一种用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体及其制备和应用，属于生物分析技术领域。

背景技术

蛋白质是细胞的基本单元，也是细胞生物功能中最重要的执行者之一。蛋白质与其他蛋白质或生物分子协同工作以实现特定的生物学功能。因此，深入了解蛋白质与蛋白质间的相互作用对于精确了解潜在的分子生物学过程是非常必要的。此外，细胞内的天然环境，例如PH、亚细胞器，缓冲盐浓度等，也是蛋白质执行功能所必需的。因此，研究天然环境或体内的蛋白质结构，是充分理解蛋白执行功能的重要途径。

目前已有许多方法来表征蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质构象，其中，化学交联质谱(XL-MS)是新兴的一种通过交联反应和质谱分析鉴定共价交联的残基的方法，其通过提供空间位置紧密的氨基酸残基的内部和分子间交联信息，该空间主要与交联剂的连接臂有关(例如，通过分子动力学模拟，双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)交联赖氨酸残基的Cα(蛋白质骨架的α碳)原子之间的最大约束距离为

线粒体作为细胞的加油站，为细胞提供能量。研究线粒体蛋白质复合物，对线粒体中蛋白质复合物进行时空动态变化规律的分析，对于解析蛋白质复合物在生物途径中如何发挥作用至关重要。由于交联剂没有靶向性和反应活性高易水解的局限性，化学交联技术对于线粒体中的蛋白质相互作用分析，仍需分离线粒体后离体状态下交联，使用非生物相容性溶剂以及细胞器的分离过程将造成对细胞的真实状态的刺激，无法实现在自然的细胞条件下获得蛋白质复合物结构及相互作用信息。因此，亟需发展在活细胞水平上可实现线粒体内蛋白质复合物原位分析方法，以满足线粒体内蛋白质复合物原位结构解析的需求。

脂质体载体具有独特而优良的特性，1)生物相容性好：载体由类磷脂双分子层的磷脂包覆水相囊泡构成；2)对所载药物有广泛的适应性：可以将水溶性药物载入水相内，脂溶性药物溶于磷脂膜内，两亲性药物可插于脂膜上，实现同时包载亲水和疏水性药物；3)生物利用度高：磷脂本身是细胞膜成分，注入体内后无毒，不引起免疫反应：4)保护所载药物，防止体液对药物的稀释和被体内酶的分解破坏。因其生物相容性好，稳定，快速入胞等特点，脂质体类药物载体已经进入的临床应用。因此结合脂质体递送药物的优势，将其应用到解决活细胞内线粒体蛋白质复合物原位分析困难的问题。

在本专利中，针对现有化学交联剂需要有机溶剂助溶和无法靶向输运而导致的活细胞内线粒体蛋白质复合物的原位分析困难的问题，发展用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体，以实现原位分析细胞内线粒体的蛋白质复合物的方法，以实现亚细胞器上蛋白质复合物的时空动态分析。

发明内容

本发明的目的是一种用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体及其制备和应用，通过本发明的方法解决了活细胞内包括线粒体在内的细胞器层面蛋白质复合物的原位分析困难的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体及其制备和应用，具体包括以下步骤：

(1)制备包裹交联剂的靶向线粒体的纳米脂质体，载体以合成磷脂为脂质体载体、以胆固醇以稳定剂，以功能化磷脂为脂质体的靶向驱动力，包载交联剂。

(2)其中天然磷脂和合成磷脂其特征包括：天然磷脂包括高纯蛋黄卵磷脂PC-98T、蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化大豆磷脂；合成磷脂包括，或PE类合成磷脂：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺DMPE、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、阳离子脂质体辅助磷脂等；或PC类合成磷脂：二月桂酰基卵磷脂DLPC、二芥酰磷脂酰胆碱DEPC、二油酰基卵磷脂DOPC、二肉豆蔻酰基卵磷脂DMPC、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂POPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、二棕榈酰基卵磷脂DPPC；或PS类合成磷脂：二棕榈酰磷脂酰丝氨酸DPPS、二油酰基磷脂酰丝氨酸DOPS；或PG类合成磷脂：二油酰磷脂酰甘油DOPG、蛋黄磷脂酰甘油EPG、1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油POPG-Na、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG-NA、二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG-Na、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG-Na；或PA类合成磷脂：二硬脂酰磷脂酸DSPA、二棕榈酰磷脂酸DPPA；以上天然磷脂或合成磷脂中的一种或两种以上。

