一种准确灵敏检测环境样品中抗生素的方法

技术领域

本发明涉及环境样品中抗生素的高效液相色谱质谱检测技术领域，具体涉及一种准确灵敏检测环境样品中抗生素的方法。

背景技术

抗生素主要用于医疗卫生及畜禽养殖、水产养殖行业等，抗生素的广泛使用，在提高了人们的生活质量的同时也导致其过量使用现象极为普遍。大量的抗生素残留于环境中并长期积累，对水中微生物群落造成损害并对水生生物造成影响。同时可以破坏生态系统，并通过食物传送进入人体，对生态、人体健康均存在较高的风险。此外，环境中抗生素的长期残留能够提高病菌的耐药性，对全球健康造成极大的威胁。通过科学的检测方法对环境中抗生素残留量进行定量分析，为客观评估抗生素的风险的同时，进一步研究其迁移转化等均意义重大。

现有报道中，对土壤及沉积物中抗生素的提取使用超声提取，缓冲溶液的组分是EDTA-Mcllvaine溶液，通过多次超声提取后离心合并提取上清液，此方法一则不易控制超声波水温，造成样品提取重现性差，且多次提取，离心，合并等步骤繁琐，多次更换容器，均存在降低样品回收效率的风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确灵敏检测环境样品中抗生素的方法，以克服现有技术检测环境样品时，检测限高、抗生素漏检率高、以及抗生素检测谱窄的问题。

本发明发现，在对环境样品的前处理过程中，选择恰当的富集方法、萃取方式，以及萃取适用的有机溶剂和萃取条件，能够使待检测样品获得更全面的抗生素富集，并采用高效液相色谱串联质谱法能够实现对环境样品、特别是环境水质、土壤、沉积物中抗生素残留的准确、快速、灵敏的检测。

环境中样品为液体样品，如环境中的各种水质取样；固体样品，如土壤、沉积物等。

若环境样品为液体样品，在采集时，将液体样品加入棕色玻璃瓶中，每1L液体样品中再加入0.5g Na

将采集的样品置于采样箱中，当天运回实验室，运回当天沉积物和土壤样品从玻璃瓶中转移出来保存在-20℃的冰柜中，待冷冻干燥和后续的前处理操作；水质样品当天进行前处理。

本发明实施例中，是将固体样品运回实验室后，首先置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，充分去除沉积物水分。干燥好的样品经适当研磨过10目筛，去除筛上非土成分。为了增大后续ASE提取的比表面积，需要将过10目筛的样品进一步研磨，然后过60目筛，过筛后装入自封袋。以备对样品进行前处理。

具体来讲前处理的操作是，(1)若环境样品为液体样品，对液体样品进行前处理的方法是：将液体样品固相萃取前加入替代物卡巴氧(20μl，浓度为1ug/ml)，固相萃取柱用乙酸乙酯、甲醇、超纯水依次活化；萃取后采用甲醇洗脱样品；或

(2)若环境样品为固体样品，对固体样品进行前处理的方法是：将干燥的固体样品研磨后采用ASE萃取技术进行前处理，萃取溶剂为EDTA-mellvaine/甲醇。

(3)将前处理后的液体样品或固体样品采用高效液相色谱-串联质谱法LC/MS/MS进行检测。

EDTA-Mcllvaine溶液配置方法为：37.2g乙二胺四乙酸二钠、27.5g磷酸氢二钠和12.9g柠檬酸溶解于1L水中。以EDTA-Mcllvaine溶液与甲醇按8％-12％的体积比混合配制获得EDTA-mellvaine的甲醇溶液。

所述(1)中，乙酸乙酯、甲醇与超纯水的用量体积比为1:1:2，依次进行活化。固相萃取的控制流速为3mL/min。萃取结束后用超纯水淋洗HLB柱管壁，淋洗结束后将固相萃取柱真空抽干以去除水分，采用3×3mL(是指洗脱3次，每次3ml)甲醇将样品洗脱于容器中，每次将甲醇在管内停留3-6min以充分洗脱抗生素，之后控制流速为1mL/min。

