一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用。

背景技术

一些重金属元素(如铅、镉、汞、铬等)，已知没有任何生物学功能，在极低浓度时就对生物体产生毒性。此外，这类元素在自然环境中无法生物降解并具有生物蓄积性。近年来全球经济的迅猛发展，导致了“重金属的再分布”，由此引发了一系列严重的污染事件，环境保护越来越成为世界范围内普遍关注的问题。对环境重金属毒物进行合理、准确的监测是开展污染防控的前提。全细胞生物传感器通过模拟环境生物感知可生物利用形态的重金属，整合了环境污染理化监测及生物监测等传统手段的功能，对预测有毒重金属生态毒性及环境风险意义重大，有望成为主流仪器检测手段的有力补充。

以天然色素合成基因簇作为报告基因模块，突破传统生物传感信号过度依赖仪器读取的瓶颈，有望实现基于颜色变化的成本低廉、快速响应、降低仪器依赖性的重金属生物传感，肉眼识别重金属的暴露，相关研究鲜有报道。

紫色杆菌素是由紫色色杆菌产生的脂溶性色素。近年来，随着紫色杆菌素合成途径的阐明，其异源合成已成为可能。基于最近阐明的紫色杆菌素分支生物合成途径，其中间体Proviolacein(PV)是一种绿色素。目前尚未有以PV衍生物为输出信号的铅离子微生物全细胞生物传感器的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用。

第一方面，本发明要求保护一种重组菌。

本发明所要求保护的重组菌是通过向受体菌中导入重组载体A后所得。

所述重组载体A中含有DNA片段A。

在所述DNA片段A上，含有pbr双向启动子，所述pbr双向启动子的一侧为PbrR蛋白编码基因，另一侧为Proviolacein(PV)合成基因簇vioABDE。

所述Proviolacein(PV)合成基因簇vioABDE以四顺反子形式组装，编码VioA蛋白、VioB蛋白、VioD蛋白和VioE蛋白。

所述pbr双向启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第442-526位。

所述PbrR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述VioA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

所述VioB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述VioD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

所述VioE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

所述PbrR蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第7-441位的反向互补序列。

所述VioA蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第569-1825位。

所述VioB蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1843-4839位。

所述VioD蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第4857-6008位。

所述VioE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第6026-6601位。

进一步地，所述醇溶性PV合成基因簇vioABDE的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第569-6601位。

更进一步地，所述DNA片段A的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

所述重组载体A为将所述DNA片段A替换pET-21a(+)质粒的酶切位点BglII和SacI之间的小片段后所得。

进一步地，所述受体菌为大肠杆菌。

在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。

第二方面，本发明要求保护一种成套产品。

本发明所要求保护的成套产品，包含：

(A1)前文第一方面中所述的重组菌；和

(A2)正丁醇。

进一步地，所述成套产品还可包含如下：

(A3)氧化剂。

在本发明的一个实施例中，所述成套产品由所述(A1)和所述(A2)组成。

在本发明的另一个实施例中，所述成套产品由所述(A1)、所述(A2)和所述(A3)组成。

在本发明的具体实施方式中，所述氧化剂为双氧水，具体为30％双氧水(质量分数，基质为水)。

第三方面，本发明要求保护如下应用：

(B1)前文第一方面中所述重组菌或前文第二方面中所述的成套产品在制备以Proviolacein(PV)衍生物为双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器中的应用。

(B2)前文第一方面中所述重组菌或前文第二方面中所述的成套产品在检测铅离子中的应用。

进一步地，所述检测铅离子为对液体样本进行铅离子的定性和/或定量检测。

第四方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法一：一种检测液体样本中是否含有铅离子的方法，为方法A或方法B或方法C或方法D：

方法A：非氧化条件下菌液观察法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇涡旋震荡5min(萃取)，将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，观察所述萃取液颜色变化，若观察到褐色的显色反应，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子。

方法B：氧化条件下菌液观察法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)涡旋震荡5min(萃取)，将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，观察所述萃取液颜色变化，若观察到绿色的显色反应，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子。

方法C：非氧化条件下A652值检测法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定A652值，简称所述待测液体样本组的A652值；若所述待测液体样本组的A652值显著大于对照组的A652值，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子；其中，所述对照组的A652值的测定方法与所述待测液体样本组的A652值的测定方法相比差别仅在于将所述待测液体样本替换为不含有铅离子的液体样本。

方法D：氧化条件下A652值检测法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定A652值，简称所述待测液体样本组的A652值；若所述待测液体样本组的A652值显著大于对照组的A652值，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子；其中，所述对照组的A652值的测定方法与所述待测液体样本组的A652值的测定方法相比差别仅在于将所述待测液体样本替换为不含有铅离子的液体样本。

