一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法

技术领域

本发明涉及一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法，属于酶分析检测技术领域。

技术背景

糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)锚定蛋白在真核细胞中普遍存在，蛋白质通过GPI分子锚定在细胞膜上，在各种生命活动中发挥着重要作用，包括细胞识别、信号转导、补体调节、抗原呈递、胚胎发育等生理过程，以及HIV等微生物感染、癌细胞侵袭和转移等病理过程，并且在人癌细胞上的表达水平异常升高，是潜在的肿瘤监测和治疗的生物标志物。尽管GPI锚定蛋白具有重要的生物学功能，但GPI锚定蛋白的研究和应用十分困难，主要限制因素之一是GPI锚结构复杂、生物合成途径繁琐，难以从天然来源纯化获得均一的GPI锚定蛋白。在天然GPI蛋白的生物合成过程中，蛋白质偶联上GPI锚是通过GPI转酰胺酶的转肽作用实现的，该酶是实现GPI锚定蛋白体外合成的理想酶源，理论上能以天然GPI蛋白前体为底物，通过转肽作用偶联GPI锚，不引入任何非天然序列，真正获得天然GPI锚定蛋白，因而GPI转酰胺酶的研究具有重要意义。

目前报道的GPI转酰胺酶体外活性测定方法有两种。一种方法是通过HeLa细胞分离获得含有GPI转酰胺酶复合物的微粒体，通过微粒体辅助无细胞表达体系表达GPI蛋白前体，在亲核剂如肼存在时，酶复合体能切除GPI蛋白前体信号序列导致蛋白底物分子量变小，进而通过SDS-PAGE检测两个蛋白的分子量差异可定性分析GPI转酰胺酶活性。另一种方法是人工合成一种四肽底物(S-V-L-N-7-氨基-4-甲基香豆素)，C端偶连了香豆素荧光基团，将GPI转酰胺酶与荧光底物孵育，由于酶能水解底物释放荧光基团，可以通过测定荧光的释放，定量分析GPI转酰胺酶活性。尽管这两种方法都可以分析GPI转酰胺酶活性，但均存在一定局限性，第一种方法存在操作复杂、实验条件要求高的问题；第二种方法中的四肽底物S-V-L-N-7-氨基-4-甲基香豆素疏水系数为3.7，难溶于水，在缓冲液体系中很容易析出，导致反应体系构建困难。因而迫切需要寻找新的GPI转酰胺酶的酶活测定方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法。本发明的技术要点是人工设计并固相合成一种新的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素，使用该底物进行GPI转酰胺酶活性测定。

本发明的技术方案如下：

一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法，是以丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素为底物，使用待测GPI转酰胺酶水解该底物，测定荧光强度，然后根据7-氨基-4-甲基香豆素标准品的线性关系回归方程计算待测GPI转酰胺酶的相应酶活。

所述线性关系回归方程为：

y＝22764.61619x-7696.92465，R

其中，x为7-氨基-4-甲基香豆素的浓度；

y为7-氨基-4-甲基香豆素的荧光强度；

根据GPI转酰胺酶的酶解产物的荧光强度计算出7-氨基-4-甲基香豆素的浓度，再根据7-氨基-4-甲基香豆素的浓度计算出GPI转酰胺酶的酶活。

根据本发明优选的，所述丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素按照如下方法制备得到：

取2-氯三苯甲基氯树脂加入二氯甲烷进行溶胀处理，然后加入化学剂脱除树脂原有的Fmoc保护基团，用Kaiser法检测Fmoc是否脱除完全，若脱除完全树脂应显蓝色；在处理后的树脂中加入Fmoc保护的氨基酸和其他试剂进行反应，反应完成后洗涤树脂，再用Kaiser法监测反应，树脂不显色表明缩合完成；然后重复上述步骤添加Fmoc保护的新的氨基酸，所添加的氨基酸依次为Fmoc-Ala、Fmoc-Thr、Fmoc-Lys，直至最后一个Fmoc保护的C端修饰有7-氨基-4-甲基香豆素的氨基酸Asp添加完成，将多肽从树脂上分离，得到多肽底物丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素)。

