一种鹿茸提取物、鹿茸冻干粉、鹿茸口服液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种鹿茸提取物、鹿茸冻干粉、鹿茸口服液及其制备方法。

背景技术

鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，属于补阳药，具有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒之功效；现代药理学研究证明，鹿茸中活性成分，比如：蛋白质、多糖、多胺、性激素、多肽、氨基酸等，从而使得具有抗化学药物损伤、抗溃疡、提高耐力、增强记忆力、抑制单胺氧化酶活性、抗衰老和抗氧化等多种药理作用；其中，鹿茸中的水溶性活性蛋白类（也即活性多肽类）物质，比如超氧化物歧化酶，活性生长因子（神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子）等，对动物的生长、健康具有重要作用。以胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor-1(IGF-1)）为例，具有促进骨骼生长、保护神经、和治疗心力衰竭等生理活性；其也是鹿茸中最为中药的活性物质。

目前提取鹿茸中水溶性成分的方法主要有2类：一是高温提取法，该方法对水溶性多糖等活性成分的提取几乎无不利影响，但是鹿茸中的水溶性生物活性蛋白在高温下则容易变性失活，从而无法获得所有的水溶性活性成分；二是低温提取法，该方法通常伴随着膜分离技术，先将鹿茸粉碎、使用缓冲溶液浸提后，再将粗提液进行膜分离，得到某一特定组分的活性物质，该方法存在的缺点是：1）低温法得到的提取物，在制成口服液时，需要进行杀菌消毒。而杀菌过程极易导致活性蛋白组分的变性失活。2）膜分离过程中，如果使用孔径较小的滤膜，会截流掉较大分子量的水溶性蛋白质，或为了脱盐，使用两级不同孔径的膜分离，又会过滤掉小分子的游离氨基酸，无法得到营养成分较为全面的水溶性提取物。3）10KDa孔径的膜过滤缓慢还需要频繁清洗，不适合大规模提取使用。

因此，研发一种能够最大程度提取出鹿茸中的生物活性蛋白类物质、并最大限度的保留所有的水溶性活性成分的制备方法，制备鹿茸提取物、鹿茸冻干粉和鹿茸口服液显得至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的的缺陷，提供了一种鹿茸提取物、鹿茸冻干粉、鹿茸口服液及其制备方法，该制备方法，对鹿茸中的生物活性物质提取全面，且能最大限度的保留水溶性活性成分，且水溶性活性蛋白类物质收率高。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

一种鹿茸提取物的制备方法，包括如下步骤：

将鹿茸与生姜混合，并加入提取剂，然后依次浸泡、磨浆、超声抽提、固液分离、滤膜过滤，制得鹿茸提取物；所述鹿茸采用新鲜鹿茸，所述生姜采用鲜生姜。

作为进一步的技术方案，将鹿茸与生姜混合，并加入提取剂，然后依次浸泡、磨浆、超声抽提、固液分离、滤膜过滤，制得鹿茸提取物，具体包括：

将鹿茸切片与生姜切片加入到提取剂中，浸泡后，用磨浆机粉碎磨浆，然后采用超声波细胞破碎仪以超声抽提后，离心，上清液用滤膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用提取剂搅拌提取，离心、上清液用滤膜过滤，过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉。

作为进一步的技术方案，鹿茸与生姜混合前，将新鲜鹿茸去毛、清洗干净，然后切片，制备成鹿茸切片；并将鲜生姜清洗干净，切片，制备成生姜切片。

作为进一步的技术方案，鹿茸与生姜混合物时，鹿茸与生姜的质量比为1:0.1-0.5（优选1：0.3）。

作为进一步的技术方案，提取剂的用量为：按料液质量比为1:50-150（优选1:100），向鹿茸与生姜中加入提取剂。

作为进一步的技术方案，所述提取剂采用酸性水溶液，所述浸泡的温度为20℃，浸泡时间为1h。

作为进一步的技术方案，所述磨浆后的浆液粒度为80-100目。

作为进一步的技术方案，所述超声抽提的温度为0-30℃。

作为进一步的技术方案，超声抽提的超声功率200W，超声时间为20min。

作为进一步的技术方案，所述固液分离包括离心分离；所述离心的转速为5000转/分钟，离心时间为20分钟。

作为进一步的技术方案，所述滤膜的孔径为大于等于30μm。

作为进一步的技术方案，所述酸性水溶液采用蒸馏食醋。

作为进一步的技术方案，所述超声抽提的温度为10-20℃。

作为进一步的技术方案，所述滤膜采用改性纤维素膜。

一种所述鹿茸提取物制备成鹿茸冻干粉，将所述鹿茸提取物冷冻干燥，即得鹿茸冻干粉。

作为进一步的技术方案，所述鹿茸冻干粉中包括：702-777mg/g的鹿茸总蛋白,28.1-29.2μg/g的IGF-1;5.35-5.44mg/g的多糖;78.38-83.33mg/g的游离氨基酸。