方法二：一种检测液体样本中铅离子含量的方法，可为方法E或方法F：

方法E：非氧化条件下A652值检测法，可包括如下步骤：

(e1)将前文第一方面中所述重组菌置于系列已知浓度的铅离子液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇，涡旋震荡5min后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定A652值，然后根据铅离子浓度和A652值绘制标准曲线；

(e2)以待测液体样本替换步骤(e1)中的系列已知浓度的铅离子液体样本，重复步骤(e1)，得到所述待测液体样本的A652值，代入所述标准曲线，得到所述待测液体样本中铅离子含量。

方法F：氧化条件下A652值检测法，可包括如下步骤：

(f1)将前文第一方面中所述重组菌置于系列已知浓度的铅离子液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定A652值，然后根据铅离子浓度和A652值绘制标准曲线；

(f2)以待测液体样本替换步骤(f1)中的系列已知浓度的铅离子液体样本，重复步骤(f1)，得到所述待测液体样本的A652值，代入所述标准曲线，得到所述待测液体样本中铅离子含量。

进一步地，所述方法(氧化条件下A652值检测法)适用于所述待测液体样本中含有0.183nM以上(如0.732nM以上)铅离子的情况。所述方法(非氧化条件下A652值检测法)适用于所述待测液体样本中含有5.86nM以上铅离子的情况。

在本发明的具体实施方式中，所述氧化剂为30％ H

在上述各非氧化处理的方法中，正丁醇的加入量为：每900μL的含所述重组菌的培养体系中加入180-360μL的正丁醇。

在上述各氧化处理的方法中，正丁醇的加入量为：每900μL的含所述重组菌的培养体系中加入180-360μL的正丁醇；氧化剂(如30％ H

当所述待测液体样本自身为无色或者叠加显色反应后能够与自身颜色相区分(肉眼可辨)时，所述方法一优选采用肉眼观察法(即所述方法A和所述方法B)进行结果判定。当所述待测液体样本叠加显色反应后很难与自身颜色相区分(肉眼不可辨)时，所述方法一优选采用A652值测定法(即所述方法C和所述方法D)进行结果判定。

在上述各方面中，所述待测液体样本可为疑似含有铅离子的纯化水、自来水、湖水或土壤提取物溶液。

在上述各方面中，所述铅离子为二价铅离子(Pb(II))。

在上述各方面中，所述铅离子优选以可溶性二价铅盐形式存在，如醋酸铅、氯化铅、硝酸铅等。

本发明重组菌可用于环境样本可生物利用形态的铅离子的定性及定量检测。

附图说明

图1为重组菌响应铅离子传感分子机制图。

图2为重组菌铅离子响应时间-色素积累曲线。A为非氧化处理组时间-色素积累曲线；B为氧化处理组时间-色素积累曲线；C为非氧化处理组萃取液照片；D为氧化处理组萃取液代表性照片。

图3为重组菌铅响应剂量-效应关系。A为非氧化处理组剂量-色素积累关系；B为氧化处理组剂量-色素积累关系；C为非氧化处理组可定量的剂量-色素积累曲线；D为氧化处理组可定量的剂量-色素积累曲线；E为氧化处理组及非氧化处理组萃取液代表性照片。

图4为重组菌响应选择性及抗干扰能力。A为重组菌响应不同金属离子的色素积累非氧化处理；B为重组菌响应不同金属离子的色素积累氧化处理；C为重组菌响应不同金属离子混合物的色素积累非氧化处理；D为重组菌响应不同金属离子混合物的色素积累氧化处理。

图5为重组菌检测人工污染铅的环境样本。A为非氧化处理组剂量-色素积累关系；B为非氧化处理组可定量的剂量-色素积累曲线；C为氧化处理组剂量-色素积累关系；D为氧化处理组可定量的剂量-色素积累曲线；E为非氧化处理组萃取液代表性照片；F为氧化处理组萃取液代表性照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、以醇溶性Proviolacein(PV)衍生物为双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器的构建及应用

一、重组质粒pPb-vioABDE的构建

第一步，以pET-21a(+)为载体，全基因合成PV合成基因簇vioABDE(如SEQ IDNo.1的第569-6601位所示)，利用NdeI/SacI插入至pET-21a(+)中，将经测序验证正确的重组质粒命名为pET-vioABDE。

pET-vioABDE的结构描述：将pET-21a(+)载体的NdeI/SacI之间的小片段替换为SEQ ID No.1的第569-6601位所示DNA片段的重组质粒。