根据本发明优选的，所述GPI转酰胺酶来自于锥虫、酿酒酵母或墨西哥利什曼原虫；

进一步优选的，所述GPI转酰胺酶GPI8亚基的基因序列如GenBankNo.AJ439686.1、GenBank No.NM_001180639.1或GenBank No.AJ242865.1所示。

根据本发明优选的，所述GPI转酰胺酶的酶活测定方法，具体包括步骤如下：

(1)将7-氨基-4-甲基香豆素标准品配制成梯度浓度为1、2、3、4、5、6μM的溶液，依次取100μL溶液通过酶标仪测定荧光强度，绘制标准曲线；

所述标准曲线的线性关系回归方程为：y＝22764.61619x-7696.92465，R

(2)向丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素中加入待测GPI转酰胺酶，构建GPI转酰胺酶反应体系；然后在30℃下反应15min，加入有机溶剂终止反应，然后通过酶标仪测定酶解产物的荧光强度，带入上述线性关系回归方程，计算待测GPI转酰胺酶的活性。

本发明中的酶活单位定义为：每分钟水解底物释放1μmol的7-氨基-4-甲基香豆素所需要的酶量为1U。

根据本发明优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述荧光强度的测定条件为：激发波长340nm，发射波长440nm。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素的终浓度为1mM。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述有机溶剂为乙腈，加入量为GPI转酰胺酶反应体系体积的4倍。

有益效果

1、相较于已报道的多肽S-V-L-N-7-氨基-4-甲基香豆素，本发明设计并合成的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素亲水性较好，溶解度大，其疏水系数为-6.3，容易构建酶反应体系。基于该多肽底物，本发明提供了一种测定GPI转酰胺酶活性的新方法，实现了GPI转酰胺酶的定量分析。

2、本发明提供的GPI转酰胺酶的酶活测定方法操作简单，条件要求低，可以在96孔板中进行测定，反应时间也缩短为15min，比报道中的3h或过夜反应要更加高效。而且反应体系构成简单，四肽底物合成也容易实现，可以实现高通量筛选，达到快速检测分析的目的。

附图说明

图1为多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素纯度的HPLC分析图。

图2为多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素质谱检测图。

图3为锥虫来源的重组GPI转酰胺酶的SDS-PAGE图。

其中，泳道1为IPTG诱导的带有空质粒的全细胞蛋白，泳道2为IPTG诱导的带有酶基因重组质粒的全细胞蛋白，泳道3为纯化的重组酶，如箭头所指示。

图4为酿酒酵母来源的重组GPI转酰胺酶的SDS-PAGE图。

其中，泳道1为IPTG诱导的带有空质粒的全细胞蛋白，泳道2为IPTG诱导的带有酶基因重组质粒的全细胞蛋白，泳道3为纯化的重组酶，如箭头所指示。

图5为墨西哥利什曼原虫来源的重组GPI转酰胺酶的SDS-PAGE图。

其中，泳道1为IPTG诱导的带有空质粒的全细胞蛋白，泳道2为IPTG诱导的带有酶基因重组质粒的全细胞蛋白，泳道3为纯化的重组酶，如箭头所指示。

图6为甲醇、乙醇和乙腈沉淀GPI转酰胺酶的效果图。

图7为有机溶剂对多肽底物稳定性影响的HPLC分析图。

图8为7-氨基-4-甲基香豆素标准曲线图。

图9为GPI转酰胺酶水解多肽底物的HPLC分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所用的试剂和原材料均为普通市售产品，可通过商业途径购买。

DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；HBTU：六氟磷酸盐；HOBt：1-羟基苯并三唑；DIEA：N',N'-二异丙基乙胺；IPA：异丙醇。

实施例1：多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的固相合成

根据GPI蛋白(GenBank No.V01387.1)的GPI信号序列设计GPI转酰胺酶识别的多肽序列，并在C端添加了荧光基团7-氨基-4-甲基香豆素，用于酶标仪和液相的荧光检测分析，灵敏度高。所设计的多肽底物结构为A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素，具体合成步骤如下：

1、树脂处理：取2g(0.006mmol)2-氯三苯甲基氯树脂，加入20mL二氯甲烷，膨胀处理30min。

2、脱除树脂Fmoc保护基团：加入20mL吡啶/DBU/DMF(体积比1:1:98)的混合溶液，反复清洗3次，之后再用20mL的DMF反复清洗4次，每次3min，真空过滤去除溶剂。