一种包含所述鹿茸冻干粉的药物制剂，所述药物制剂为口服制剂，所述口服制剂包括颗粒剂、口服液、粉剂、片剂中的任意一种；所述口服制剂还包括口服药物可接受的辅料。

一种包含所述鹿茸冻干粉的鹿茸口服液，所述鹿茸口服液中包含有0.125-0.5mg/ml鹿茸冻干粉，4-6mg/ml（优选5mg/ml）的活性蛋白保护剂，1-3mg/ml（优选2mg/ml）的相稳定剂，0.3-0.7mg/ml（优选0.5mg/ml）的抑菌剂。

作为进一步的技术方案，所述活性蛋白保护剂包括二糖、寡聚多糖和糖醇类物质中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，所述二糖包括麦芽糖、蜜二糖、乳糖、海藻糖中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，寡聚多糖包括褐藻糖、壳寡聚糖、瓜尔豆胶中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，糖醇类物质包括甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，所述相稳定剂采用水溶性高分子材料。

作为进一步的技术方案，所述水溶性高分子材料包括蔗糖单油酸酯、单油酸甘油酯、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，所述抑菌剂包括苯甲酸钠、琥珀酸二钠、苯甲酸钠、尼泊金乙酯中的一种或多种；优选为苯甲酸钠。

作为进一步的技术方案，所述活性蛋白保护剂由甘露醇、麦芽糖、褐藻糖按质量比1：2-3：1-2（优选1：2.5：1.5）复配制得。

作为进一步的技术方案，所述相稳定剂由蔗糖单油酸酯和羧甲基纤维素钠按1:2-4（优选1:3）复配制得。

一种所述鹿茸口服液的制备方法，包括如下步骤：

秤取各原料后，将鹿茸冻干粉、活性蛋白保护剂、相稳定剂、抑菌剂加入到去离子水中，直到成均匀透明的胶体溶液后，降温到20℃，然后向其中加入鹿茸冻干粉，搅拌混合成均匀透明溶液后，微波杀菌，得鹿茸口服液；所述微波杀菌的微波功率400-800W，杀菌时间30s-60s，杀菌温度60-70℃（优选微波功率800W，杀菌时间30s，杀菌温度70℃）。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明采用去除了盐分的蒸馏食醋为提取剂，并采用先磨浆再超声的提取工艺来提取鹿茸中的活性多肽（以IGF-1为表征）、蛋白质、游离氨基酸、多糖的水溶性鹿茸提取物。相较于现有技术而言，其不采用缓冲盐提取剂，不需要进行半透膜脱盐处理，简化了提取过程，避免了脱盐过程中导致的游离氨基酸、钙等小分子鹿茸水溶性分营养成分的流失，此外，其还能提高活性多肽和蛋白的收率，其中酸性水溶液中的蒸馏食醋还可以起到去除腥味的作用。

2、本发明以蒸馏食醋提取剂，对鹿茸进行磨浆超声的提取工艺，对鹿茸中的水溶性活性成分收率高，此外，本发明以蒸馏食醋提取剂提取生姜成分，在该提取剂下提取，由于有来源于食醋的苯乙醇、乙酸苯乙酯、3-羟基-2-丁酮等有机物，和生姜的莰烯甲基庚烯酮、β-桉叶醇、姜酮等有机物存在，其能够起到保护鹿茸中活性多肽稳定的作用，避免或降低了活性多肽在提取及后继的灭菌工艺中的损失，提高了活性多肽的收率及灭菌留存率，而生姜与鹿茸一起磨浆超声的提取工艺，可以在提取过程中的全程对活性多肽进行保护，降低提取过程中活性多肽的损失，提高活性多肽的收率，此外，本发明蒸馏食醋和生姜还能够提到去除腥味的作用，生姜还能够起到保护脾胃、去除寒凉的作用。

