一种基于3D纸芯片捕获、纯化和可视化检测肝癌外泌体的方法

技术领域

本发明属生化分析与生物传感领域，具体涉及一种基于3D纸芯片捕获、纯化和可视化检测肝癌外泌体的方法。

背景技术

肝癌是全球死亡率最高的四大癌症之一，其死亡率高的最主要原因在于通常在癌症的晚期才能被诊断出。因此，对肝癌的早期诊断对提高肝癌患者的存活率至关重要。现有的肝癌诊断通常采用超声法联合血清中的AFP标志物检测，而超声法对癌症的早期病变灵敏度不足，AFP检测准确度低，通常造成较高的假阳性和假阴性结果。因此，亟需高灵敏、高准确性检测肝癌的标志物对实现肝癌的非侵入式早期诊断具有重要意义。

在各种新兴的癌症诊断的生物标志物中，外泌体一致被认为是最具潜力的癌症早期诊断标志物，因为其在癌症发生的早期便广泛参与体液的循环。据报道，肝癌细胞来源外泌体表面具有多种表达显著高于正常细胞的蛋白标志物以及在外泌体内部货物中有多种microRNAs、非编码RNA等可以作为肝癌诊断的标志物。更重要的是，外泌体还广泛、高丰度地分布于极易获得的血液、唾液、以及尿液等多种体液中且能够长期地稳定存在。因此，外泌体被认为是肝癌早期无创诊断最佳的生物标志物之一。

尽管外泌体作为非侵入性肝癌标志物已得到广泛认可和应用，但目前的外泌体分析方法普遍依赖于外泌体的分离。然而，现有的外泌体分离方法普遍存在于耗时长、操作繁琐、纯度低、外泌体损伤、无选择性等问题。例如，超速离心需要多步离心，导致耗时(>8小时)和繁琐的操作，且纯度低，无法特异性分离癌细胞来源的外泌体。尽管密度梯度离心法可以进一步提高分离外泌体的纯度，但其仍需更为复杂的离心步骤和更长的分离时间。尺寸排阻色谱法以及聚合物共沉淀法虽然简单快速，但它们均面临着纯度低且无选择性的挑战。近年来，基于免疫亲和的外泌体分离方法具有纯度高、特异性好等优点而被广泛应用于肿瘤/癌症特异性外泌体的分离和癌症的诊断。然而，现有的基于免疫亲和的外泌体捕获方法仍存在从复杂样品中分离到与抗体相结合的杂蛋白以及其他细胞外囊泡群体而影响诊断的准确性的重要挑战。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种DNA四面体。

本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的DNA四面体在制备检测外泌体的物质中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供一种外泌体捕获芯片。

本发明第四方面的目的，在于提供一种外泌体检测试剂盒。

本发明第五方面的目的，在于提供一种外泌体纯化纸基平台装置。

本发明第六方面的目的，在于提供本发明第三方面的外泌体捕获芯片、本发明第是方面的外泌体检测试剂盒或本发明第五方面的外泌体纯化纸基平台装置的应用。

本发明第七方面的目的，在于提供一种外泌体的检测方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种DNA四面体，所述DNA四面体包括四条DNA寡核苷酸链，所述四条DNA寡核苷酸链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～6所示，所述四条DNA寡核苷酸链中的一条DNA寡核苷酸链修饰有适配体。

修饰有适配体的DNA寡核苷酸链的核苷酸序列为：AAAAAAAAAACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGACATG CGAGGGTCCAATACCG(SEQ ID NO:3)。

优选地，所述适配体为CD63特异性适配体。

优选地，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述适配体修饰在DNA寡核苷酸链的5’端。

优选地，所述修饰有适配体的DNA寡核苷酸链的5’端修饰有荧光基团。

优选地，所述荧光基因包括Cy3、Cy5、Alexa488、Rhodamine和FITC中的任意一种。

优选地，所述四条DNA寡核苷酸链中的未修饰适配体的三条DNA寡核苷酸链修饰有SH基团。

优选地，所述SH基团修饰在DNA寡核苷酸链的5’端。

优选地，所述DNA四面体的制备方法包括以下步骤：将四条DNA寡核苷酸链与三(2-羧乙基)膦盐酸盐和MgCl

进一步优选地，所述缓冲溶液为Tris-HCl。

进一步优选地，所述四条DNA寡核苷酸链等摩尔浓度混合；更进一步，各DNA寡核苷酸链的终浓度为1～5μM；最优选地为1μM。

进一步优选地，所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的终浓度为10～15mM；更进一步为10mM。

