白三烯在诱导干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体地，本发明涉及白三烯在诱导干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用。

背景技术

无论是在战创伤救治，或在临床治疗上，血液的及时供应都是救治成功的关键。然而目前全世界都面临血液供不应求的情况，使得血液保障供应难度大大加剧。

干细胞是原始的，未分化的细胞，且具有不断自我更新，保持持续增殖等特点，在一定条件下可以分化成各种组织细胞，为组织提供新的细胞。其中，造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)是一群具有自我更新能力及分化为所有成熟血细胞类型潜能的多能干细胞，HSC移植是目前临床上使用最多的干细胞治疗方法，广泛应用于多种血液系统疾病、免疫系统疾病、肿瘤及辐射损伤中造血衰竭的救治等。目前临床移植的HSC主要有3种来源:脐带血、骨髓及外周血。但来源紧缺、配型率低等问题仍然是目前HSC临床应用所面临的障碍。因此人们迫切需要寻找来源广泛、成本更低、使用更安全的HSC资源。人多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells,hPSCs)的出现有望解决这一难题。hPSC包括人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(humanInduced Pluripotent Stem Cells,hiPSCs)，具有非分化增殖能力和发育的全能性，能在体外诱导分化为3个胚层的细胞，是目前干细胞领域的研究热点和难点。由于PSCs可以在体外长期培养扩增，并维持其多向分化的能力，已成为极具应用前景的种子细胞。经过近20年的研究，在体外由hPSC高效诱导获得具有完全重建造血功能的HSC仍然是一个挑战。2013年，Amabile等和Suzuki等实验室先后利用畸胎瘤形成的方法首次在体内建立起了一套hiPSC造血分化体系。他们将hiPSC直接注射到NSG小鼠体内，使小鼠体内形成畸胎瘤，在形成的畸胎瘤内检测到了人CD34

以红细胞的诱导制备为例，多能干细胞制备红细胞通常经历中胚层、生血内皮、造血干/祖细胞、红系-巨核共祖细胞、红系祖细胞、成熟红细胞几个阶段，其诱导通常为分阶段的诱导方案，而造血干/祖细胞的成功制备是制备过程中的一个关键节点。早在2008年就分别有两项报道证实，诱导hESCs可以制备出红细胞。而提升诱导中间态的产生效率，必将对诱导终末阶段——功能血液细胞的制备起到促进作用。因此，寻找和确定可有效提高造血分化和红系分化的调控因素并加以利用，将提高多能干细胞来源的红细胞的产量，满足血液保障的需求。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：造血干/祖细胞和成熟的血细胞都存在较大的供求矛盾，探索可有效提高造血分化、红系分化的方法，将提高干细胞来源的血细胞的产量。发明人经过大量实验研究后发现，在多能干细胞分化培养过程中的合适阶段加入白三烯可以有效促进其向造血干/祖细胞的分化，对进一步的红系细胞分化也有促进作用，显著提高多能干细胞的分化效率。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了白三烯在诱导干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途。根据本发明的实施例，所述白三烯可以有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高了干细胞向造血干/祖细胞分化的效率。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4。

根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和诱导多能细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源多能干细胞和人源诱导多能细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞系-H1。

根据本发明的一些具体实施例，所述造血干细胞、造血祖细胞继续分化后能够显著提高红系细胞的含量，如红细胞，本发明获得的造血干/祖细胞可以用于治疗血液疾病。

在本发明的第二方面，本发明提出了白三烯在制备试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于诱导干细胞向造血干/祖细胞分化。如前所述，白三烯可以有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高了干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，因此，包含白三烯的所述制剂同样具备促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高干细胞向造血干/祖细胞分化的效率的效果。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4；

根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和诱导多能干细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源多能干细胞和人源诱导多能干细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞系-H1。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种培养基体系。根据本发明的实施例，所述培养基体系包括第一阶段培养基和/或第二阶段培养基，其中，所述第一阶段培养基和/或第二阶段培养基中包含白三烯。如前所述，白三烯可以有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高了干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，因此，包含白三烯的所述培养基能够有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高干细胞向造血干/祖细胞分化的效率。