3、由于蛋白质或多肽的生物活性有赖于其特殊的立体结构，而维持其立体结构的作用力包括水合氢键、极性和非极性等范德华力作用等。在受热或电磁作用下，其立体结构容易发生永久性改变，而失去生物活性。本发明通过对鹿茸冻干粉的提取工艺进行研究，筛选出对IGF-1稳定性最友好的鹿茸冻干粉提取工艺和物质组成，并通过添加活性蛋白稳定剂、相稳定剂，以及对灭菌工艺进行筛选，从而降低了IGF-1在灭菌过程中的损失，提高了鹿茸口服液中IGF-1的含量及储藏稳定性。

4、本发明通过对活性蛋白稳定剂、相稳定剂的组成成分及用量进行筛选，确定了对IGF-1稳定性最佳的活性蛋白稳定剂和相稳定剂配方。

5、本发明采用蒸馏食醋作为提取剂，添加生姜，添加由甘露醇、褐藻糖、麦芽糖三者组成的活性蛋白稳定剂，添加由羧甲基纤维素钠、蔗糖单油酸酯组成的相稳定剂，以及800W，70℃灭菌30S的微波灭菌工艺的选择，均对IGF-1在灭菌过程中的留存率具有重要影响，以上各因素综合作用，相互影响，获得了鹿茸口服液灭菌过程中IGF-1留存率大于95%的技术效果；因此，本发明的IGF-1留存率大于95%的技术效果是上述各因素共同作用的结果，以上各因素缺一不可。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以胰岛素样鹿茸表皮生长因子（IGF-1）的含量作为活性多肽成份含量或保留率的标的物，进行鹿茸冻干粉中活性多肽（水溶性活性生物蛋白）的评价。

本发明所用的原料均为市购原料。

试验一：蒸馏食醋提取剂制备和组成

一、实验方法

实施例1-4：

一种蒸馏食醋提取剂的制备方法，包括如下步骤：

在常压、油浴温度150℃条件下，以食醋为原料，用蛇形冷凝器通20℃的冷却水，收集冷凝液，直到无冷凝液为止，得到蒸馏食醋提取剂，并分别编号101、102、103、104。

以GC-MS 气相色谱-质谱联用方法分析食醋中挥发性有机物相对含量，各实施例所用食醋原料和蒸馏食醋提取剂的组成分别见表1和表2；

二、结果及分析

表1：食醋原料组成和气味

表2：食醋类型及窖藏时间对蒸馏食醋提取剂组成的影响

从表1数据可以看出：食醋窖藏年份越长，含酸量越多，所含挥发性香气有机物中酯类相对含量也最多，其次是醇类；

此外，通过对窖藏年份进行研究，还发现：窖藏年份越长，所含挥发性香气有机物中酯类成分的数量也是最多的，有几十种酯类化合物。

同时，本试验还给出各实施例蒸馏食醋提取剂中相对含量较高的非醋酸有机化合物的组成及含量，见表3。

表3蒸馏食醋提取剂中主要挥发性组分分析

试验二：提取工艺对冻干粉气味及各成分产出的影响

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：取10克新鲜梅花鹿茸，清洗干净后，放冰柜-10℃冷冻5小时候，切成0.2毫米薄片，得鹿茸切片；取3克鲜生姜，清洗干净后切成1毫米片，得生姜切片；

步骤2、将鹿茸切片与生姜切片加入到100ml的蒸馏食醋提取剂中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并分别编号101DF、102DF、103DF、104DF；

与实施例5相同，区别在于是采用不蒸馏的棒棰岛米醋代替蒸馏的棒棰岛米醋作为提取剂，编号101DQF。

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：取10克新鲜梅花鹿茸，清洗干净后，放冰柜-10℃冷冻5小时候，切成0.2毫米薄片，得鹿茸切片；

步骤2、将鹿茸切片加入到100ml的提取剂（去离子水作为提取剂）中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并编号101DSF；

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：取10克新鲜梅花鹿茸，清洗干净后，放冰柜-10℃冷冻5小时候，切成0.2毫米薄片，得鹿茸切片；

步骤2、将鹿茸切片加入到100ml的提取剂（101号蒸馏食醋提取剂）中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并编号101DZF；

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：取10克新鲜梅花鹿茸，清洗干净后，放冰柜-10℃冷冻5小时候，切成0.2毫米薄片，得鹿茸切片；