3、Kaiser法监测反应：取步骤2所得树脂与Kaiser试剂在100℃的条件下孵育5min，当Fmoc基团脱除完全时树脂显蓝色，定性监测反应。

4、氨基酸添加：将树脂2.5倍摩尔量Fmoc保护的丙氨酸(Fmoc-Ala)、2.5倍摩尔量HBTU和2.5倍摩尔量HOBt溶解在10mL的DMF中，添加5倍摩尔量DIEA，然后一并加到脱除Fmoc保护基团的树脂中，在室温下恒速搅拌1h，之后依次用30mL的DMF、IPA和DMF分别洗涤树脂3次，真空过滤去除溶剂；按照步骤3所述方法进行Kaiser法监测反应，当树脂不显示颜色时表明缩合完成。

5、肽链延长：重复氨基酸连接步骤，依次加入与添加第一个氨基酸相同摩尔量的Fmoc保护的苏氨酸(Fmoc-Thr)、Fmoc保护的赖氨酸(Fmoc-Lys)，在多肽链上依次添加Thr、Lys，直至将C端修饰有7-氨基-4-甲基香豆素的天冬氨酸添加到肽链上，生成含有多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的树脂。

6、多肽切割：向步骤5所得含有多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的树脂中加入20mL切割剂，缓慢搅拌反应3h；然后将滤液通过旋转蒸发仪旋干之后加入冰乙醚沉淀多肽底物，在3000g离心15min获得沉淀；沉淀用水和乙腈溶解之后通过冷冻干燥获得多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的粉末。

所述切割剂为体积比为94：1：2.5：2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和水的混合溶液。

通过HPLC与MS对合成的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素进行分析鉴定，结果如图1和图2所示。

由图1的HPLC分析结果可知，所述多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的纯度为98％。

由图2的MS检测结果可知，所述多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素的分子离子峰(m/z)[M+2H]

本实施例所述HPLC分析条件为：赛默飞(Thermo Fisher Scientific)UltiMate3000型液相色谱仪；紫外检测器，检测波长220nm；Inertsil ODS-3(4.6×250mm)色谱柱；流动相为含0.065％ TFA的水相与含0.05％TFA的乙腈，其中含0.05％TFA的乙腈浓度从5％到95％梯度洗脱27min。

实施例2：GPI转酰胺酶的制备

人工合成如GenBank No.AJ439686.1所示的锥虫GPI转酰胺酶DNA序列，并在5'端融合MBP(Maltose binding protein，麦芽糖结合蛋白)标签编码序列，形成锥虫GPI转酰胺酶融合基因序列，将其克隆到pET-28a质粒上，构建重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含GPI转酰胺酶的重组菌株。再将重组菌株接种于LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养过夜，然后按照1％接种量接种于LB液体培养基中，待OD600生长至约0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG进行蛋白的诱导表达，16℃诱导过夜。诱导结束，将菌液12000rpm离心10min，弃去上清，菌细胞用50mMTris-HCl buffer(pH 7.4)洗涤2次，重悬后采用超声波破碎仪进行细胞破壁，然后11000rpm离心30min，所得上清经过葡聚糖琼脂糖亲和层析柱纯化，然后用KPB buffer(pH 7.0)置换缓冲液，获得重组GPI转酰胺酶。重组酶表达与纯化结果如图3所示。

酿酒酵母来源的GPI转酰胺酶GPI8亚基基因序列和墨西哥利什曼原虫来源的GPI转酰胺酶GPI8亚基基因序列如GenBank No.NM_001180639.1和GenBank No.AJ242865.1所示，分别人工合成带有MBP标签的相应序列并构建到pET-28a和pET-21b质粒上，将重组质粒转化到大肠杆菌Shuffle T7中，然后按照上述步骤进行诱导表达，重组酶表达和纯化结果如图4和图5所示。

实施例3：有机溶剂对多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素稳定性的影响以及对GPI转酰胺酶的沉淀效果的影响

