一种微生物吸附剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环境生物技术领域，具体涉及一种微生物吸附剂及其制备方法和应用。

背景技术

电镀废水中的污染物较为复杂，水质成分不易控制，但总的来讲，可分为重金属离子废水、酸碱废水及含油脂类废水等，表现的成分却常常是同时含有多种污染物。其中有毒有害的物质有镉、铅、铬、镍、铜等悬浮物、石油类物质、含氮化合物、表而活性剂及磷酸盐等。电镀废水未经处理排放，会污染饮用水和工业用水，对生态环境产生严重危害。

铜是生命必需的微量元素，但摄取过量的铜对人体和动植物会产生危害。人长期接触铜化合物，皮肤将产生皮炎和湿疹，高浓度者将导致皮肤坏死。人摄入过量铜离子，会引发呕吐、痉挛、抽搐等症状。例如，人误食0.659～0.9759g硫酸铜就可能发生严重中毒，误食2-3g可溶性铜盐将致死。如果水中含铜量达到0.01mg/L，水体自身净化作用将被抑制；超过5mg/L，水体将产生异味，超过15mg/L，水体无法饮用。

当下电镀废水中重金属的去除方法主要有物理吸附法和化学沉淀法，例如离子交换法、膜分离、氧化还原、酸碱沉淀等。这些方法普遍存在一些设备需求度高、运行成本昂贵、实验操作繁琐、处理低浓度重金属效率低下等缺点。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种利用电镀厂活性污泥制备微生物吸附剂及其方法和应用。

本发明的技术解决方案如下：

一种微生物吸附剂，从电镀厂的活性污泥中分离、培养制备而成。

本发明还公开了一种微生物吸附剂的方法，从电镀厂的活性污泥中分离菌种，采用含重金属铜培养基驯化筛选菌种，将筛选所得的菌种进行培养，取处于对数生长期的菌液离心后经水洗后重悬，冷冻干燥，得到微生物吸附剂。

优选地，包括以下步骤：

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，得到土悬稀释液；取电镀废水加水稀释，得到稀释废水；

步骤二：制备LB固体培养基，将其冷凝固化制得培养基平板，将步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上进行培养，待其生长至对数生长期置于甘油管并冷冻保存于≤4℃容器中；

步骤三：制备含不同浓度重金属铜的培养基，将步骤二中所得菌种加入含较低重金属铜的培养基中进行驯化，挑选出长势好的菌种再依序接种至重金属铜浓度逐步升高的培养基中，继续驯化，观察生长情况，筛选出耐受力高的菌株；

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，培养至对数生长期，离心分离出的菌体再用无菌水洗涤2-3次后重悬，重悬后冷冻干燥，得到微生物吸附剂。

优选地，所述步骤三中，培养基中重金属铜浓度为20-60mg/L。

优选地，所述步骤二中，制备LB固体培养基的方法为：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0制得。

优选地，所述步骤四中，冷冻干燥具体为在-40--50℃条件下冷冻30-50h。

优选地，所述步骤二中，每个培养基平板中加入10-15ml的LB固体培养基。

优选地，所述步骤三中，培养基的制备方法为：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及不同质量的CuCl

本发明还公开了一种利用电镀厂活性污泥制备的微生物吸附剂在吸附重金属铜上的应用。

优选地，所述重金属铜浓度为20-60mg/L。

本发明至少具有以下有益效果之一：

(1)本发明的一种利用电镀厂活性污泥制备微生物吸附剂的方法，一方面由于处于电镀厂活性污泥中的菌种，本身已具有较高耐受力，省去了传统方式直接采用市售菌种需要大量驯化的时间，具有较高耐受力的菌种，在重金属环境中有营养物质存在的条件下依然可以繁殖，其对重金属既有表面吸附能力，又可以进行胞内积累，所以具有耐重金属能力的微生物在重金属废水处理中具有巨大的应用潜能。

(2)本发明的一种利用电镀厂活性污泥制备微生物吸附剂的应用，能够有效克服传统方式处理废水中低浓度重金属铜效率低的缺陷，提供了一种设备简单、成本低、无二次污染且能有效吸附低浓度重金属铜的方法，由于传统的物理吸附法和化学沉淀法，一般针对的都是高浓度重金属铜废水，对低浓度废水处理效果微乎其微，本发明有效的解决了该问题。

附图说明

图1是本发明微生物吸附剂的制备方法流程示意框图；

图2是实施例3对不同铜离子浓度废水的吸附效果关系图；

图3是实施例3在不同pH环境下的对重金属浓度废水的吸附效果关系图；

图4是凝胶电泳图；

图5是比对结果示意图。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

需要说明的是以下的活性污泥和电镀废水均采自南昌市进贤县文港镇中德污水处理厂。

以下液体培养基和固体培养基的配置方法只有一点区别，那就是是否添加琼脂。添加琼脂的为固体培养基，在灭菌锅内高温高压灭菌后于操作台内冷却，冷却后在培养皿内呈固体平板状，即为固体培养基；而液体培养基不添加琼脂，灭菌后为液体状态。

实施例1

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，用振荡器振荡，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，稀释至10