根据本发明的实施例，上述培养基体系还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4。

根据本发明的实施例，所述白三烯为LTB4。

根据本发明的实施例，所述白三烯在所述第一阶段培养基和/或第二阶段培养基中的终浓度为1-320nM。根据本发明的一些具体实施例，发明人对白三烯的浓度进行筛选和优化，发现，终浓度为1-320nM时，干细胞均可以高效被诱导分化为造血干/组细胞。

根据本发明的实施例，所述第一阶段的培养基进一步包括：AA2P、bFGF、BMP4、Activin A、Glutamax和P/S。

根据本发明的实施例，所述第二阶段的培养基包括：AA2P、bFGF、VEGF、SB431542、Glutamax和P/S。发明人进一步地对所述第一阶段的培养基和第二阶段的培养基中各组分的浓度进行优化和筛选。

根据本发明的实施例，所述第一阶段的培养基中，所述AA2P的终浓度为45-55μg/mL。

根据本发明的实施例，所述第一阶段的培养基中，所述bFGF的终浓度为20-30ng/mL。

根据本发明的实施例，所述第一阶段的培养基中，所述BMP4的终浓度为20-30ng/mL。

根据本发明的实施例，所述第一阶段的培养基中，所述Activin A的终浓度为20-30ng/mL。

根据本发明的实施例，所述第二阶段的培养基中，所述AA2P的终浓度为45-55μg/mL。

根据本发明的实施例，所述第二阶段的培养基中，所述bFGF的终浓度为20-30ng/mL。

根据本发明的实施例，所述第二阶段的培养基中，所述VEGF的终浓度为45-50ng/mL。

根据本发明的实施例，所述第二阶段的培养基中，所述SB431542的终浓度为2-8μM。

根据本发明的实施例，所述第一阶段培养基和第二阶段培养基还包括AdvancedD/F12基础培养基。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种诱导干细胞向造血干/祖细胞分化的方法。根据本发明的实施例，包括：1)将所述干细胞前面所述的培养基体系中的第一阶段培养基中进行培养，获取第一阶段诱导细胞；2)将所述第一阶段诱导细胞在前面所述的培养基体系中的第二阶段培养基中进行培养，以便获取所述造血干/组细胞。如前所述，白三烯可以有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高了干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，因此，根据本发明实施例的方法可以有效促进干细胞向造血干/祖细胞的分化，提高干细胞向造血干/祖细胞分化的效率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和诱导多能细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源多能干细胞和人源诱导多能干细胞中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞。

根据本发明的实施例，所述多能干细胞包括人源胚胎干细胞系-H1。

在本发明的第五方面，本发明提出了白三烯在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防造血支持治疗相关疾病。如前所述，白三烯可以有效促进干细胞向造血干/组细胞的分化，提高了干细胞向造血干/组细胞分化的速率，因此，包含所述白三烯的药物可以有效促进干细胞向造血干/组细胞的分化，提高干细胞向造血干/组细胞分化的速率，对造血干/组细胞向红系细胞分化也有促进作用，能够有效治疗或预防造血支持治疗相关疾病。

根据本发明的实施例，上述制药用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述造血支持治疗相关疾病为包括血液系统肿瘤、实体瘤和免疫系统疾病中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述血液系统肿瘤包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症和无巨核细胞性血小板减少症中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤和小细胞肺癌中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述免疫系统疾病包括重症联合免疫缺陷症和严重自身免疫性疾病中的至少之一。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的多能干细胞向红系细胞诱导的分化过程，包括第一阶段(Stage 1)至第四阶段(Stage 4)，由第1天(Day1)诱导分化培养第18天(Day18)；

图2是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day6时的造血分化水平检测的结果图；

图3是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day9时的造血分化水平集落检测分析的结果图；

图4是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day12时的造血分化和红系分化水平的结果图；

图5是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day18时的造血分化和红系分化水平的结果图；

图6是根据本发明实施例的多能干细胞诱导18天所得红细胞的存活效率以及红细胞数量结果图；

图7是根据本发明实施例的多能干细胞诱导18天所得红细胞的拍摄图；

图8是根据本发明实施例的多能干细胞添加不同浓度的LTB4培养诱导至Day6时的造血分化水平的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本申请中，所述“白三烯”，是花生四烯酸经5-脂氧合酶途径代谢产生的一组物质，白三烯是由白细胞产生并具有共轭三烯结构，其包括白三烯A4(LTA4)、白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTE4)，其中，LTA4的分子式为C