步骤2、制备生姜水提物：将3克鲜生姜清洗干净后切成1毫米片，得生姜切片，然后向生姜切片中加入100ml去离子水，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，得0.1g生姜水提物；

步骤3、将鹿茸切片加入到100ml的提取剂（101号蒸馏食醋提取剂）中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，然后加入步骤2得到的0.1g的生姜水提物，搅拌均匀后，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并编号101DMF；

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：取10克新鲜梅花鹿茸，清洗干净后，放冰柜-10℃冷冻5小时候，切成0.2毫米薄片，得鹿茸切片；取3克鲜生姜，清洗干净后切成1毫米片，得生姜切片；

步骤2、将鹿茸切片与生姜切片加入到100ml的提取剂（101号蒸馏食醋提取剂）中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用30微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、30微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，用1微米孔径纤维素膜处理，获得处于1微米到30微米之间的提取物，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并编号101DJF；

一种鹿茸冻干粉，其制备方法包括如下步骤：

步骤1、预处理：同对比例5；

步骤2、将鹿茸切片与生姜切片加入到100ml的提取剂中，20℃浸泡1小时后，用磨浆机粉碎磨浆至浆液粒度为80目，然后采用超声波细胞破碎仪以200W的超声功率超声20分钟，5000转/分钟离心20分钟，上清液再用1微米孔径的纤维素膜过滤，得一次提取液，合并滤渣，滤渣再用100毫升提取剂搅拌提取，5000转/分钟离心20分钟、1微米孔径的纤维素膜过滤，得到二次提取液，合并两次提取液，在-20至30℃，压力10Pa为条件下冷冻干燥，制得鹿茸冻干粉，并编号101DXF；

步骤3、去蛋白处理：将步骤2得到的鹿茸冻干粉加2g去离子水溶解，用85%的10g乙醇沉淀其中的蛋白质，离心，冷冻干燥，得到干粉，即鹿茸冻干粉，并编号101DFD。

各实施例所用提取剂、生姜、滤膜孔径及产品编号见表4；

1）分别对实施例5-8和对比例1-6制备的鹿茸冻干粉进行成分检测及气味评价，结果见表4，其中，实施例5-8制得的鹿茸冻干粉中各活性成分的含量见表5；

2）分别对实施例5-8和对比例1-6制备的鹿茸冻干粉进行成分检测，分析鹿茸冻干粉中来源于蒸馏食醋和生姜的成分及相对含量%；结果见表6。

3）检测过程中，所采用的方法如下：

以GC-MS 气相色谱-质谱联用方法分析鹿茸冻干粉溶液中挥发性有机物相对含量；采用电导率法，以标准氯化钠溶液为参照，测定鹿茸冻干粉氯化钠含量；以标准牛血清蛋作为标品，利用考马斯亮兰染色法进行比色测定水溶性蛋白（总蛋白）含量；以硫酸锌和亚铁氰化钾为蛋白质沉淀剂，用甲醛滴定法测定冻干粉游离氨基酸含量；采用苯酚-硫酸法测定鹿茸冻干粉多糖含量；采用平衡饱和竞争放射免疫分析法测定鹿茸提取液中IGF-1的含量。

表4 冻干粉的鹿茸提取物组成、含量与气味

表5鹿茸冻干粉中各活性成分的含量

表6鹿茸冻干粉中源于食醋、生姜的有机物和盐分

各组分的收率（也即提取率）%=各成分的重量/鹿茸原料的重量*100%；由于本发明各实施例和各对比例的鹿茸原料的用量相等，因此，表4中提取所得的各成分的重量越大，其收率越高。

从表4和表5中数据可知：

（1）通过实施例5-8与对比例1的对比可知，食醋蒸馏后作为提取剂相较于不蒸馏直接将食醋作为提取剂而言，产品中不含盐，不需要进行透析脱盐处理就可以得到不含盐的鹿茸提取物，解决了因产品含盐所带来的一系列问题，此外，采用不含盐的蒸馏食醋作提取剂相较于不蒸馏食醋而言，还提高了IGF-1收率；