步骤二：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0即制得LB固体培养基，将其于121℃高压灭菌20min，在培养皿中倒入15mlLB固体培养基，冷却凝固后即为培养基平板，将100ul的步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上，放入恒温生化培养箱内35℃培养5d，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在同样的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种编号后接种于液体培养基中，待其生长至对数生长期制甘油管冷冻保存于4℃冰箱中；

步骤三：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及0.02664g CuCl

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

实施例2

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，用振荡器振荡，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，稀释至10

步骤二：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0即制得LB固体培养基，将其于121℃高压灭菌20min，在培养皿中倒入15mlLB固体培养基，冷却凝固后即为培养基平板，将100ul的步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上，放入恒温生化培养箱内35℃培养5d，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在同样的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种编号后接种于液体培养基中，待其生长至对数生长期制甘油管冷冻保存于4℃冰箱中；

步骤三：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及0.02664g CuCl

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

实施例3

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，用振荡器振荡，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，稀释至10

步骤二：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0即制得LB固体培养基，将其于121℃高压灭菌20min，在培养皿中倒入15mlLB固体培养基，冷却凝固后即为培养基平板，将100ul的步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上，放入恒温生化培养箱内35℃培养5d，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在同样的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种编号后接种于液体培养基中，待其生长至对数生长期制甘油管冷冻保存于4℃冰箱中；

步骤三：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及0.02664g CuCl

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

实施例4

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，用振荡器振荡，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，稀释至10

步骤二：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0即制得LB固体培养基，将其于121℃高压灭菌20min，在培养皿中倒入15mlLB固体培养基，冷却凝固后即为培养基平板，将100ul的步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上，放入恒温生化培养箱内35℃培养5d，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在同样的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种编号后接种于液体培养基中，待其生长至对数生长期制甘油管冷冻保存于4℃冰箱中；

步骤三：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及0.02664g CuCl

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

实施例5

步骤一：取电镀厂的活性污泥，加入无菌水中，用振荡器振荡，混匀后得到土悬液，对土悬液进行稀释，稀释至10

步骤二：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂，加入超纯水溶解并定容，调节pH＝7.0即制得LB固体培养基，将其于121℃高压灭菌20min，在培养皿中倒入15mlLB固体培养基，冷却凝固后即为培养基平板，将100ul的步骤一中的土悬稀释液和稀释废水涂布在培养基平板上，放入恒温生化培养箱内35℃培养5d，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在同样的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种编号后接种于液体培养基中，待其生长至对数生长期制甘油管冷冻保存于4℃冰箱中；

步骤三：在1L容量瓶内加入10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、25g琼脂以及0.02664g CuCl

步骤四：制备LB液体培养基，将步骤三中筛选的菌株接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

对比例1

本对比例采用市售(广州环凯，枯草芽孢杆菌CMCC63501)的枯草芽孢杆菌进行培养，接种至LB液体培养基中，在恒温培养振荡器中培养至对数期，使用离心机离心(10000rpm，10min)后，离心管内菌体再用无菌水洗涤3次后重悬，重悬后放置冷冻干燥机-50℃冷冻干燥48h后得到微生物吸附剂，4℃保存备用。

将实施例1-5中所述步骤二中纯化的微生物菌种进行鉴定，鉴定方法如下：包括以下步骤：

(1)基因组DNA提取

按SK8255(细菌)试剂盒操作；

(2)PCR扩增

2.1菌种鉴定通用引物：

2.2PCR反应体系：

2.3PCR循环条件：

(3)凝胶电泳

1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察(见电泳图DNA Ladder Mix make，参考图4)。

(4)纯化回收

PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，PCR产物用PCR引物直接测序。

(5)测序结果分析

16SrDNA序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对，参考图5。

18SrDNA、ITS、26S在NCBI：http://www.docin.com/p-545514843.html上比对。

(一)菌体鉴定结果：

该菌株被鉴定为Bacillus(芽孢杆菌属)，推测为Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)，命名其为Bacillus subtilis-TR1。

对上述实施例和对比例在不同铜离子浓度下进行吸附实验，于1L容量瓶中配置2瓶LB溶液，调节pH至5，分装于8个250ml锥形瓶中，于锥形瓶溶液中分别加入二水合氯化铜0.0133g、0.0266g、0.0399g、0.0532g、0.0665g、0.0798g、0.0931g、0.1064g配置成20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L铜离子溶液，将装有不同铜离子浓度的锥形瓶溶液每个分别分装50ml溶液至100ml锥形瓶中，高温高压灭菌后，于微生物实验内无菌操作台上在实验组锥形瓶内添加200μlBacillus subtilis-TR1，封瓶膜封口，置于35℃恒温培养箱中暗培养48h，取出后于离心机内10000rpm/min离心10min，利用原子吸收分光光度法检测上清液Cu

表1实施例和对比例在不同浓度下Cu

结果显示，本发明的Cu

在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。

在本发明的实施例的描述中，需要理解的是，“-”和“～”表示的是两个数值之同的范围，并且该范围包括端点。例如：“A-B”表示大于或等于A，且小于或等于B的范围。“A～B”表示大于或等于A，且小于或等于B的范围。

在本发明的实施例的描述中，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以上所述仅为本发明的优先实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。