进一步优选地，所述加热为混合溶液加热至90～97℃保持4～10min；更进一步为95℃保持5min。

进一步优选地，所述冷却为在1～2min内冷却至2～6℃；更进一步为1min内冷却至4℃。

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的DNA四面体在制备检测、捕获和/或筛选外泌体的物质中的应用。

优选地，所述外泌体包括肝癌来源的外泌体。

优选地，所述物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、尺寸排阻色谱法、免聚合物共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测外泌体的试剂和/或仪器。

本发明的第三个方面，提供一种外泌体捕获芯片，包括本发明第一方面的DNA四面体。

优选地，所述外泌体捕获芯片还包括芯片。

优选地，所述芯片为纳米金修饰的芯片。

优选地，所述DNA四面体负载在所述纳米金修饰的芯片上。

优选地，所述纳米金修饰的芯片的制备方法包括以下步骤：纸芯片置于3氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)溶液50～70min；将金纳米颗粒滴加在经APTMS修饰的纸芯片，室温孵育25～40min，即得到纳米金修饰的芯片。

本发明的第四个方面，提供一种外泌体检测试剂盒，包括本发明第三方面的外泌体捕获芯片。

优选地，所述外泌体包括肝癌来源的外泌体。

本发明的第五个方面，提供一种外泌体纯化纸基平台装置，包括本发明第三方面的外泌体捕获芯片、外泌体纯化芯片和释放探针。

优选地，所述外泌体纯化芯片上修饰有抗体。

优选地，所述抗包括EpCAM抗体、PTK7抗体和ASGPR1抗体。

优选地，所述外泌体纯化芯片为修饰有EpCAM抗体、PTK7抗体和ASGPR1抗体的PVDF膜。

优选地，所述释放探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

优选地，所述释放探针通过竞争杂交释放外泌体捕获芯片所捕获的外泌体。

优选地，所述外泌体纯化纸基平台装置还包括储存装置、驱动装置和过滤器支架。

优选地，所述外泌体捕获芯片和外泌体纯化芯片分别固定在不同过滤器支架中。

优选地，所述储存装置包括样品池、洗涤池、洗脱池和废液池。

优选地，所述释放探针储存于所述洗脱池中。

优选地，所述储存装置底部设置有控制阀，以控制液体流动。

优选地，所述驱动装置包括蠕动泵。

优选地，所述外泌体纯化纸基平台装置还包括乳胶管。

优选地，所述乳胶管将储存装置与驱动装置连接。

外泌体纯化纸基平台装置的工作原理：样品在蠕动泵驱动下流动，所有的外泌体被外泌体捕获芯片上的CD63适配体捕获；接着，释放探针可以通过互补配对竞争释放被捕获的外泌体；被释放的外泌体经过外泌体纯化芯片时，表达EpCAM、PTK7和ASGPR1的外泌体被捕获到外泌体纯化芯片上(图1)，即得到纯化后的外泌体。

本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的DNA四面体、本发明第三方面的外泌体捕获芯片、本发明第是方面的外泌体检测试剂盒或本发明第五方面的外泌体纯化纸基平台装置在(1)～(4)中任一种中的应用；

(1)外泌体的分离；

(2)外泌体的富集；

(3)外泌体的纯化；

(4)外泌体检测。

优选地，上述应用均为非疾病诊断治疗目的的应用。

优选地，所述外泌体包括肝癌来源的外泌体。

本发明的第七个方面，提供一种外泌体的检测方法，包括使用本发明第六方面的外泌体纯化纸基平台装置的步骤。

优选地，所述方法还包括对外泌体纯化纸基平台装置获得的外泌体进行显色反应的步骤。

本发明的有益效果是：

本发明提供的DNA四面体较单链DNA具有更强的空间识别效应，有更好的空间取向，位阻效应得到显著降低，可以更好的特异性识别并结合外泌体，实现外泌体富集与多靶标检测。

