一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法

技术领域：

本发明涉及一种多肽的提取方法，特别是涉及一种从人胎盘血中提取具有抗氧化能力的多肽的方法。

背景技术：

胎盘多肽是二十一世纪生命科学的革新产品，它是利用现代高科技手段从胎盘中提取的人体需要、也适合人体吸收的生物产品，同时具备缓解疾病和调节人体机能、补充各种生物营养物质、预防疾病发生的多种功效。无论是在临床应用，还是在美容保健等领域，其功效和安全性都是值得认可的。

《本草纲目》称人胎盘为紫河车，提到：紫河车具有“安神养血、补气、益精、补血的作用”，“久服者，耳聪目明，须发黑，延年益寿，有夺造化之功”。紫河车作为药用已有数百年历史，且在不断延伸扩展。胎盘多肽则是从健康产妇胎盘组织液中精致萃取的小分子核酸多肽，含有多种营养素、生长因子及因子等，这些大量的活性成分帮助协调、提高自身免疫力，增强新陈代谢，促进受损细胞和创伤组织的自我修复和愈合；具有抗病毒、抗感染、抗过敏、抗突变、抗肿瘤等缓解及预防保健作用。

胎盘多肽具有广泛的生物学活性，应用于医学美容，其作用全面、效果确切。例如：因其含有大量生长因子，如表皮生长因子，可促进皮肤的新陈代谢；全面的营养素，有效解决皮肤营养不良等问题；其抗感染，抗过敏，能增加细胞功能，增强巨噬细胞活性，具有改善局部营养、生肌、促进切口愈合的作用，尤其对脂肪液化引起的切口障碍，疗效更显著；能够改善更年期症状，提高生活质量等。

常见的胎盘多肽提取都是以胎盘组织为原料，采用高温煮沸，超滤提取等技术提取，制备过程中胎盘中留存的胎盘血被冲洗掉，既会对环境造成污染，又浪费了宝贵的蛋白资源。胎盘血液主要成分为多种蛋白质，含少量脂类、葡萄糖及无机盐等。蛋白质主要是血红蛋白，其次是血清白蛋白、血清球蛋白和少量纤维蛋白。血浆蛋白经酶解后，酶解物组成中含有丰富的肽，其分子量大小不一，功能各异，已经报道的包括增强免疫力、抗高血压、抗菌、抗氧化等功能。

近几年来采用动物血液蛋白源制备生物肽的研究较为活跃，Brant报道从牛血血红蛋白中分离得到两种吗啡肽。任建东等曾报道过在鹿茸血的Alcalase水解物有抗氧化活性和ACE抑制活性作用。刘骞中等人研究了酶水解猪血浆蛋白的工艺条件，获得具有抗氧化活性的猪血浆蛋白肽，但是对人胎盘血提取多肽的研究较少。

公开号为CN103784935A的中国发明专利公开了一种采用超滤技术提取胎盘血中多肽的方法，用反复冻融的方法获得多肽提取液，用截留分子量为10000D的超滤膜超滤多肽提取液，提取的多肽分子量大，抗氧化能力低。

发明内容：

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种能够从人胎盘血中提取抗氧化能力强、易吸收的小分子多肽的方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法，其包括如下步骤：(1)原料检测筛选；(2)收集胎盘血和冲洗水；(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理；(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理；(5)冻融处理后物料进行酶解；(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液；其中，

所述步骤(5)冻融处理后物料进行酶解的具体操作方法为：检测冻融物料的蛋白浓度，用纯水调节最终底物蛋白浓度为5-8％，调节冻融瓶中物料的pH值到6.0-8.0，按照底物蛋白含量加入碱性蛋白酶为2400-3000U/g，放入气浴恒温摇床中，温度设置成50-55℃，酶解3-5h，得到酶解液。

进一步，所述步骤(1)原料检测筛选：收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、梅毒和艾滋检测合格后作为原料。

进一步，所述步骤(2)收集胎盘血和冲洗水：将合格的胎盘放入无菌托盘中，清除胎盘表面血污；用无菌的剪刀将胎盘剪成3-5厘米的组织块，并用2-3升注射用水进行组织表面和内部冲洗3-5次，挤压收集胎盘血和冲洗水后，弃除胎盘组织。