1、本发明的水解产物7-氨基-4-甲基香豆素为脂溶性化合物，一些强酸强碱溶液不能用于酶反应体系的终止。由于有机溶剂可沉淀酶蛋白终止反应，因而可通过选择合适的有机溶剂终止酶的反应，但需要保证在该有机溶剂中，多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素和水解产物7-氨基-4-甲基香豆素均能稳定存在。随后检测了常用有机溶剂甲醇、乙醇、乙腈对GPI转酰胺酶的沉淀效果，具体方法如下：

将10μL的锥虫GPI转酰胺酶分别与40μL的有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈)混匀，室温孵育10min，然后12000rpm离心10min，取上清用Bradford法测定蛋白浓度，结果图4所示。

由图4可知，甲醇与乙腈均可以沉淀约90％的酶蛋白，可用于终止酶的催化反应。

2、考虑到有机溶剂可能会与多肽底物氨基酸基团及C端修饰基团反应而导致结构的改变，进一步研究了上述有机溶剂对多肽底物稳定性的影响，具体方法如下：

将3μL、6mM溶于水的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素用甲醇、乙醇、乙腈稀释至180μL，然后用0.22μm滤膜过滤后，进行HPLC检测，结果如图5所示。

由图5可知，甲醇、乙醇稀释多肽后均会导致多肽结构的变化进而出现杂峰，乙腈对多肽结构影响最小。因乙腈良好的蛋白沉淀能力并且对多肽结构影响最小，选择乙腈终止酶反应。其中保留时间为3.7min的是多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素。

实施例4：GPI转酰胺酶的酶活测定

1、将7-氨基-4-甲基香豆素标准品配制成1、2、3、4、5、6μM，取100μL通过酶标仪测定荧光强度，设置激发波长340nm，发射波长440nm，绘制标准曲线，结果如图6所示。该标准曲线表示的线性关系回归方程为y＝22764.61619x-7696.92465，R

将GPI转酰胺酶的酶活单位定义为：每分钟水解底物释放1μmol7-氨基-4-甲基香豆素所需要的酶量为1U。

酶活测定：向4μL、6mM的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素中加入20μL的锥虫GPI转酰胺酶，30℃过夜孵育，加入80μL乙腈终止反应后，于12000rpm下离心10min，然后通过酶标仪进行荧光强度分析。对照组归零后，实验组荧光强度为120000，表明有明显的荧光基团释放。反应液用滤膜过滤后进一步进行HPLC分析，结果如图7所示。

由图7可知，保留时间为3.4min的是多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素，保留时间为8.1min的是水解产物7-氨基-4-甲基香豆素，说明多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素经GPI转酰胺酶作用时明显发生水解，释放荧光基团，证实了多肽底物设计合理，测定了GPI转酰胺酶具有活性。

2、为了简化酶活测定方法，将反应时间缩短为15min，所述GPI转酰胺酶的酶活测定方法具体步骤为：向4μL、6mM的多肽底物A-T-K-D-7-氨基-4-甲基香豆素中加入20μL的待测GPI转酰胺酶，在30℃下反应15min，加入80μL乙腈终止反应，于12000rpm下离心10min，然后通过酶标仪测定锥虫GPI转酰胺酶的酶解产物的荧光强度为20000，带入线性关系回归方程，计算待测GPI转酰胺酶的活性为2U/μL。将原始酶液梯度稀释后进行检测，测得本发明酶活测定方法的检测限为50μg/mL。

3、按上述方法测定酿酒酵母GPI转酰胺酶的酶活，酶解产物的荧光强度分别为46024，带入线性关系回归方程，计算相应待测GPI转酰胺酶的活性分别为3.9U/μL。

4、按上述方法测定墨西哥利什曼原虫GPI转酰胺酶，酶解产物的荧光强度分别为89637，带入线性关系回归方程，计算相应待测GPI转酰胺酶的活性分别为7.1U/μL。

本实施例所述HPLC分析条件为：赛默飞(Thermo Fisher Scientific)UltiMate3000型液相色谱仪；荧光检测器，激发波长340nm，发射波长440nm；Agilent TC C18分析柱(4.6×250mm)；流动相为含0.05％ TFA的水相和乙腈，乙腈浓度从26％到95％梯度洗脱25min；流速为1mL/min。