第二步，全基因合成pbrR-pbr promoter基因模块(如SEQ ID No.1的第7-526位所示)，利用BglII/XbaI插入至pET-vioABDE中，将经测序验证正确的重组质粒命名为pPb-vioABDE。

pPb-vioABDE的结构描述：将pET-21a(+)载体的BglII/XbaI之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段的重组质粒。

SEQ ID No.1的第7-526位为pbrR-pbr bidirectional promoter序列，为二价铅离子Pb(II)感应元件。其中，SEQ ID No.1的第442-526位为pbr双向启动子的核苷酸序列，SEQ ID No.1的第7-441位为pbrR基因的反向互补序列，编码SEQ ID No.2所示PbrR蛋白。

SEQ ID No.1的第569-6601位为vioABDE，以四顺反子形式进行组装，编码4个蛋白。SEQ ID No.1的第569-1825位为vioA基因，编码SEQ ID No.3所示VioA蛋白。SEQ IDNo.1的第1843-4839位为vioB基因，编码SEQ ID No.4所示VioB蛋白。SEQ ID No.1的第4857-6008位为vioD基因，编码SEQ ID No.5所示VioD蛋白。SEQ ID No.1的第6026-6601位为vioE基因，编码SEQ ID No.6所示VioE蛋白。

当有铅离子出现时，激活4个基因转录及翻译，生产的4个色素合成酶以色氨酸为底物，催化生成Proviolacein(PV)，但PV作为中间体是不稳定的，经正丁醇萃取后，非氧化静置或氧化静置，可分别生产褐色或绿色。分子机制图如下图1所示。

二、重组菌TOP10/pPb-vioABDE的构建

将步骤一构建的重组质粒pPb-vioABDE转化至大肠杆菌TOP10中，得到TOP10/pPb-vioABDE。

三、对铅离子的时间剂量响应

1.将步骤二构建的重组菌TOP10/pPb-vioABDE接种至含50μg/mL ampicillin的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，过夜振荡培养8-12小时(仅为菌种的活化)。

2.接种1％(体积比)的过夜培养菌液至新鲜的LB培养基(含50μg/mLampicillin)，补加Pb(II)(具体采用的是醋酸铅，其他可溶性二价铅盐都可以)至终浓度分别为0,0.15,1.5μmol/L，于37℃，250rpm振荡培养，间隔1h取样(2×1mL)4℃存放。取样时间分别为0、1、2、3、4、5、6、7小时。

3.取完1-7h菌液后，各组取100μL检测菌液浓度(OD600)。

4.非氧化处理组(褐色)：900μL菌液中加入180μL正丁醇，涡旋震荡5min。

5.氧化处理组(绿色)：900μL菌液中加入180μL正丁醇+50μL 30％H

6.3500rpm，离心5min，将非氧化及氧化组的萃取液常温静置6h后吸取100μL上清有机相，置于96孔板中，测652nm吸光值。结果如表1、表2和图2所示。

表1、不同时间点非氧化组色素A652检测值

表2、不同时间点氧化处理组色素A652检测值

上述结果表明，重组菌响应铅(II)存在剂量-响应、时间-响应关系。即随着诱导时间的延长，色素产生升高，5h后显色肉眼可见，且升高不明显。故选5h培养为检测时间。

四、对不同浓度铅离子的响应

1.将步骤二构建的重组菌TOP10/pPb-vioABDE接种至含50μg/mL ampicillin的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，过夜振荡培养8-12小时(仅为菌种的活化)。

2.接种1％(体积比)的过夜培养菌液至新鲜的LB培养基(含50μg/mLampicillin)，以2倍稀释法加Pb(II)(具体采用的是醋酸铅，其他可溶性二价铅盐都可以)至终浓度分别为0,0.0915，0.183，0.366，0.732，1.46,2.93,5.86,11.7,23.4,46.9,93.8,187.5,375,750,1500,3000，6000或12000nmol/L，于37℃，250rpm振荡培养5h。

3.收集各组菌液(2×1mL)，取100μL检测菌液浓度(OD600)。

4.非氧化组：900μL菌液中加入360μL正丁醇，涡旋震荡5min；氧化组：900μL菌液则加入360μL正丁醇+50μL 30％ H

5.3500rpm，离心5min，将两种条件下的萃取液常温静置6h后吸取100μL上清有机相，置于96孔板中，测652nm吸光值。结果如表3和图3所示。

表3、重组菌对不同浓度铅离子的色素响应检测结果

上述结果表明，重组菌TOP10/pPb-vioABDE响应铅(II)存在明显的剂量效应关系，随着铅暴露剂量的升高，色素产生提高，1500nM以后色素积累达到稳定。