本申请中，所述“多能干细胞向红系细胞分化的第一阶段”是指多能干细胞分化为中胚层细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第二阶段”是指中胚层细胞分化为生血内皮细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第三阶段”是指生血内皮细胞分化为成红细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第四阶段”是指成红细胞分化为红细胞的阶段。

本文中，“红系细胞”包括成熟红细胞、幼稚红细胞、早幼、中、晚红细胞中的至少之一。

本文中，“巨核系细胞”是指骨髓中的一种由造血干细胞分化而来的细胞，核较大，包括原始巨核细胞、幼稚巨核细胞以及巨核细胞和血小板中的至少之一。

本文中，“粒系细胞”包括嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞中的至少之一。

本文中，“单核系细胞”包括原始单核细胞、幼稚(前)单核细胞、单核细胞中的至少之一。

下面将对实施例作具体介绍。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1LTB4对hESC-H1向造血干/祖细胞及红细胞诱导分化的影响

本实施例中，发明人通过在不同阶段添加小分子或细胞因子以模拟人体内红细胞发育的过程，促使hESC-H1经生血内皮、造血干/祖细胞、红系祖细胞、成红细胞向红细胞分化，诱导体系如图1所示，并在诱导体系的第2阶段添加LTB4，对LTB4影响hESC-H1向红系诱导分化的效果进行检测，具体的实验过程如下：

1.1hESC-H1诱导培养

1)将hESC-H1(购自美国WiCell公司)复苏在6孔板中使用mTeSR Plus培养基进行培养传代2-3代后，当细胞生长至适合的密度时可进行后续的体外诱导；

2)待hESC-H1在6孔板内常规培养的未分化野生型H1生长至板内底面积的70％-80％时，吸弃旧培养基，用1mL PBS洗涤细胞一次；

4)于步骤2)获得含有细胞的6孔板的各孔内分别加入500μL Accutase，于37℃培养箱内消化3min；

5)消化结束后轻敲6孔培养板边缘，促使细胞从板底脱落；

6)将步骤5)获得的细胞加入3mL的mTeSR Plus培养基终止消化；

7)将步骤6)获得的带有细胞的混合液转移至15mL离心管内，并于室温，1000rpm，离心5min，获得细胞；

8)同时配制含有10μM Y27632的mTeSR Plus培养基；

9)加入1mL含有10μM Y27632的mTeSR Plus重悬步骤7)获得的细胞，并计数；

10)以2x10

11)步骤10)培养结束后，于室温，1000rpm条件下离心5min，获得细胞；

12)将步骤11)获得细胞更换第一阶段诱导培养基时记做Day 0；

13)更换第一阶段诱导培养基培养上述细胞两天后，于室温，1200rpm条件下离心5min，获得细胞记做Day2；

14)将步骤13)获得的细胞更换第二阶段诱导培养基每天换液，培养四天后，于室温，1400rpm条件下，离心5min，获得细胞，记做Day6；

15)将步骤14)获得的细胞更换第三阶段培养基后隔天换液，换液的第二天补液2mL，培养九天后，用100μm的筛网过滤，弃去剩余的EB球，于室温，1600rpm，离心5min，获得细胞，记做Day15；

16)以2x10

其中，实验组(LTB4-S2，H1-LTB4

第一阶段(Stage1)诱导培养基：Advanced D/F12基础培养基、AA2P(50μg/mL)、bFGF(25ng/mL)、BMP4(25ng/mL)、Activin A(25ng/mL)、Glutamax(1X)、P/S(1X)。

第二阶段(Stage2)诱导培养基：Advanced D/F12基础培养基、AA2P(50μg/mL)、bFGF(25ng/mL)、VEGF(50ng/mL)、SB431542(5μM)、Glutamax(1X)、P/S(1X)以及LTB4(300nM)。

