中，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

向得到的PCR扩增产物中加入dNTPs去磷酸化反应体系，进行dNTPs去磷酸化反应，得到dNTPs去磷酸化反应产物；

向得到的dNTPs去磷酸化反应产物中加入单碱基延伸反应体系，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸产物；

纯化单碱基延伸产物，然后进行质谱测序。

可选的，所述PCR扩增反应的程序为：37℃保持10min；94℃保持15min；94℃保持30s，56℃保持30s，72℃保持1min，72℃保持5min，45个循环；4℃保存；或

所述dNTPs去磷酸化反应的程序为：37℃保持45min；85℃保持5min，4℃保存；

所述单碱基延伸反应的程序为：

所述的剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品具有在制备用于对剖宫产患者术后镇痛指导用药的产品中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品，包括检测CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343和/或OPRM1基因的SNP位点rs73568641的基因分型的产品；本发明研究发现CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343和OPRM1基因的SNP位点rs73568641的基因多态性是引起剖宫产患者术后镇痛药物如舒芬太尼药效学个体化差异的遗传因素之一，麻醉医生可以根据遗传学特点差异来决定术后患者镇痛药物的种类和剂量，以此提高患者麻醉及术后镇痛的满意度，因此，CYP2B6*4基因和OPRM1基因可以作为剖宫产患者术后镇痛用药相关基因，通过对上述剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型进行检测，为剖宫产患者术后镇痛用药种类和剂量提供指导。

2.本发明提供的一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的产品，采用多重PCR扩增的方法对CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343和OPRM1基因的SNP位点rs73568641进行扩增，本发明针对上述基因设计的PCR扩增引物组1和PCR扩增引物组2，所述PCR扩增引物组1包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR扩增引物组2包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，上述设计的这些引物不互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，同时多重PCR中的不同扩增片段均能得到充分的扩增，避免出现高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例中对照组CYP2B6*4rs2279343不同基因型产妇术后出现疼痛时间的对比；

图2是本发明实验例中对照组OPRM1 rs73568641不同基因型产妇术后出现疼痛时间的对比；

图3是本发明实施例1中1例产妇血标本的分析样例的质谱测序结果；

图4是本发明实施例1中另一例产妇血标本的分析样例的质谱测序结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中：

SBS-Polymerase,Terminator III为苏州吉玛提供的市售产品，目录号为J01001；

10xPCR缓冲液为市售产品；

Taq DNA聚合酶，购自QIAGEN HotStarTaq plus DNA Polymerase(1000)，货号203605；

UNG酶，购自赛默飞，货号EN0361；

rSAP缓冲液，购自NEB，货号M0371L；

rSAP酶，购自NEB，货号M0371L；

Terminator III Reaction Buffer，为上述SBS-Polymerase,Terminator III产品中自带；

Terminator Mix，为ddNTPs溶液，其中ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP浓度均为2.5Mm；ddTTP为苏州吉玛提供，ddATP、ddCTP、ddGTP购自SIGMA,GE等；

Desalt Resin，购自BIO-RAD，货号143-5451。

实施例1剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的试剂盒

本实施例提供了一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的试剂盒，包括：

PCR扩增引物组：

用于扩增CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343的PCR扩增引物组1，所述PCR扩增引物组1包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

用于扩增OPRM1基因的SNP位点rs73568641的PCR扩增引物组2，所述PCR扩增引物组2包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

单碱基延伸引物组：

针对CYP2B6*4基因的SNP位点rs2279343的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；

针对OPRM1基因的SNP位点rs73568641的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

进一步的，还包括

多重PCR扩增反应体系为下表：

表1、多重PCR扩增反应体系

dNTPs去磷酸化反应体系见下表：

表2、dNTPs去磷酸化反应体系

单碱基延伸反应体系为见下表：

表3、单碱基延伸反应体系

实施例2剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的方法

本实施例提供了一种剖宫产患者术后镇痛用药相关基因分型检测的方法，包括：

(1)、获取待测样品(用血液DNA提取试剂盒进行抽提，得到的基因组DNA)(2微升)为模板，同时设置20ng/μL的阳性对照(2微升，为293T细胞提取的基因组DNA)，及无核酸酶的水(2微升)为空白对照，分别加入实施例1的试剂盒中的PCR扩增反应体系中，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的程序为：37℃保持10min；94℃保持15min；94℃保持30s，56℃保持30s，72℃保持1min，72℃保持5min，45个循环；4℃保存，得到PCR扩增产物。