本发明提供的外泌体捕获芯片具有更好的空间取向，较低的位阻效应，可以更好的特异性识别并结合外泌体。进一步通过实验证明，无四面体结构的外泌体捕获芯片与构建的四面体结构的外泌体捕获芯片，无四面体结构回收率仅为30.8％，显著低于本发明提供的具有四面体结构的外泌体捕获芯片(回收率85.2％)，表明本发明提供的具有四面体结构的外泌体捕获芯片可以高效地从复杂血清样品中分离和释放外泌体。

本发明提供的外泌体纯化纸基平台装置，操作简单，无需大型的仪器离心设备、复杂的微流控芯片制备，且耗时更短，在短时间内从复杂血清样品中分离和纯化出癌细胞来源的外泌体。与常规的免疫亲和捕获外泌体的方法相比，该装置集成了外泌体的分离和纯化操作，可更准确地捕获特定癌细胞来源的外泌体，这有望提高基于外泌体的癌症诊断的准确性。此外，各操作步骤均通过微型蠕动泵自动控制，减少手动操作引起的误差，更有利于临床推广使用。

本发明提供的外泌体的检测方法，可有效通过可视化定性区分肝癌细胞来源外泌体和与正常肝细胞来源外泌体，其灵敏度高，且成本低、与小型设备的集成使用，有望用于偏远地区癌症的无创诊断。

附图说明

图1为外泌体纯化纸基平台装置和肝癌细胞来源外泌体的可视化检测原理图。

图2为对DNA四面体进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果图。

图3为TND@AuNPs@paper的扫描电子显微镜图；其中，(a)为1μm下的扫描电子显微镜图，(b)为70μm下的扫描电子显微镜图。

图4为TND@AuNPs@paper和AuNPs@paper的荧光显微镜图；其中，(a)为AuNPs@paper的荧光显微镜图，(b)为TND@AuNPs@paper的荧光显微镜图。

图5为Ab@PVDF的表征结果图；其中(a)为检测PVDF膜上抗体的结果图片，(b)为通过imageJ分析图(a)所得灰度强度值(GI)。

图6为TND@AuNPs@paper释放的外泌体的表征结果图；其中，(a)为所释放的外泌体的TEM图像，(b)为所释放的外泌体的NTA分析结果图。

图7为采用标准超速离心法分离外泌体的NTA检测结果。

图8为未捕获外泌体的Ab@PVDF芯片与捕获外泌体的Ab@PVDF芯片的；其中，(a)为未捕获外泌体的Ab@PVDF芯片的SEM图像，(b)为捕获外泌体的Ab@PVDF芯片的SEM图像。

图9为无四面体结构AptCD63@AuNPs@paper与TND@AuNPs@paper的回收率对比结果图。

图10为采用实施例7检测不同浓度肝癌来源外泌体的可视化结果；其中，(a)为检测不同浓度肝癌外泌体所得结果图片，(b)通过imageJ分析图(a)所得灰度强度值(GI)，图中，ⅰ代表无外泌体血清样品，ⅱ代表外泌体浓度为2.0×10

图11为采用实施例7检测不同来源的外泌体的可视化结果；其中，(a)为无外泌体血清样品、正常肝细胞来源的外泌体血清样品、肝癌细胞来源的外泌体血清样品在Ab@PVDF芯片上进行P-ELISA反应的颜色对比结果图，(b)为正常肝细胞来源的外泌体、肝癌细胞来源的外泌体的ΔGI值的结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。实施例1 DNA四面体(TND)的合成与表征

1.DNA四面体(TND)的合成

将三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，终浓度为10mM)与四种原始寡核苷酸链(包括四面体链A(TA)(经过Cy3修饰)、四面体链B(TB)、四面体链C(TC)和四面体链D(TD)，均有生工生物科技公司合成得到，终浓度均为1μM)在10mM Tris-HCl缓冲液(含有50mM MgCl

表1适配体及DNA链的的详细信息

2.DNA四面体(TND)的表征

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对TND的合成情况与纯度进行表征。结果如图2所示，与少于四条链的组合相比，TND相对应的唯一高亮度条带显示出较慢的迁移率，即在同时含有组装成DNA四面体的四条单链的条件下，在凝胶最顶端出现单一且亮度高的荧光条带，表明所得到TND成功组装，且纯度较高。