（2）从实施例5-8的数据可知：1）不同食醋均可用于鹿茸提取物的制备；2）食醋的窖藏时间对鹿茸冻干粉的总收率以及总蛋白收率、IGF-1收率、多糖收率、和游离氨基酸收率均有不同程度的影响；其中窖藏1年的陈醋制备的冻干粉总收率及各成分的收率均略低于窖藏3年及以上时间的陈醋以及米醋；因此，优选窖藏3年及以上的陈醋与米醋作为提取剂用于鹿茸提取物或鹿茸冻干粉的制备。

（3）通过实施例5与对比例4对比，当制备过程中添加水作提取剂制备的生姜水提物时，鹿茸冻干粉中来源于生姜的莰烯、甲基庚烯酮、β-桉叶醇、姜酮等成分含量降低，且其鹿茸冻干粉中总蛋白的收率及IGF-1的收率均降低，其可能原因是：蒸馏食醋提取剂提取出的生姜中的莰烯、甲基庚烯酮等组分对鹿茸中的IGF-1有保护作用，从而导致对比例4超声后加入生姜水提物的对比例4相较于实施例5而言，IGF-1的收率显著降低，而生姜还能够促进鹿茸中蛋白类物质的溶出，从而导致对比例4相较于实施例5而言，总蛋白收率降低，实施例5与对比例3对比，不加入生姜时，IGF-1的收率显著降低；而超声结束后加入生姜水提物的对比例4与不添加生姜的对比例3，差异相对较小；而活性多肽（以IGF-1为标的）是鹿茸冻干粉中最重要的活性成分，是鹿茸提取物中的最重要的目标产物，而其收率的高低直接影响着鹿茸中活性多肽的产出，影响着生产成本，而通过本对比试验可以确定，将生姜与鹿茸一起磨浆制备鹿茸冻干粉，生姜能够起到促进鹿茸中蛋白和活性多肽的溶出或者降低制备过程中活性多肽损失的作用，从而使得蛋白及活性多肽的收率明显提高，极大的降低了原料成本。

此外，实施例5与对比例3-4的对比，还可知，生姜以及生姜水提物均在一定程度上能够起到去腥的作用。

（4）通过对比例3与对比例2的对比可知：对比例2去离子水作为提取剂，且不添加生姜时，相较于对比例1采用蒸馏食醋作为提取剂但不添加生姜而言，冻干粉总收率、总蛋白收率以及IGF-1收率均有所降低，因此可知，蒸馏食醋相较于去离子水而言，有利于IGF-1的提取或避免提取过程中的损失，从而提高IGF-1的收率，说明蒸馏食醋是有效的提取剂，蒸馏食醋中的有机成分，乙酸、苯乙醇、乙酸苯乙酯、3-羟基-2-丁酮等，可能对提高干粉总收率、总蛋白收率以及IGF-1收率均有作用。

（5）从表5中实施例5-8的数据可知，本发明以蒸馏食醋为提取剂，将生姜与鹿茸一起磨浆超声的提取工艺制备的鹿茸冻干粉中，包含有702-777mg/g的鹿茸总蛋白,28.1-29.2μg/g的IGF-1;5.35-5.44mg/g的多糖;78.38-83.33mg/g的游离氨基酸。

（6）通过实施例5和对比例5-6的对比可知，对比例5-6的冻干粉总收率、总蛋白收率、IGF-1收率、多糖收率、和游离氨基酸收率相较于实施例5均出现不同程度的下降。其中，对比例5的冻干粉中几乎不含游离氨基酸，而对比例6的冻干粉101DXF中总蛋白含量急剧下降。说明过滤滤材孔径、过滤方式对冻干粉提取收率、组成都有一定影响。

试验三、提取工艺、辅料及灭菌对鹿茸口服液的影响

一、实验材料：

向500ml容器内选择性加入活性蛋白稳定剂，选择性加入相稳定剂，加入 0.1克苯甲酸钠，加入去离子水定容到200ml，搅拌溶解，直到成均匀透明的胶体溶液，降温到20℃，向其中加入相应编号和质量的鹿茸冻干粉，搅拌混合成均匀透明溶液，灭菌，制得鹿茸口服液，口服液制备条件统一列于表7。

对比例18

与实施例9相同，区别在于不进行灭菌操作。

表7：实施例9-20和对比例7-18的鹿茸口服液制备的参数条件

二、试验方法：

1）分别对在实施例9-20和对比例7-18中制备鹿茸口服液时，测定灭菌前后鹿茸口服液中的总菌数以及灭菌后鹿茸口服液中IGF-1的含量，计算灭菌率和灭菌过程中IGF-1的保留率；结果见表8；