(2)向得到的PCR扩增产物中加入实施例1的dNTPs去磷酸化反应体系，进行dNTPs去磷酸化反应，所述dNTPs去磷酸化反应的程序为：37℃保持45min；85℃保持5min，4℃保存，得到dNTPs去磷酸化反应产物；

(3)向得到的dNTPs去磷酸化反应产物中加入单碱基延伸反应体系，进行单碱基延伸反应，所述单碱基延伸反应的程序为见下表，得到单碱基延伸产物。

表4、单碱基延伸反应的程序

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(4)、向得到单碱基延伸产物中加入20μL的Desalt Resin，进行纯化反应1小时，然后于3200g离心5min。

(5)使用移液枪吸取1μL的三羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA，3-hydroxypicolinicacid)点于样品靶上，干燥后，吸取1μL样品(纯化后样品的上清液)覆盖在基质上再次干燥后上机检测。

输入信息，建板。

将离心后的样品置于点样仪上，点样；

将点有样品的芯片置于质谱芯片槽上，质谱扫描获取延伸引物信息；

使用质谱配套软件对结果进行分析，实验例中1例产妇血标本的分析样例结果如图3所示，另一例产妇血标本的分析样例结果如图4所示。

实验例CYP2B6*4基因和OPRM1基因多态性对剖宫产患者术后镇痛效应的影响

1 资料与方法

1.1 一般资料

本发明研究已经过医院伦理委员会审批(批准号：IRB202102002RI)，并与患者家属签署知情同意书。选取2021年1月至2022年5月在苏州科技城医院行择期子宫下段剖宫产手术的作为本研究对象，根据随机数字表法将患者分为对照组和观察组。纳入标准：①美国麻醉医师学会(American Society of Anesthesiologists,ASA)Ⅰ-Ⅱ级；②择期手术；③椎管内麻醉下行子宫下段横切口剖宫产患者；④足月产。排除标准：①术前有慢性疼痛史；②有长期服药史；③有阿片类药物过敏史；④严重心肺功能异常；⑤严重肝肾功能异常；⑥精神异常及不合作者。

1.2麻醉及术后镇痛方法

产妇入室后常规行心电监护，吸氧，开放静脉通路，采集2ml静脉血放入紫色EDTA抗凝管，快速输入乳酸钠林格注射液。协助产妇取左侧卧位，常规铺巾消毒，1％利多卡因局麻后，于L2～3间隙行硬膜外穿刺，0.05mm腰麻针刺破蛛网膜后退出针芯，见脑脊液流出后将0.5％盐酸布比卡因注射液等比重缓慢注入蛛网膜下腔2ml，随后留置硬膜外导管。操作完成后，协助产妇仰卧位后测试腰麻阻滞平面，效果不佳时硬膜外给予盐酸利多卡因注射液直至效果满意。

皮肤缝合结束时连接静脉PCA泵：枸橼酸舒芬太尼注射液(宜昌人福，1ml，50ug)100ug+0.9％生理盐水稀释至100ml，背景剂量2ml/h，PCA量2ml/次，锁定时间30min。将产妇送至病房后，麻醉医生告知产妇和家属静脉PCA泵和PCA按钮的使用方法，并进行相应的宣教；记录每个产妇使用镇痛泵的号码，以备在无线镇痛系统(iPainfree疼痛管理信息系统软件)上核验观察指标数据的准确性。

1.3观察指标

采用数字评分法(NRS)评估术后第一天、第三天、第七天的疼痛程度；观察患者从切口缝合后到出现疼痛的时间、PCA按压次数；观察术后产妇不良事件的发生率。

1.4基因检测方法

产妇血标本采集后立即在-80℃冰箱内保存，用血液DNA提取试剂盒进行抽提，得到基因组DNA按照实施例2的方法进行质谱检测，根据结果进行基因CYP2B6*4(rs2279343)和OPRM1(rs73568641)的基因型分析。

1.5统计学方法

使用SPSS25.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差

2结果

2.1产妇一般资料及基因型检测结果

本发明研究共纳入101例产妇，对产妇分别进行基因CYP2B6*4(rs2279343)和OPRM1(rs73568641)的基因型分析时结果显示，CYP2B6*4rs2279343中GA组55例，AA组38例，GG组8例；OPRM1rs73568641中TT组97例，TC组4例。每组不同基因型在年龄、身体质量指数(BMI)、手术时间等一般资料比较时亦无统计学差异(P＞0.05)，具体见下表。