实施例2细胞培养与外泌体制备

人肝癌细胞(HepG-2)和正常肝细胞(WrL68)细胞在DMEM完全培养基下，37℃5％CO

实施例3外泌体捕获芯片的制备与表征

1.纳米金修饰纸芯片(AuNPs@paper)的制备

将滤纸激光切割成直径为13mm的圆形纸芯片；在室温下，用20μL 2.5％(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)溶液处理圆形纸芯片60min(在密封袋中存放，防止溶液挥发)，使纸芯片表面带强正电荷；取出圆形纸芯片，分别用95％乙醇和去离子水清洗三次，以去除未反应的APTMS；置于在室温下干燥30min；将40μL 1mg/mL的金纳米颗粒(AuNPs，购买自西安齐岳生物科技有限公司，Q-0099181)滴加在经APTMS修饰的圆形纸芯片上，室温孵育30min，在静电吸附的作用下AuNPs被牢固固定在圆形纸芯片表面；用二次水洗涤三次，以去除多余的AuNPs，再在室温下干燥30min，即得到AuNPs@paper。

2.DNA四面体(TND)的负载

取20μL实施例1制备得到的TND滴加到AuNPs@paper上，室温反应12h，在Au-S键作用下，TND被固定于纸芯片上，即得到TND@AuNPs@paper。

3.外泌体捕获芯片的扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)表征

通过SEM对修饰AuNPs的纸芯片(TND@AuNPs@paper)进行表征，结果如图3所示，在修饰AuNPs的纸芯片上可以观察到均匀分散的纳米颗粒，纸纤维保持完整的结构未被破坏(图3中(a))。在低倍下观察，修饰AuNPs后的纸芯片依然保持其多孔形态，这保证了纸芯片的过滤功能和对液体的芯吸作用(图3中(b))。

4.TND固定在纸芯片的表征

通过荧光倒置显微镜观察修饰了荧光标记的TND纸芯片的荧光强度。结果如图4所示，未修饰TND的纸芯片(AuNPs@paper)在荧光倒置显微镜下为黑色，无荧光信号；而经荧光标记的TND修饰的纸芯片(TND@AuNPs@paper)观察到强烈的红色荧光。结果表明TND可以通过Au-S键作用高效地固定到纸芯片上。

实施例4外泌体纯化芯片的制备与表征

1.癌细胞外泌体纯化芯片的制备

用打孔器将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜制备成直径为13mm的圆形芯片；置于甲醇(≥99.5％)中活化10s；取出芯片，经PBS洗涤后，在芯片上滴加40μL1μg/mL的羊抗兔抗体EpCAM(affbiotech，DF6311)、PTK7(SAB，31752)和ASGPR1(huabio，ER1903-98)混合溶液，在4℃下孵育4h，在强静电吸附作用下，抗体被固定到PVDF膜表面；然后将孵育后的芯片用PBS缓冲溶液冲洗3次，以去除多余的抗体；然后将其置于5w/v％的脱脂奶粉液中，4℃孵育过夜，以封闭未结合的活性位点，防止蛋白质的非特异性吸附，即制备得到肝癌细胞外泌体纯化芯片(Ab@PVDF)。

(2)Ab@PVDF的表征

取20μL 0.2μg/mL的HRP修饰的羊抗兔二抗(博士德生物科技有限公司，BA1055)滴加到Ab@PVDF上，室温孵育60min；用PBS洗涤芯片，以洗掉多余的二抗；加入20μL TMB显色液(G-CLONE，货号：PN3211)后观察芯片颜色变化。

结果如图5所示，修饰抗体的PVDF芯片由无色变为深蓝色，未修饰抗体的空白芯片的蓝色难以通过肉眼分辨，通过ImageJ图像识别软件读出颜色强度的灰度值GI分别为87.75和154.28，结果表明抗体成功修饰到PVDF膜上，成功制得Ab@PVDF。

实施例5

一种外泌体纯化纸基平台装置，由一个四室容器、两个过滤器支架和一个蠕动泵组成；四室容器由四个池子组成：储存样品溶液的样品池、储存PBS溶液的洗涤池、储存1nM释放探针(序列见表1)的洗脱池和收集废液的废液池，每个池的底部均有一个阀门控制液体流动；两个过滤器支架分别固定外泌体捕获芯片(TND@AuNPs@paper)和癌细胞外泌体纯化芯片(Ab@PVDF)，通过内径为3mm的乳胶管与样品池和蠕动泵连接。过滤器支架是可重复使用的标准过滤器支架(内径13mm)，带有一个入口和一个出口(图1)