进一步，所述步骤(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理：将收集的胎盘血和冲洗水装入无菌容器充分混匀后，向混匀后的液体中通15-20mg/L臭氧10-20分钟，进行病原微生物灭活处理；防止在以后的冻融过程中细菌大量增殖，影响产品质量。

进一步，所述步骤(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理：经病原微生物灭活处理后的液体进行2-4次冻融，冷冻温度在零下40℃，融化温度控制在10-25℃，控制每次融化时间不超过12小时，防止时间过长，造成物料的变质和活性物质的损失。通过本发明冻融处理，可以使得胎盘血里的细胞在冻融的过程中破裂，有助于在后期酶解步骤中产生更多的具有抗氧化能力的小分子多肽。

进一步，所述步骤(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液：酶解液以4000-6000rpm离心20-50分钟后取上清液；然后用0.45um的滤膜过滤掉上清液中的细胞碎片，再用截留分子量为3-5KD的超滤膜过滤收集小分子多肽超滤液，最后用0.22um的滤膜过滤小分子多肽超滤液，进行除菌，得到小分子多肽无菌溶液；得到的小分子多肽无菌溶液需要在零下40℃～零下80℃冷冻保存，可避免本发明制备的小分子多肽的肽键水解断裂，能够稳定保存多肽液体。

进一步，将得到的小分子多肽超滤液制备成冻干粉，具体方法为：在每100ml所述小分子多肽超滤液中加入6g的冻干保护剂，用0.22um的滤膜过滤除菌，分装至1ml/支，按照冻干程序进行冻干。

进一步，所述冻干程序具体为：首先在零下50℃预冻2-3.5h，然后在冻干压力为20-60Pa，冻干温度为零下25℃-零下30℃的冻干条件下冻干24-36h，保持真空在30℃的冻干条件下10小时使产品含水量小于2％，即获得小分子多肽冻干粉。冻干粉呈疏松的多孔组织；在室温下可以长期保存。

进一步，所述冻干保护剂为4份甘露醇与2份海藻糖的组合。

本发明的优点：

1、本发明将胎盘中的血液经挤压冲洗收集用于多肽的提取，充分利用胎盘的蛋白资源，胎盘可以进行回收再利用，实现了胎盘利用的最大化，且操作方法简便易行。

2、采用本发明的多次冻融方法，结合碱性蛋白酶酶解胎盘血，充分水解胎盘血中的蛋白，得到大量小分子的多肽产物，然后采用3-5KD的超滤膜过滤收集小分子多肽超滤液，获得的小分子多肽具有较强的抗氧化功能，且易吸收，更有利于发挥其抗氧化的功效。

3、本发明制备的冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。

4、利用本发明方法制备的小分子多肽可以用于保健品和美容产品生产上。

附图说明：

图1为FRAP总抗氧化能力比较柱状图；

图2为DPPH自由基清除能力比较柱状图；

图3为ABTS抗氧化能力比较柱状图。

具体实施方式：

实施例1：一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法，其包括如下步骤：(1)原料检测筛选；(2)收集胎盘血和冲洗水；(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理；(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理；(5)冻融处理后物料进行酶解；(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液；其中，

(1)原料检测筛选：收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、梅毒和艾滋检测合格后作为原料。

(2)收集胎盘血和冲洗水：将合格的胎盘放入无菌托盘中，清除胎盘表面血污；用无菌的剪刀将胎盘剪成3-5厘米的组织块，并用2升注射用水进行组织表面和内部冲洗3次，挤压收集胎盘血和冲洗水后，弃除胎盘组织。

(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理：将收集的胎盘血和冲洗水装入无菌容器充分混匀后，向混匀后的液体中通15mg/L臭氧20分钟，进行病原微生物灭活处理；防止在以后的冻融过程中细菌大量增殖，影响产品质量。

(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理：经病原微生物灭活处理后的液体进行2次冻融，冷冻温度在零下40℃，融化温度控制在10℃，控制每次融化时间不超过12小时，防止时间过长，造成物料的变质和活性物质的损失。通过本发明冻融处理，可以使得胎盘血里的细胞在冻融的过程中破裂，有助于在后期酶解步骤中产生更多的具有抗氧化能力的小分子多肽。

(5)冻融处理后物料进行酶解：检测冻融物料的蛋白浓度，用纯水调节最终底物蛋白浓度为5％，调节冻融瓶中物料的pH值到6.0，按照底物蛋白含量加入碱性蛋白酶为2400U/g，放入气浴恒温摇床中，温度设置成50℃，酶解5h，得到酶解液；