其中纳米脂质体转运载体修饰具有线粒体靶向性的功能化磷脂，其特征在于：DSPE-PEG修饰靶向线粒体基团的磷脂或DPPE-PEG修饰靶向基团的磷脂或阳离子脂质体；其修饰的靶向线粒体基团包括：同时具有正电荷和亲脂性的氨基酸残基的以线粒体为靶点的肽，其中提供正电性的氨基酸残基为精氨酸(R)和/或赖氨酸(L)，其中提供亲脂性的氨基酸残基为苯基丙氨酸(phenylalanine,F)和/或环己基丙氨酸(cyclohexylalanine,Fx)，多肽的氨基酸残基数量范围为2-100。具体为SS-31肽(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)，或离域亲脂阳离子，具体为三苯基膦(triphenylphosphine,TPP)和地喹氯铵(dequalinium,DQA)，亲水性带电基团；或强正电化合物，具体为双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。其中阳离子脂质体，其特征在于：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)，DOP-DEDA，二油酰丙基氯化三甲胺(DOTMA)，以上功能化磷脂或阳离子脂质体中的一种。

(3)其封装交联剂，其特征在于：所述封装的交联剂包括：其两侧基团均为与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃、亚胺酸酯；或均为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基，吡啶基二硫化物；或均为与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺、异氰酸盐；或均为与蛋白上糖链反应的酰肼基团；或均为与蛋白质中的氨基酸残基发生反应的非特异反应基团的苯基叠氮基团、双吖丙啶；或与所述的交联剂其两侧基团分别为上述任一反应基团。

(4)载体制备方法包括薄膜超声法，其薄膜超声方法的制备的特征在于：将磷脂，胆固醇，功能性磷脂，和交联剂原料溶于与水不互溶三氯甲烷和甲醇的混合液中形成原料溶解油相，随后将原料溶解油相在圆底烧瓶中旋转蒸发干成膜，其中三氯甲烷与甲醇比例范围为0-100％，随后加入与原料质量成体积比水相超声，其中原料质量与水相的质量体积比例范围为0.1mg/ml-100mg/ml，超声后直接使用或经过确定孔径膜挤出后使用，其中膜孔径范围10-1000nm。

(5)包裹交联剂的修饰靶向基团的纳米脂质体转运载体与的细胞递送孵育为，共同孵育1-48小时，胰酶消化或者用细胞刮刮下收集细胞，也可以进一步通过分离处理收集细胞内特定部位。

包裹交联剂的载体通过动物模型进行递送时通过进行给药递送1-48h，递送后收集小鼠组织，组织研磨处理收集细胞，也可以进一步通过分离处理收集细胞内特定部位。

线粒体以及到达线粒体之前所途径细胞膜层面的蛋白质复合物为：细胞膜蛋白、高尔基体蛋白、内质网蛋白、胞内小体蛋白、线粒体外膜蛋白、线粒体内膜蛋白中的一种或两种以上。

(6)在收集的细胞中加入离子液体或者0.5-4wt％SDS并提取蛋白质和/或其复合物，然后加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，并进行高温变性，所述高温变性的温度为56℃-95℃；将高温变性后的样品转移至滤膜上、或者丙酮沉淀后获得蛋白复溶于5-10M尿素中，利用碘代乙酰胺或N乙基马来酰亚胺在滤膜上或这溶液中进行烷基化；利用胰酶对蛋白质和/或其复合物进行滤膜上或者5-10M尿素用10-50mM碳酸氢铵稀释至1M酶切，并利用离心收集肽段和/或其交联肽段样品。

(7)对上述收集到的肽段及其交联肽段，利用高分辨质谱对蛋白质和/或蛋白质复合物进行分析，包括：蛋白质及其蛋白质复合物定性分析和/或定量分析过程采用液质联用，所述液质联用中的质量分析器采用静电场轨道阱(Oribitrap)、飞行时间管(TOF)和傅里叶变换质谱(FT-ICR)等质谱中的一种或二种以上。

(8)用Mascot，pFind以及pLink对质谱数据进行解析，从而得到蛋白质及其交联蛋白质信息。用cytoscape，proxl-ms对蛋白质相互作用信息以及蛋白PDB位点匹配信息进行解析。

(9)一种用于递送交联剂至细胞内线粒体的纳米脂质体类转运载体及其制备和应用，包括细胞内线粒体、或细胞膜相关的蛋白质复合物规模化分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析以及线粒体的蛋白质的时空动态解析

本发明具有如下优点：

(1)本发明解决了交联剂在活细胞状态下胞内原位交联困难的问题。

(2)本发明解决了交联剂实现原位亚细胞器蛋白质和膜嵌合蛋白质的相互作用和结构信息解析困难的问题。

(3)本发明解决了交联剂通过脂质体类转运载体靶向递送至线粒体的问题。

具体实施方式

实施例1(包埋DSS的靶向线粒体脂质体类转运载体的薄膜超声制备及其应用)

制备以天然磷脂中的PC类磷脂的二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC为脂质体类转运载体，胆固醇为稳定剂，加入功能化磷脂DSPE-PEG-TPP(厂家:西安瑞禧)作为脂质体载体的靶向驱动力，包埋并递送交联剂(DSS，中文:双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。