外泌体纯化纸基平台装置的工作原理如下：样品在蠕动泵驱动下流动，所有的外泌体被TND@AuNPs@Paper芯片上的CD63适配体(AptCD63)捕获；接着，释放探针可以通过碱基互补配对竞争杂交的方式释放被捕获的外泌体；被释放的外泌体经过纯化芯片时，表达肝癌蛋白标记物的外泌体被捕获到Ab@PVDF上。最后，通过对Ab@PVDF的外泌体进行检测，即可实现样品中肝癌外泌体的检测。

实施例6

利用实施例5的外泌体纯化纸基平台装置对肝癌细胞的外泌了进行分离纯化，具体如下：

取200μL 1.0×10

对释放的外泌体进行透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)表征和纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，测定捕获外泌体数量和粒径分布。结果如图6所示，TEM显示释放的外泌体尺寸在50nm～120nm范围。NTA显示外泌体粒径分布的主峰为105.7nm，浓度为8.52×10

进一步的，在蠕动泵驱动下，被TND@AuNPs@paper释放出的外泌体匀速经过Ab@PVDF芯片后，表达有EpCAM、PTK7、ASGPR1的外泌体被捕获。通过SEM验证外泌体被捕获到Ab@PVDF芯片上。结果如图8所示，在未捕获外泌体的Ab@PVDF芯片上表面仅观察到光滑的多孔网格结构(图8中(a))，而在捕获了HepG-2来源外泌体的Ab@PVDF芯片上(Exosomes@Ab@paper)，大量小于200nm的球形囊泡被捕获到芯片上(图8中(b))。结果表明，实施例5的外泌体纯化纸基平台装置可以选择性纯化捕获肝癌细胞来源的外泌体。

对比例1无四面体结构的外泌体捕获芯片(AptCD63@AuNPs@paper)

采用实施例3的方法制备无四面体结构的AptCD63@AuNPs@paper，唯一区别在于，将TND替换成AptCD63(序列见表1)。

将无四面体结构的AptCD63@AuNPs@paper与实施例3的四面体结构的TND@AuNPs@paper置于实施例5的外泌体纯化纸基平台装置，在相同条件下，对肝癌细胞来源的外泌体进行特异性捕获，比较两者对含有肝癌细胞来源的外泌体血清的分离效率，结果如图9所示，无四面体结构的AptCD63@AuNPs@pape对外泌体的回收率仅为30.8％，显著低于实施例3的TND@AuNPs@paper对外泌体的回收率(85.2％)，更高的回收率可能是因为与单链DNA相比，四面体DNA纳米结构有更好的空间取向，位阻效应显著降低。可见表明，采用具有四面体结构的TND@AuNPs@paper可以高效地从复杂血清样品中分离和释放外泌体。

实施例7

一种基于纸基的酶联免疫吸附测定(P-ELISA)的肝癌外泌体的可视化检测方法，包括以下步骤：

(1)采用实施例5的外泌体纯化纸基平台装置对待测肝癌外泌体样本进行分离纯化；

(2)将10μL 1μg/mL anti-CD63(生工生物科技有限公司，D198650)滴加到捕获了肝癌外泌体的Ab@PVDF芯片上(Exosomes@Ab@paper)，室温孵育1h；利用PBS充分洗涤孵育后的Exosomes@Ab@paper，以洗掉未反应的anti-CD63；加入10μL 0.02μg/mL的HRP耦合的羊抗兔二抗(博士德生物科技有限公司，BA1075)，室温孵育60min；利用PBS充分洗涤，以洗掉多余的二抗；加入20μL TMB显色液，观察并拍照记录芯片的颜色变化。

实施例8

利用实施例7的可视化检测方法对含有不同浓度(0mL

结果如图10所示，当血清样品中外泌体浓度为1.0×10

实施例9

利用实施例7的可视化检测方法对肝癌外泌体的血清样品、正常肝细胞来源的外泌体(由实施例2制得)和无外泌体的血清样品进行检测，以评估该可视化检测方法的特异性。

结果如图所11所示，捕获1.0×10

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。