(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液：酶解液以4000rpm离心20分钟后取上清液；然后用0.45um的滤膜过滤掉上清液中的细胞碎片，再用截留分子量为3KD的超滤膜过滤收集小分子多肽超滤液，最后用0.22um的滤膜过滤小分子多肽超滤液，进行除菌，得到小分子多肽无菌溶液；得到的小分子多肽无菌溶液需要在零下40℃～零下80℃冷冻保存，可避免本发明制备的小分子多肽的肽键水解断裂，能够稳定保存多肽液体。

(7)将得到的小分子多肽超滤液制备成冻干粉：在每100ml所述小分子多肽超滤液中加入6g的冻干保护剂，其中，冻干保护剂为4g甘露醇和2g海藻糖，用0.22um的滤膜过滤除菌，分装至1ml/支，按照冻干程序进行冻干。

在一具体实施例中，冻干程序为：首先在零下50℃预冻2h，然后在冻干压力为20Pa，冻干温度为零下30℃的冻干条件下冻干36h，保持真空在30℃的冻干条件下10小时使产品含水量小于2％，即获得小分子多肽冻干粉。冻干粉呈疏松的多孔组织；在室温下可以长期保存。

实施例2：一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法，其包括如下步骤：(1)原料检测筛选；(2)收集胎盘血和冲洗水；(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理；(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理；(5)冻融处理后物料进行酶解；(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液；其中，

(1)原料检测筛选：收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、梅毒和艾滋检测合格后作为原料。

(2)收集胎盘血和冲洗水：将合格的胎盘放入无菌托盘中，清除胎盘表面血污；用无菌的剪刀将胎盘剪成3-5厘米的组织块，并用3升注射用水进行组织表面和内部冲洗5次，挤压收集胎盘血和冲洗水后，弃除胎盘组织。

(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理：将收集的胎盘血和冲洗水装入无菌容器充分混匀后，向混匀后的液体中通20mg/L臭氧10分钟，进行病原微生物灭活处理；防止在以后的冻融过程中细菌大量增殖，影响产品质量。

(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理：经病原微生物灭活处理后的液体进行4次冻融，冷冻温度在零下40℃，融化温度控制在25℃，控制每次融化时间不超过12小时，防止时间过长，造成物料的变质和活性物质的损失。通过本发明冻融处理，可以使得胎盘血里的细胞在冻融的过程中破裂，有助于在后期酶解步骤中产生更多的具有抗氧化能力的小分子多肽。

(5)冻融处理后物料进行酶解：检测冻融物料的蛋白浓度，用纯水调节最终底物蛋白浓度为8％，调节冻融瓶中物料的pH值到8.0，按照底物蛋白含量加入碱性蛋白酶为3000U/g，放入气浴恒温摇床中，温度设置成55℃，酶解3h，得到酶解液；

(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液：酶解液以6000rpm离心20分钟后取上清液；然后用0.45um的滤膜过滤掉上清液中的细胞碎片，再用截留分子量为5KD的超滤膜过滤收集小分子多肽超滤液，最后用0.22um的滤膜过滤小分子多肽超滤液，进行除菌，得到小分子多肽无菌溶液；得到的小分子多肽无菌溶液需要在零下40℃～零下80℃冷冻保存，可避免本发明制备的小分子多肽的肽键水解断裂，能够稳定保存多肽液体。

(7)将得到的小分子多肽超滤液制备成冻干粉：在每100ml所述小分子多肽超滤液中加入6g的冻干保护剂，其中，冻干保护剂为4g甘露醇和2g海藻糖，用0.22um的滤膜过滤除菌，分装至1ml/支，按照冻干程序进行冻干。

在一具体实施例中，冻干程序为：首先在零下50℃预冻3.5h，然后在冻干压力为60Pa，冻干温度为零下25℃的冻干条件下冻干24h，保持真空在30℃的冻干条件下10小时使产品含水量小于2％，即获得小分子多肽冻干粉。冻干粉呈疏松的多孔组织；在室温下可以长期保存。

实施例3：一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法，其包括如下步骤：(1)原料检测筛选；(2)收集胎盘血和冲洗水；(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理；(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理；(5)冻融处理后物料进行酶解；(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液；其中，