表5、两组不同基因型产妇一般资料的比较

2.2两种基因不同基因型产妇在术后NRS评分、PCA按压次数及术后不良反应的比较

CYP2B6*4的rs2279343不同基因型产妇在术后数字疼痛评分(NRS)比较时，GG组产妇与GA组和AA组产妇相比术后7天NRS评分较低，差异有统计学意义(P＜0.05)，术后1天和术后3天NRS评分没有统计学差异(P＞0.05)，见下表。OPRM1 rs73568641不同基因型产妇在术后NRS评分比较时，TT组术后3天NRS评分低于TA组，差异有统计学意义(P＜0.05)，术后1天和术后7天NRS评分虽然也较TA组低，但差异没有统计学意义(P＞0.05)，见下表。两种基因不同基因型产妇在PCA按压次数、术后恶心呕吐上均无统计学差异(P＞0.05)。

表6、CYP2B6*4rs2279343术后NRS、PCA按压次数及术后不良反应的比较

表7、OPRM1 rs73568641术后NRS、PCA按压次数及术后不良反应的比较

2.4两种基因不同基因型产妇术后疼痛开始时间的比较

两种基因不同基因型产妇术后回病房后疼痛开始的时间(h)均无统计学差异(P＞0.05)，见图1-2，图1中CYP2B6*4rs2279343不同基因型产妇术后出现疼痛的时间无统计学差异LogRankχ2＝1.170，P＝0.557，图2中OPRM1 rs73568641不同基因型产妇术后出现疼痛的时间无统计学差异LogRankχ2＝0.088，P＝0.766。

3讨论

舒芬太尼是临床常用的阿片类镇痛药，为芬太尼类纯μ型阿片受体激动剂，亲和力和镇痛效果均优于芬太尼，通过直接与患者的脊髓、延髓和中脑等痛觉传导区域的μ受体结合，产生镇痛效应，一般被用于术后静脉自控镇痛。但其存在镇痛效果个体差异大，术后有恶心呕吐等缺点。本发明研究筛选发现CYP2B6*4中rs2279343和OPRM1中rs73568641的不同基因组与患者术后NRS相关，且CYP2B6*4突变纯合子GG组的患者未发现OPRM1突变CT组的患者，说明CYP2B6*4rs2279343和OPRM1 rs73568641的变异无相关性。CYP2B6*4rs2279343不同基因组在术后NRS、PCA按压次数和PCA泵液用量比较时，GG组相比GA组和AA组，术后7天NRS降低，但术后1、3天NRS，PCA按压次数和PCA泵液用量无明显差异。其原因可能是舒芬太尼是在肝脏微粒体中代谢，细胞色素P450酶与N-脱烷基酶活性有高度的相关性，CYP2B6*4rs2279343的野生型纯合子是AA，A突变为G后，突变后的基因型不能表达稳定的CYP2B6，导致CYP2B6酶活性降低，编码蛋白质的功能降低，GG组代谢速度最慢，致使舒芬太尼代谢速度存在个体化差异。此结果表明CYP2B6*4可能是引起剖宫产患者术后远期舒芬太尼镇痛个体化差异的遗传因素之一。

OPRM1 rs73568641基因共有TT、CT和CC三组亚型，C为突变基因，但CC组发生率低，一项加拿大的研究表明，欧美种族CC亚型的发生率为2.85％，然而，本研究中未能检测出CC亚型，其原因可能与样本量偏少或亚裔种族因素有关。本研究发现术后3天NRS，CT组相较TT组有显著增加，阿片类药物的使用量增加会造成疼痛评分增加，即表明OPRM1rs73568641突变的C等位基因增加阿片类药物的使用，这可能与OPRM1中的SNP与存在的阿片类数量及其功能直接相关，因OPRM1直接编码阿片受体，当出现突变后基因型时，其镇痛效果差异能够较早显现；CT组相比TT组术后7天NRS虽增加，但无统计学差异，原因可能是随着时间推移，患者对疼痛的耐受性有所提高。

CYP2B6*4rs2279343和OPRM1 rs73568641不同基因组在患者回病房开始疼痛的时间无统计学差异，这可能是因为椎管内麻醉布比卡因作用时间较长，且此基因多态性不是影响布比卡因个体化差异的遗传因素。此外，舒芬太尼主要的不良反应有恶心、呕吐等，但本研究结果显示，CYP2B6*4rs2279343和OPRM1 rs73568641各基因组患者恶心呕吐发生率没有差异，这表明此基因不是影响剖宫产患者术后恶心呕吐发生的主要因素。

综上所述，CYP2B6*4和OPRM1基因多态性是引起剖宫产患者术后舒芬太尼药效学个体化差异的遗传因素之一，麻醉医生可以根据遗传学特点差异来决定术后患者镇痛药物的种类和剂量，以此提高患者麻醉及术后镇痛的满意度。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。