2）检测实施例9-20和对比例7-18中制备的鹿茸口服液的性能，并计算鹿茸口服液中活性成分总蛋白、游离氨基酸和多糖的理论含量，结果见表8；

3）对实施例9、实施例11和对比例18中制备的鹿茸口服液进行稳定测试，测试方法为：将鹿茸口服液样品于0摄氏度密闭放置，并于第0天和第30天测定样品中的总菌数、以及各活性成分的含量，评价其稳定性，结果见表9。

4）进行该试验所用的检测方法：

采用平衡饱和竞争放射免疫分析法测定鹿茸提取液中IGF-1的含量。样品经稀释后，用菌落计数器进行细菌总菌落数计数。

5）计算方法

（1）口服液活性成分含量=冻干粉的添加量×冻干粉中该活性成分含量/口服液的总体积；

其中，冻干粉中该活性成分含量=添加的冻干粉中活性成分的总量/冻干粉的总量

IFG-1存留率%=（杀菌后口服液IGF-1的含量/口服液中添加的IGF-1的含量）ⅹ100%，（IGF-1含量单位，ng/ml）；

其中，口服液中添加的IGF-1的含量(ng/ml)=口服液中IGF-1的添加量（ng）/口服液总体积（mL）

（3）杀菌率=（杀菌前口服液中细菌总含量-杀菌后口服液中细菌总含量）/ 杀菌前口服液细菌总含量ⅹ100%,（细菌总含量单位，cfu/ml）。

表8：实施例9-20和对比例7-18中鹿茸口服液的性能、活性成分以及IGF-1的保留率

二、试验方法：

1）分别对在实施例9-20和对比例7-18中制备鹿茸口服液时，测定灭菌前后鹿茸口服液中的总菌数以及灭菌后鹿茸口服液中IGF-1的含量，计算灭菌率和灭菌过程中IGF-1的保留率；结果见表8；

2）检测实施例9-20和对比例7-18中制备的鹿茸口服液的性能，并计算鹿茸口服液中活性成分总蛋白、游离氨基酸和多糖的理论含量，结果见表8；

3）对实施例9、实施例11和对比例18中制备的鹿茸口服液进行稳定测试，测试方法为：将鹿茸口服液样品于0摄氏度密闭放置，并于第0天和第30天测定样品中的总菌数、以及各活性成分的含量，评价其稳定性，结果见表9。

4）进行该试验所用的检测方法：

采用平衡饱和竞争放射免疫分析法测定鹿茸提取液中IGF-1的含量。样品经稀释后，用菌落计数器进行细菌总菌落数计数。

5）计算方法

（1）口服液活性成分含量=冻干粉的添加量×冻干粉中该活性成分含量/口服液的总体积；

其中，冻干粉中该活性成分含量=添加的冻干粉中活性成分的总量/冻干粉的总量

IFG-1存留率%=（杀菌后口服液IGF-1的含量/口服液中添加的IGF-1的含量）ⅹ100%，（IGF-1含量单位，ng/ml）；

其中，口服液中添加的IGF-1的含量(ng/ml)=口服液中IGF-1的添加量（ng）/口服液总体积（mL）

（3）杀菌率=（杀菌前口服液中细菌总含量-杀菌后口服液中细菌总含量）/ 杀菌前口服液细菌总含量ⅹ100%,（细菌总含量单位，cfu/ml）。

表8：实施例9-20和对比例7-18中鹿茸口服液的性能、活性成分以及IGF-1的保留率

表9 灭菌对鹿茸蛋白各组分储藏稳定性的影响

从表8-9可以得出如下结论：

1）、从表8中实施例9-12中的数据可以看出，以甘露醇、褐藻糖和麦芽糖三者的组合物作为活性蛋白稳定剂，并以羧甲基纤维素钠和蔗糖单油酸酯作为相稳定剂，以800W微波，30S，70℃的灭菌方式进行灭菌时，使用不同的食醋蒸馏液为提取剂，或不同量的冻干粉为原料，均具有灭菌较较完全、灭菌过程中IGF-1虽有损失，但损失较少，IGF-1仍旧具有较高的存留率，口服液透明无沉淀、口感无腥味的特点，因此，实施例9-12工艺具有普适性；