第三阶段(Stage3)诱导培养基：BEL基础培养基(200mL)、SCF(50ng/mL)、TPO(20ng/mL)、Flt3L(20ng/mL)、IL-3(20ng/mL)、VEGF(20ng/mL)、SB431542(10μM)、EPO(PeproTech)(5u/mL)、转铁蛋白(100μg/mL)；其中，所述BEL基础培养基包括：IMDM(91mL)、F12(91mL)、10％Deionized BSA(5mL)、Lindeic acid(20μL)、Linolenic acid(20μL)、AA2P(2mL)、Synthe chol(400μL)、α-MTG(7.8μL)、GlutaMax(2mL)、P/S(1mL)、Protein-freehybHdonta mix(PFHM)(10mL)、Insulin-transferrin selenium(ITS)(2mL)。

第四阶段(Stage4)诱导培养基：Basic medium培养基(200mL)、EPO(pepro Tech)(5u/mL)、肝素(3u/mL)；其中，所述Basic medium培养基包括：IMDM(91mL)、F12(91mL)、AB血清(5mL)、Linoleic acid(20μL)、Linolenic acid(20μL)、AA2P(2mL)、Synthechol(400μL)、α-MTG(7.8μL)、GlutaMAX(2mL)、P/S(1mL)、PFHM(10mL)、ITS(2mL)。

其中，本实施例中也设置了未在第二阶段诱导培养基中添加LTB4的对照组(CON，H1-CON)，除未添加LTB4以外，第一、三、四阶段诱导培养基的组分以及第二阶段诱导培养基中的其它组分及浓度均与实验组相同。

1.2流式细胞术检测

选取步骤1.1诱导过程中第6天(Day6)第12天(Day12)和第18天(Day18)收取的细胞(实验组，H1-LTB4

1)将第6天(Day6)、第12天(Day12)和第18天(Day18)收取的细胞团块吹匀后，分别吸取1mL含有细胞的培养基，于室温，1000rpm条件下离心5min，弃掉上清；

2)将步骤1)获得的细胞团加入500μL Accutase消化液，捶打混匀，于37℃培养箱内消化3min；

3)上述消化操作结束后再次吹打细胞，以促使细胞团块消化为单细胞；

4)取1mL培养基加入到单细胞中终止消化，并转移细胞至含有8mL PBS的15mL离心管内，于室温，1000rpm条件下离心5min；

5)将步骤4)获得的产物离心后弃掉上清，用100μL PBS重悬细胞于1.5mL EP管内；

6)标记相应的流式抗体，于4℃冰箱孵育30min，孵育结束后加入1mL PBS洗涤细胞2次，并用300μL PBS重悬细胞；

7)将步骤6)重悬后的细胞过一遍筛网后置入流式管内，上机进行检测细胞标志物蛋白等指标。

1.3细胞扩增检测

人胚胎干细胞H1分阶段诱导红系分化，培养至第18天进行细胞计数，检测实验组和对照组细胞的扩增情况。

1.4实验结果分析

具体的实验结果如图2-8所示，在诱导人胚胎干细胞H1的不同阶段以流式细胞术分析生血内皮标志物CD144、CD31、CD34和CD44、造血祖细胞标志物CD43和CD45、红细胞特异性标志物CD71和CD235a的表达。其中，由图2可以看出培养至第6天，实验组中表达CD31/CD144、CD31/CD34、CD34/CD44的生血内皮细胞比例较对照组明显增加；由图3可以看出培养至第9天的细胞进行造血集落培养，红系集落CFU-E(红系爆式形成单位)、BFU-E(红系集落形成单位)的数量均显著高于对照组；由图4可以看出，培养至第12天，实验组中表达CD43

实施例2LTB4的浓度对hESC-H1向造血干/祖细胞及红细胞诱导分化的影响

本实施例中在第二培养阶段使用了不同浓度(0、1、50、150、300nM)的LTB4对所述hESC-H1(购自美国WiCell公司)进行诱导培养，并利用流式细胞仪检测培养至第6天所获得的细胞标志物的情况，其中，所述hESC-H1的第一、二、三和第四阶段诱导培养以及流式细胞仪的检测步骤参考实施例1。

实验结果如图8所示，在诱导第二阶段添加不同浓度的LTB4，培养至第6天，1～300nM的LTB4均能有效促进生血内皮细胞标志物CD31/CD144/CD34/CD44的表达。

综合实施例1和实施例2的结果，通过在现有的多能干细胞红系诱导培养体系的第2阶段中添加1～300nM LTB4，可明显促进所述多能干细胞向红细胞诱导的分化和扩增效率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。