氧化处理后检测的检测限会低一些，即0.183nM(t test,与0nM比有统计学差异)非氧化的，检测限会高一些，即5.86nM(t test,与0nM比有统计学差异)。

五、对金属离子的选择性响应

1.将步骤二构建的重组菌TOP10/pPb-vioABDE接种至含50μg/mL ampicillin的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，过夜振荡培养8-12小时(仅为菌种的活化)。

2.接种1％(体积比)的过夜培养菌液至新鲜的LB培养基(含50μg/mL ampicillin氨苄西林)。

3.单个金属选择性考察---向步骤2的培养体系中加入如下单个金属离子，Pb(II),Cr(III),Hg(II),Zn(II),Mg(II),Ni(II),Mn(II),Ca(II),Fe(II),Cd(II)或Cu(II)，终浓度均为1.5μM。于37℃，250rpm，振荡培养5h。

4.混合金属(抗干扰能力)考察---向步骤2的培养体系中加入如下离子混合，终浓度为1.5μM(各组中各离子等摩尔混合)。Pb(II),Pb(II)+Cr(III),Pb(II)+Hg(II),Pb(II)+Zn(II),Pb(II)+Mg(II),Pb(II)+Ni(II),Pb(II)+Mn(II),Pb(II)+Ca(II),Pb(II)+Fe(II),Pb(II)+Cd(II)，Pb(II)+Cu(II)，上述涉及到的各种离子包括Pb(II)，或者上述涉及到的各种离子不包括Pb(II)。于37℃，250rpm，振荡培养5h。

5.对照组不加金属盐，于37℃，250rpm，振荡培养5h。

6.收集各组菌液(2×1mL)，取100μL检测菌液浓度(OD600)。

7.非氧化组：900μL菌液中加入360μL正丁醇，涡旋震荡5min；氧化组：900μL菌液则加入360μL正丁醇+50μL 30％ H

8.3500rpm，离心5min，将两种条件下的萃取液常温静置6h后吸取100μL上清有机相，置于96孔板中，测652nm吸光值。结果如表4、表5和图4所示。

表4、重组菌响应各种金属离子产生色素的吸光度

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表5、重组菌响应混合金属产生色素的吸光度

上述结果表明，单个金属选择性考察结果表明重组菌TOP10/pPb-vioABDE对Pb(II)呈现了高度专一性的响应，只有铅暴露组出现了明显的色素产生。混合金属(抗干扰能力)考察结果表明仅有汞和镉的掺入降低了重组菌TOP10/pPb-vioABDE对铅的响应，此外，所有含Pb(II)的培养物都有明显的色素产生，表现了较好的抗干扰能力。

六、环境样本中生物传感器对Pb(II)的剂量响应

1.将步骤二构建的重组菌TOP10/pPb-vioABDE接种至含50μg/mL ampicillin的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，过夜振荡培养8-12小时(仅为菌种的活化)。

2.以纯化水、自来水、湖水及土壤提取液为基质(用量为90％体积)，配制液体LB培养基。

3.接种1％(体积比)的过夜培养菌液至新鲜的上述四种LB培养基(含50μg/mLampicillin)。

4.将Pb(II)(具体采用的是醋酸铅，其他可溶性二价铅盐都可以)以2倍稀释法加入。

非氧化组检测范围相对氧化组较小，加入Pb(II)至终浓度分别为0,1.46,2.93,5.86,11.7,23.4,46.9,93.8,187.5,375,750nM。

氧化组则加入Pb(II)至终浓度分别为0,0.0915，0.183，0.366，0.732，1.46,2.93,5.86,11.7,23.4,46.9,93.8,187.5,375,750nM。

于37℃，250rpm振荡培养5h。

5.收集各组菌液(2×1mL)，取100μL检测菌液浓度(OD600)。

6.非氧化组：900μL菌液中加入360μL正丁醇，涡旋震荡5min；氧化组：900μL菌液则加入360μL正丁醇+50μL 30％ H

7.3500rpm，离心5min，将两种条件下的萃取液常温静置6h后吸取100μL上清有机相，置于96孔板中，测652nm吸光值。结果如表6、表7和图5所示。

表6、不同环境样本铅响应色素产生的非氧化组检测结果

注：非氧化处理后不同环境样本中铅离子的检测限为5.86nM(t test,与0nM比有统计学差异)。

表7、不同环境样本铅响应色素产生的氧化组检测结果

注：氧化处理后不同环境样本中铅离子的检测限为0.732nM(t test,与0nM比有统计学差异)。

上述结果表明，该重组菌可响应不同环境样本中的铅(II),并在一定范围内可绘制铅暴露剂量-色素响应曲线，具有定量检测环境铅污染的应用潜力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。