对固相萃取柱进行活化，是为了打开键合在硅胶上的碳基团链,使之充分发生作用，过程中使用甲醇是为了让碳链互溶，上述步骤中加入乙酸乙酯活化是本发明的改进措施，现有技术的活化通常是用甲醇和水，而本发明发现先用乙酸乙酯对固相萃取柱进行活化，再用甲酸与水活化可更好的提升小柱富集效率，用水是为了能和样品溶液相溶。

所述(2)中，萃取溶剂为8％-12％的EDTA-mellvaine的甲醇溶液，所述％为体积百分比。

进一步地，所述(1)中，洗脱后获得的样品为净化液，吹干，加入浓度均为500μg/ml的内标混合物200μl(磺胺D5、恩氟沙星D5、去甲基金霉素、罗红霉素D7、氯霉素D5的混标，五种内标物的体积比是否为1:1:1:1:1)用初始流动相0.5％甲酸-水溶液/乙腈(95/5，V/V)定容，得前处理后的液体样品的待测样品；

本发明的实施例是加入内标后用初始流动相1％甲酸-水溶液/乙腈(95/5，V/V)定容至1ml，旋涡混匀后转移至进样瓶中，密封冷藏待分析。

或，所述(2)中ASE萃取条件为50±10℃，1500psi，预热5min，静态萃取10-15min，冲洗体积60％，循环2次。

优选地，所述(2)中，萃取溶剂为8-12％的EDTA-mellvaine：甲醇溶液，萃取条件为50℃，1500psi，预热5min，静态萃取10min，冲洗体积60％，循环2次。

本发明的实施例中，对固体样品的萃取方法是：取洗净并干燥的萃取池，组装好后在萃取池底部加入一张ASE滤膜，并依次在萃取池内填充5g硅藻土，5g沉积物样品，加入替代物卡巴氧(20μl浓度为1ug/ml)，5g硅藻土，其中硅藻土需要预先在400℃条件下灼烧4h，装填后体积占萃取池2/3以上，不要压实。将填装好的萃取池编好号依次放于ASE上，底部放好已编好号并与萃取池对应的萃取瓶，萃取瓶在使用前应洗净并晾干，并用铝箔纸封口。检查溶剂瓶中的萃取溶剂是否足量，以及氮气是否充足。萃取溶剂选为8-12％的EDTA-Mellvaine-甲醇溶液，设置萃取条件为50±10℃，1500psi(预热5min，静态萃取10-15min，冲洗体积60％，循环2次)。

更进一步地，所述(2)中，还包括将萃取液进行净化和浓缩定容；所述净化是在萃取液浓缩至5ml附近后，加入5ml的甲醇-水溶液(20/80，V/V)，用固相萃取HLB小柱富集，用甲醇洗脱，再进行氮吹至净干；

所述浓缩定容是指将净化液在全自动氮吹仪中氮吹浓缩至小于0.5ml，再取出继续氮吹直至净干，加入内标，用初始流动相1％甲酸-水溶液/乙腈(95/5，V/V)，定容至1ml，用微孔滤膜过滤入样品瓶，得前处理后的待测样品。

在对液体样品或固体样品前处理之后，将待测样品采用高效液相色谱-串联质谱法LC/MS/MS进行检测，液相色谱-串联质谱联用采用Agilent 1260高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器(美国Agilent公司)；6460 Triple Quad型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及MassHunter数据处理软件(美国Agilent公司)。

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱，1.8μm粒径，2.1mm×50mm I.D，美国Agilent公司；

载气流速：0.4mL/min；柱温：35℃；MS离子源：电喷雾离子化源(AJS ESI)，负离子方式检测时离子喷射电压为-3500V，正离子方式检测时离子喷射电压为4000V；离子源温度：320℃；流量：8.0l/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：10l/min；扫描方式为多重反应监测(Dynamic MRM)。