2）、从表8中对比例8与对比例9的对比可知：对比例9采用去离子水作为提取剂时，相较于对比例8采用蒸馏食醋作提取剂时，IGF-1的保留率显著降低，因此可知，蒸馏食醋相较于去离子水而言能够提高IGF-1灭菌过程中的保留率，说明食醋中的有机物苯乙醇、乙酸苯乙酯、3-羟基-2-丁酮等可能对IGF-1具有保护作用；

3）、从表8中实施例10与对比例7-8的对比可知：实施例10将生姜与鹿茸混合打浆的方式相较于对比例8不加生姜的处理工艺，IGF-1在灭菌过程中的损失率明显降低，IGF-1的存留率由对比例8的90.1%提高到了实施例10的95.9%，提高了5.8%，显著提高了IGF-1的存留率；而相较于对比例7超声提取完毕后加生姜水提物的处理工艺，IGF-1的存留率由对比例7的92.2%提高到了实施例10的95.9%，提高了3.7%，说明生姜有机物甲基庚烯酮、β-桉叶醇、姜酮等甲基庚烯酮、β-桉叶醇、姜酮等可能对IGF-1也具有保护作用；

此外，从表8中实施例10与对比例7-8的对比还可知：生姜及生姜水提物具有去腥味的作用。

4）从表8中实施例10与对比例10的对比可知：当提取剂中含盐时，鹿茸冻干口服液灭菌过程中IGF-1的留存率明显下降，由实施例10的95.9%，下降到对比例10的91.3%，下降了4.6%。

2、鹿茸冻干粉中其他组分对IGF-1留存率的影响

1）、从表8中实施例10与对比例11的对比可知：对比例11使用不含游离氨基酸的鹿茸冻干粉制备鹿茸口服液，IGF-1存留率仅为93.1%，较实施例10的IGF-1的95.9%的存留率降低了2.8%，说明鹿茸冻干粉中的游离氨基酸对IGF-1也有保护作用。

2）从表8中实施例10与对比例12的对比可知：对比例12使用去除了蛋白质的鹿茸冻干粉制备鹿茸口服液，IGF-1存留率为92.3%，较实施例10的IGF-1存留率降低3.6%，说明鹿茸蛋白质对IGF-1也有保护作用。

3、活性蛋白稳定剂对鹿茸口服液的性能及各活性成分的影响

1）从表8中实施例9、13-15与对比例13的对比可知：不添加活性蛋白稳定剂的对比例13制备的鹿茸口服液中的IGF-1含量以及灭菌过程中IGF-1的存留率相较于添加了活性蛋白稳定剂的实施例9、13-15而言，出现显著降低，其中，IGF-1的留存率由实施例9的96.2%降低到了对比例13的85.6%，降低了10.6%；因此可知，活性蛋白保护剂在提高IGF-1的稳定性上，发挥着重要作用。

2）从表8中实施例9与实施例13-15的对比可知：实施例13-15中甘露醇、褐藻糖和麦芽糖三种物质中缺少任何一个，其制备的鹿茸口服液中的IGF-1含量以及灭菌过程中IGF-1的存留率相较于实施例9均会出现显著的降低，因此可知：活性蛋白稳定剂组成对IGF-1的稳定性也具有明显影响，本发明由甘露醇、褐藻糖和麦芽糖制备而成的活性蛋白稳定剂相较于其他组分的活性蛋白稳定剂而言，能够更好的保护IGF-1不在灭菌过程中发生降解，从而提高了鹿茸口服液终产品中IGF-1的含量。

4、相稳定剂对鹿茸口服液性能及各组分的影响

1）从表8中实施例9、16-17与对比例14的对比可知：不添加相稳定剂的对比例14制备的鹿茸口服液相较于实施例9、16-17制备的鹿茸口服液的外观出现沉淀或浑浊、不透明等明显变差的现象，且由于溶液均一性的变化而导致其他组分对IGF-1的保护性变差，从而导致IGF-1含量以及灭菌过程中IGF-1的存留率也发生一定程度的降低，其中，IGF-1的留存率由实施例9的96.2%降低到了对比例14的93.2%，降低了3.0%；因此，可知：相稳定剂不仅能够保证口服液的外观均一稳定，且也是影响IGF-1的稳定性的重要因素。