(1)原料检测筛选：收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、梅毒和艾滋检测合格后作为原料。

(2)收集胎盘血和冲洗水：将合格的胎盘放入无菌托盘中，清除胎盘表面血污；用无菌的剪刀将胎盘剪成3-5厘米的组织块，并用3升注射用水进行组织表面和内部冲洗5次，挤压收集胎盘血和冲洗水后，弃除胎盘组织。

(3)对收集的胎盘血和冲洗水进行病原微生物灭活处理：将收集的胎盘血和冲洗水装入无菌容器充分混匀后，向混匀后的液体中通20mg/L臭氧20分钟，进行病原微生物灭活处理；防止在以后的冻融过程中细菌大量增殖，影响产品质量。

(4)经病原微生物灭活处理后的液体进行冻融处理：经病原微生物灭活处理后的液体进行3次冻融，冷冻温度在零下40℃，融化温度控制在20℃，控制每次融化时间不超过12小时，防止时间过长，造成物料的变质和活性物质的损失。通过本发明冻融处理，可以使得胎盘血里的细胞在冻融的过程中破裂，有助于在后期酶解步骤中产生更多的具有抗氧化能力的小分子多肽。

(5)冻融处理后物料进行酶解：检测冻融物料的蛋白浓度，用纯水调节最终底物蛋白浓度为8％，调节冻融瓶中物料的pH值到7.0，按照底物蛋白含量加入碱性蛋白酶为2800U/g，放入气浴恒温摇床中，温度设置成50℃，酶解4h，得到酶解液；

(6)酶解液离心分离、过滤、除菌获得小分子多肽无菌溶液：酶解液以5000rpm离心30分钟后取上清液；然后用0.45um的滤膜过滤掉上清液中的细胞碎片，再用截留分子量为5KD的超滤膜过滤收集小分子多肽超滤液，最后用0.22um的滤膜过滤小分子多肽超滤液，进行除菌，得到小分子多肽无菌溶液；得到的小分子多肽无菌溶液需要在零下40℃～零下80℃冷冻保存，可避免本发明制备的小分子多肽的肽键水解断裂，能够稳定保存多肽液体。

(7)将得到的小分子多肽超滤液制备成冻干粉：在每100ml所述小分子多肽超滤液中加入6g的冻干保护剂，其中，冻干保护剂为4g甘露醇和2g海藻糖，用0.22um的滤膜过滤除菌，分装至1ml/支，按照冻干程序进行冻干。

在一具体实施例中，冻干程序为：首先在零下50℃预冻3h，然后在冻干压力为30Pa，冻干温度为零下30℃的冻干条件下冻干30h，保持真空在30℃的冻干条件下10小时使产品含水量小于2％，即获得小分子多肽冻干粉。冻干粉呈疏松的多孔组织；在室温下可以长期保存。

(1)冻干粉多肽含量检测

采用5个胎盘收集胎盘血，均利用实施例3方法制备小分子多肽冻干粉，比较不同胎盘血提取的小分子多肽冻干粉中多肽含量。取5个胎盘制备的小分子多肽冻干粉样品各1支，分别用1ml溶媒(超纯水)稀释，分别记为：样本1、样本2、样本3、样本4、样本5，各样本采用HUMAN TPA ELISA KIT酶联免疫试剂盒分析小分子多肽的含量(见表1)。

由表1数据可以看出，从胎盘血中提取的多肽含量稳定，有利于进行大规模生产。

表1样本多肽含量

本发明所得小分子多肽的用途例如但不限于：直接涂抹受损皮肤表面或微针注射，用于创伤愈合。本发明从胎盘中富集胎盘血和提取具有抗氧化能力的小分子多肽的方法，其中胎盘血蛋白含量高，提取的多肽抗氧化能力强且操作简便易行。胎盘可以进行回收再利用，“变废为宝”；本发明制备的冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。

(2)抗氧化能力对比实验：

采用CN103784935A公开的超滤法制备的多肽样本为样本1和样本2，采用本申请方法制备的多肽样本为样本3和样本4。以FRAP总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS抗氧化能力为指标，对比超滤法胎盘血提取多肽和本申请方法提取多肽的抗氧化能力。

由图1-3比较柱状图可以看出，经本申请方法制备的多肽样本的抗氧化能力显著高于通过超滤获得的多肽样本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。