梯度洗脱：采用水(A)、乙腈(B)为流动相，乙腈的比例分别在0-5min内由5％升到30％，5-6min内升到35％，6-7min内升到40％，7-9min内升到60％，9-10min内升至95％，10-12min内维持在95％，以上百分比均为体积百分比流动相梯度条件详见表1。

表1流动相梯度条件

内标物与替代物的选择必须为性质相近且自然界不存在的物质，本发明通过大量繁琐的筛选验证工作，最终选取最合适的内标物及替代物，经过反复实验，最终确定内标为磺胺D5、恩氟沙星D5、去甲基金霉素、罗红霉素D7、氯霉素D5的混合物，替代物是卡巴氧，对其质谱条件进行摸索，以提高检测准确性。

表2内标物及替代物仪器参数

本发明使用ASE快速溶剂萃取装置，通过控制稳定的温度、压力，提高抗生素萃取效率的同时，减少中间环节，更加便捷。通过查阅26种抗生素物质的物理化学性质，兼顾亲水性和疏水性的抗生素物质，综合考虑使用可与水质溶液混合较为均匀的甲醇作为有机溶剂与EDTA-Mcllvaine溶液混合作为提取液，其优势在于溶解性、环保性以及经济性能均较好，通过摸索其最佳混合体积比例，筛选最佳的萃取条件，最终获取萃取效率最佳，溶剂使用最少，过程最为环保，毒性最低的综合方法。

本发明的有益效果在于，本发明方法对环境样品中的液体样品和固体样品采用适宜的前处理方法，具体确定了8％-12％的EDTA-mellvaine的甲醇溶液为ASE萃取有机溶剂，筛选了最佳的萃取条件，对待测样品进行了上述方式的前处理后，确定内标为磺胺D5、恩氟沙星D5、去甲基金霉素、罗红霉素D7、氯霉素D5的混合物，替代物是卡巴氧，对其质谱条件进行摸索，提高检测准确性。采用高效液相色谱串联质谱方法一次操作可实现对环境样品中残留的5大分类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类)共29种常见抗生素的快速、灵敏的检测，环境水中磺胺嘧啶的检测限低至0.017μg/L，土壤中磺胺嘧啶的检测限低至0.009μg/kg，具有针对29种常见抗生素的良好的检测精密度和准确度，可用于环境中水质、土壤和沉积物的抗生素残留筛查。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明EDTA-mellvaine的甲醇溶液的配置方法为：EDTA-Mcllvaine溶液：37.2g乙二胺四乙酸二钠、27.5g磷酸氢二钠和12.9g柠檬酸溶解于1L水中。以EDTA-Mcllvaine溶液与甲醇按8％-12％的体积比混合配制获得EDTA-mellvaine的甲醇溶液。

实施例1检测环境样品中抗生素的方法

1、样品为液体样品

(1)在采集环境中液体样品时，将液体样品加入棕色玻璃瓶中，每1L液体样品中再加入0.5g Na

(2)对液体样品进行前处理的方法是：将液体样品固相萃取前加入替代物卡巴氧(20μl，浓度为1ug/ml)，固相萃取柱用乙酸乙酯、甲醇、超纯水依次活化；萃取后采用甲醇洗脱样品。乙酸乙酯、甲醇与超纯水的用量体积比为1:1:2，依次进行活化。固相萃取的控制流速为3mL/min。萃取结束后用超纯水淋洗HLB柱管壁，淋洗结束后将固相萃取柱真空抽干以去除水分，采用3×3mL(是指洗脱3次，每次3ml)甲醇将样品洗脱于容器中，每次将甲醇在管内停留3-6min以充分洗脱抗生素，之后控制流速为1mL/min。

洗脱后获得的净化液吹干，加入浓度均为500μg/ml的内标混合物200μl(磺胺D5、恩氟沙星D5、去甲基金霉素、罗红霉素D7、氯霉素D5的混标)用初始流动相0.5％甲酸-水溶液/乙腈(95/5，V/V)定容，至1ml，旋涡混匀后转移至进样瓶中，密封冷藏待分析，得前处理后的液体样品的待测样品。