2）从表8中实施例9与实施例16-17对比可知：实施例16和实施例17仅采用单独一种成分作为相稳定剂时，相较于实施例9采用两者的复合成分作为相稳定剂时，所制备的口服液外观出现沉淀或浑浊、不透明等明显变差的现象，且当相稳定剂采用蔗糖单油酸酯时，其灭菌过程中IGF-1的留存率也有所降低，因此可知，相稳定剂的组成不仅能够保证口服液的外观均一稳定，且在一定程度上影响着IGF-1的稳定性，是影响IGF-1的稳定性的其中一个因素；本发明由羧甲基纤维素钠和蔗糖单油酸酯复配构成的相稳定剂，不仅能够使鹿茸口服液具有良好的外观品质，还能够降低灭菌过程中IGF-1的损失，提高IGF-1的存留率。

5、灭菌对鹿茸口服液性能及各组分的影响

1）从表8中实施例9和对比例18可以看出：在对IGF-1进行了各种措施的保护的情况下，不灭菌的对比例17的IGF-1的留存率为99.8%，而灭菌的实施例9的IGF-1留存率为96.2%；因此可知，灭菌操作可降解IGF-1，降低IGF-1的留存率；

然而，从表9中实施例9与对比例18的对比可知：0摄氏度密闭放置30天后，灭菌处理的实施例9中鹿茸蛋白、游离氨基酸、IGF-1三类活性成分的损失较低，而未灭菌处理的对比例18中，细菌严重超标，无法使用，且各活性成分的含量受活菌代谢影响，均出现大幅降低；因此，可知：灭菌处理能够提高鹿茸口服液中活性成分的储藏稳定性，避免细菌对活性成分的降解。

2）、从实施例8和实施例18-20的对比可以看出：实施例18中在800W的微波功率下，缩短灭菌温度和灭菌时间，以及实施例20中在400W的灭菌功率下降低灭菌温度并延长灭菌时间，均不能够达到有效灭菌，不能够获得微生物指标合格的鹿茸口服液；

而800W的微波功率不变的情况下，实施例19延长灭菌温度及灭菌时间，虽然能够提高灭菌效果，但是由于灭菌强度增大，相较于实施例9而言，灭菌过程中IGF-1损失严重，IGF-1留存率急剧降低；因此，本发明优选800W微波，70℃灭菌30S的灭菌工艺，其既能够实现有效灭菌，又具有高的IGF-1留存率。

（3）从表8中实施例9与对比例15的对比可知：对比例15采用长时间加热的灭菌方式相较于实施例9的短时间微波灭菌方式而言，IGF-1失活较多，长时间加热的灭菌方式不利于IGF-1的留存；

此外，其对比例15在长时间加热下还仍然维持有80.1%的存留率，好能够说明本发明的活性蛋白稳定剂、相稳定剂、食醋和生姜组分成分、以及冻干粉本身所含游离氨基酸、多糖、蛋白质的综合保护下， IGF-1的热稳定性有了较大的提高。

6、各因素共同作用对鹿茸口服液性能及各组分的影响

1）从实施例10与对比例16-17的对比可知：对比例16使用去离子水代替蒸馏食醋作为提取剂、不使用生姜、不添加活性蛋白稳定剂时，制备的鹿茸口服液中 IGF-1的含量及IGF-1的留存率相较于实施例10出现大幅下降，其中 IGF-1的留存率由实施例10的95.9%下降到了对比例16的48.8%，而对比例17进一步不添加相稳定剂时，制备的鹿茸口服液中IGF-1的含量及 IGF-1的留存率又发生了进一步的下降，仅为41.6%；因此可知：蒸馏食醋提取剂、添加生姜、生姜与鹿茸一起打浆、添加活性蛋白稳定剂及相稳定剂均能够影响IGF-1的稳定性，提高鹿茸口服液制备过程中IGF-1的留存率。

综上，本发明中采用蒸馏食醋作为提取剂，生姜，由甘露醇、褐藻糖、麦芽糖三者组成的活性蛋白稳定剂，由羧甲基纤维素钠、蔗糖单油酸酯组成的相稳定剂的添加，以及800W，70℃灭菌30S的微波灭菌工艺的选择，均对IGF-1在灭菌过程中的留存率具有影响，本申请IGF-1留存率大于95%的技术效果是上述各因素共同作用的结果，以上各因素缺一不可。此外，生姜与鹿茸一起打浆的提取工艺，还影响着鹿茸提取物提取过程中IGF-1能够提高IGF-1的收率。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。