取DSPC合成磷脂8质量份，胆固醇4质量份，DSPE-PEG-TPP4质量份，交联剂DSS12质量份，溶于9质量份的三氯甲烷和5质量份甲醇混合有机相中。将以上混合有机相置于圆底烧瓶中真空旋干成膜，随后加入磷酸盐缓冲液作为水相,使膜于其中的质量体积比为1.5mg/ml，在水浴超声中超声5min制备脂质体。所制备的包载交联剂的纳米脂质体的表面电荷和粒径如表1所示。

表1：包埋交联剂的脂质体类转运载体(DSPC:胆固醇：DSPE-PEG-TPP：DSS)的粒径和表面电势表征。

在37℃，体积深度5％CO

实验结果证明，薄膜超声法制备的纳米脂质体类转运载体实现了在细胞水平递送至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。

实施例2(包埋DSS的靶向线粒体脂质体类转运载体的薄膜超声制备及其应用)

制备以天然磷脂中的蛋黄卵磷脂为脂质体类转运载体，胆固醇为稳定剂，加入阳离子脂质体DOTAP(厂家：艾伟拓)，包埋并递送交联剂(DSS)。取蛋黄卵磷脂的天然磷脂10质量份，胆固醇16质量份，DOTAP4质量份，交联剂DSS20质量份，溶于20质量份的三氯甲烷和5质量份甲醇混合有机相中(V三氯甲烷：V甲醇＝3：1)。将以上溶于三氯甲烷和甲醇的混合有机相置于圆底烧瓶中真空旋干，随后加入15体积份的磷酸盐缓冲液作为水相,使之质量体积比为1mg/ml，在水域超声中超声3min，随后用200nm孔径的膜进行脂质体的挤出，制备脂质体。所制备的包载交联剂的纳米脂质体的表面电荷和粒径如表2所示。

表2：包埋交联剂的脂质体类转运载体(PE:胆固醇：DOTAP：DSS)的粒径和表面电势表征。

在37℃，5％CO2条件下，将70mg该包载交联剂DSS纳米脂质体转运载体(PE:胆固醇：DOTAP：DSS)与1e

实验结果证明，薄膜超声法制备的纳米脂质体类转运载体经挤出后使用，实现了在细胞水平递送至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。

实施例3(包埋BSPNO的靶向线粒体脂质体类转运载体的薄膜超声制备及其应用)

制备以合成磷脂中的PA类磷脂中的二硬脂酰磷脂酸DSPA为脂质体类转运载体，胆固醇为稳定剂，加入功能化磷脂DPPE-PEG-TPP，其中功能化磷脂是通过DPPE-PEG修饰靶向基团三苯基膦(TPP)生成的DPPE-PEG-TPP磷脂，包埋交联剂BSPNO(全名：双琥珀酰亚胺酯炔丙基硝基交联剂，其中交联臂长为7个碳，交联臂上接枝有富集基团-生物素)。取DSPA的合成磷脂5质量份，胆固醇4质量份，功能化磷脂DPPE-PEG-TPP1质量份，交联剂BSPNO5质量份，溶于9质量份的三氯甲烷和6质量份甲醇混合有机相中(V三氯甲烷：V甲醇＝3：1)。将以上溶于三氯甲烷和甲醇的混合有机相置于圆底烧瓶中真空旋干，随后加入10体积份的磷酸盐缓冲液作为水相,使质量体积比为1.5mg/ml，在水域超声中超声5min制备脂质体，超声后直接使用。

选择无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)小鼠，小鼠的模型构建为原发肝癌肿瘤小鼠模型。通过皮下注射100μl脂质体(DSPA:胆固醇：DPPE-PEG-TPP:BSPNO)，分别进行给药递送2，4，9，12h，递送后收集小鼠组织(心脏，大脑，肝脏和骨骼肌肉(腿)，肿瘤部位，淋巴脾脏等)，将各个时间点组织研磨处理收集细胞，每部分所收集细胞分别进行样品预处理，加入离子液体对细胞中蛋白进行提取，提取之后加入点击试剂对交联肽段进行点击生物素，点击后的蛋白进行丙酮沉淀以除去多余的生物素小分子，之后复溶于8M尿素，蛋白进行变性还原烷基化处理，酶解生产肽段，在肽段水平进行富集，除盐后分级。采用液质联用系统对收集肽段及其交联肽段进行分析，质谱选择具有高精度和高分辨的质量分析器：静电场轨道阱(Oribitrap)。通过质谱分析后使用Mascot和pLink对质谱数据进行解析，其中一组交联鉴定结果为鉴定到的交联肽段(Cross-linked Peptides Pairs)为5条，鉴定到的内部交联的肽段(Loop-linked Peptides Pairs)为4条，鉴定到的单交联的肽段(Mono-linked Peptides Pairs)为12条。如表3所示。

表3包埋交联剂的脂质体类转运载体用于小鼠体内原位交联后蛋白交联信息的鉴定，使用plink进行交联信息的检索(FDR＝1％)。

Identification of Peptides(Pairs)Under 1％FDR Control.

实验结果证明，靶向性包埋交联剂脂质体类转运载体实现了在活体水平递送交联剂至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。