2、样品为固体样品

(1)将固体样品运回实验室后，首先置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，充分去除沉积物水分。干燥好的样品经适当研磨过10目筛，去除筛上非土成分。为了增大后续ASE提取的比表面积，需要将过10目筛的样品进一步研磨，然后过60目筛，过筛后装入自封袋。以备对样品进行前处理。

(2)对固体样品进行前处理

对固体样品前处理时，活化小柱的方法与液体样品前处理方法相同。

取洗净并干燥的萃取池，组装好后在萃取池底部加入一张ASE滤膜，并依次在萃取池内填充5g硅藻土，5g沉积物样品，加入替代物卡巴氧(20μl浓度为1ug/ml)，5g硅藻土，其中硅藻土需要预先在400℃条件下灼烧4h，装填后体积占萃取池2/3以上，不要压实。将填装好的萃取池编好号依次放于ASE上，底部放好已编好号并与萃取池对应的萃取瓶，萃取瓶在使用前应洗净并晾干，并用铝箔纸封口。检查溶剂瓶中的萃取溶剂是否足量，以及氮气是否充足。萃取溶剂选为8-12％的EDTA-Mellvaine-甲醇溶液，设置萃取条件为50±10℃，1500psi(预热5min，静态萃取10-15min，冲洗体积60％，循环2次)。

将萃取液进行净化和浓缩定容；所述净化是在萃取液浓缩至5ml附近后，加入5ml的甲醇-水溶液(20/80，V/V)，用固相萃取HLB小柱富集，用甲醇洗脱，再进行氮吹至净干；

所述浓缩定容是指将净化液在全自动氮吹仪中氮吹浓缩至小于0.5ml，再取出继续氮吹直至净干，加入内标，用初始流动相1％甲酸-水溶液/乙腈(95/5，V/V)，定容至1ml，用微孔滤膜过滤入样品瓶，得前处理后的待测样品。

3、在对液体样品、固体样品前处理之后，将待测样品采用高效液相色谱-串联质谱法LC/MS/MS进行检测，

(1)液相色谱条件

液相色谱-串联质谱联用为：Agilent 1260高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器(美国Agilent公司)；6460 Triple Quad型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及MassHunter数据处理软件(美国Agilent公司)。

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱，1.8μm粒径，2.1mm×50mm I.D.，美国Agilent公司；

载气流速：0.4mL/min；柱温：35℃；MS离子源：电喷雾离子化源(AJS ESI)，负离子方式检测时离子喷射电压为-3500V，正离子方式检测时离子喷射电压为4000V；离子源温度：320℃；流量：8.0l/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：10l/min；扫描方式为多重反应监测(Dynamic MRM)。

梯度洗脱：采用水(A)、乙腈(B)为流动相，乙腈的比例分别在0-5min内由5％升到30％，5-6min内升到35％，6-7min内升到40％，7-9min内升到60％，9-10min内升至95％，10-12min内维持在95％，以上百分比均为体积百分比。

(2)质谱条件：化合物质谱具体参数见下表3。

表3抗生素类仪器参数

(3)标准曲线

称取待测物单标以及替代物0.1g，用甲醇定容至10ml，配置为10mg/ml原液，放置到棕色玻璃瓶中4℃密封保存；取1ml原液定容至10ml配置为1000μg/ml储备液，放入棕色玻璃瓶于4℃低温保存待用。内标物质(磺胺D5、恩氟沙星D5、去甲基金霉素、罗红霉素D7、氯霉素D5均购买可得，将它们等体积混合可得本发明的内标物)，均为液体，均稀释到10μg/ml作为储备液。

分别取含26种已知抗生素的待测物储备液10μl至10ml容量瓶，甲醇定容，配置为1μg/ml使用液。内标物均取500μl至10ml容量瓶中，甲醇定容至10ml配置为500μg/L使用液。替代物稀释为10μg/ml及1μg/ml 2种使用液。曲线系列配制见下表4，溶剂为初始流动相，即5/95乙腈/水溶液。

表4标准曲线配制

(4)检出限

液相色谱-串联质谱联用对抗生素类物质的最低检测限见表5，依据HJ168-2010附录A计算检出限。即在空白机质中加入混合标液，按照样品分析的全部步骤处理，保证被分析物样品浓度在3～5倍计算出的方法检出限的范围内。

表5采用本发明方法的水质、土壤中抗生素检出限

(5)精密度和准确度

取标准曲线最高点的0.1,0.5,0.9倍混标浓度(80ng/L,400ng/L,720ng/L)，每个浓度取6份同样的平行，加入空白土壤基体中,与样品相同前处理。6个相同浓度样品计算RSD，为精密度，本结果为高、中、低三个浓度精密度均值；准确度为三个浓度加标回收率均值。平行样指的是同一样品保证全程序统一的处理，以验证实验过程的精密度；加标样指的是在样品中加入已知浓度的目标物，通过检测样品浓度和加标样品浓度，计算加入目标物的回收效率，以确定实验过程的准确度。

表6水质、土壤中抗生素精密度、准确度

实施例2环境水质采样过程中液体样品增加加入甲醇固定，稳定保存效果更好

在水质样品前处理其它环节相同，在前期采样中设置每1L液体样品中加入0.5gNa

表7水质样品采集固定剂加入对比试验

实施例3环境水质采样后样品前处理方法的优化

采集到的液体样品，采用HLB固相萃取柱富集前，增加乙酸乙酯作为活化试剂，可提升小柱富集效率。

本实施例在液体样品前处理过程中，仅在HLB固相萃取小柱活化中设置加入乙酸乙酯和不加入乙酸乙酯作为对比条件，其他方法参见实施例1，结果如下：

表8水质样品富集环节对比试验

实施例4样品前处理方法中萃取溶剂的筛选

(1)研磨过筛

沉积物样品运回实验室后，首先应该置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，充分去除沉积物水分。干燥好的样品经适当研磨过10目筛，去除筛上非土成分。为了增大后续ASE提取的比表面积，需要将过10目筛的样品进一步研磨，然后过60目筛，过筛后装入自封袋。

(2)ASE萃取

取洗净并干燥的萃取池，组装好后在萃取池底部加入一张ASE滤膜，并依次在萃取池内填充5g硅藻土，5g沉积物样品，加入替代物卡巴氧(20μl浓度为1ug/ml)，5g硅藻土，其中硅藻土需要预先在400℃条件下灼烧4h，装填后体积占萃取池2/3以上，不要压实。将填装好的萃取池编好号依次放于ASE上，底部放好已编好号并与萃取池对应的萃取瓶，萃取瓶在使用前应洗净并晾干，并用铝箔纸封口。检查溶剂瓶中的萃取溶剂是否足量，以及氮气是否充足。本发明萃取溶剂选为10％的EDTA-Mellvaine-甲醇(同时设置3种萃取溶剂的对比组，分别为对比组1：溶剂仅为EDTA-MMellvaine；对比组2溶剂为EDTA-MMellvaine-正己烷；对比组3溶剂为EDTA-MMellvaine-丙酮(浓度均为10％))，设置萃取条件为50±10℃，1500psi(预热5min，静态萃取10-15min，冲洗体积60％，循环2次)。

(3)净化、浓缩定容

用全自动氮吹仪将ASE萃取液氮吹浓缩，在吹到5ml附近时，加入5ml的甲醇-水溶液(20/80，V/V)开始净化，用HLB小柱富集，用甲醇洗脱，再进行氮吹至净干，用初始流动相水/乙腈(95/5，V/V)，定容至1ml，用微孔滤膜过滤入样品瓶，待测。

选取不同的萃取溶剂对土壤样品进行前处理，其他方法参见实施例1，回收率结果见下表9。

表9土壤样品萃取溶剂选取对样品回收率的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。