一种南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a互作调控冷响应的分子机制的方法

技术领域

本发明涉及基因工程、分子生物学和生物化学领域，具体说是一种南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a互作调控冷响应的分子机制的方法。

背景技术

气温是限制蔬菜栽培地域和时期的重要环境因素之一，气温主要通过影响蔬菜春提前和越冬栽培品质，影响蔬菜的周年供应。植物长期暴露于冷害温度下，会导致生长和发育受到损害，常表现为：叶片出现伤斑、凹陷，组织变柔软、萎蔫，脱水、黄化甚至破坏花芽分化，加速植株衰老等。

嫁接可以提高植物对非生物胁迫的抗性，如南瓜砧木通过调节蔗糖代谢和糖酵解途径，或者增加接穗对从根部传递到枝条的ABA的敏感性，快速闭合气孔从而提高黄瓜的耐盐性；耐冷性强的砧木可促进茄子幼苗在冷胁迫和恢复下光合效率的提高从而增强其对冷胁迫的抵抗力。

TIFY家族蛋白是植物中特异性转录因子，TIFY家族中功能研究较多的为JAZ亚家族，研究发现JAZ(茉莉酸-ZIM结构域)阻遏蛋白与MYC2结合，抑制其对下游JA应答基因的表达。JAZ亚家族蛋白不含DNA结合结构域，依赖与其他蛋白形成复合体，发挥转录抑制作用。当外源施加MeJA或植物体内JA浓度提高被茉莉酸受体COI1(Coronatine insensitive 1)感知，促进JAZ被E3泛素连接酶复合物泛素化降解。研究发现，JAZ蛋白还参与冷诱导的CBFs通路：JAZ1/2通过抑制ABI4对MdICE1转录活性位点的激活或直接抑制ICE1的转录活性，抑制CBFs的转录从而负调节苹果的耐冷性；MdJAZ1/2-MdABI4-MdICE1可能以复合体形式调控CBFs的转录。除此之外，MdJAZ1/2与MdBBX37相互作用以抑制MdBBX37对MdCBF1/4的转录活性，并且干扰MdBBX37和MdICE1之间的相互作用。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a互作调控冷响应的分子机制的方法。本发明构建了一套完整的基于模式植物拟南芥和重要蔬菜作物黄瓜南瓜，基因基因文库的互作蛋白的筛选，蛋白互作性的体内外验证、探究南瓜和黄瓜幼苗冷响应及CBFs-COR冷通路基因的表达变化，并得到过表达CmoCK1和CsaTIFY10a的转基因拟南芥，进行其响应冷的生理及基因表达分析。最后利用基因工程和生物化学技术探究外源施加茉莉酸对拟南芥和黄瓜抗冷性影响的。本发明在一定程度上具有解析南瓜砧木调控黄瓜低温耐受性的分子机理的创新性，补充和完善嫁接提高抗冷性的机制，为未来耐冷砧木南瓜品种选育提供新的思路。因此本发明是一套兼具科学性、创新性和实用性的科学研究方法。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种促进南瓜mRNA由南瓜运输至黄瓜的基因CmoCK1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种如权利要求1所述的基因CmoCK1编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种黄瓜中JA信号通路关键基因CsaTIFY10a，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

一种如权利要求3所述的基因CsaTIFY10a编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种寻找南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a蛋白互作结构域的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、构建酵母双杂交文库并对文库进行初筛：取生在适宜的嫁接苗根系，提取根系的总RNA进行酵母文库构建；

所述嫁接苗为黄瓜/南瓜或南瓜/黄瓜嫁接苗；

步骤2、CmoCK1蛋白自激活验证：将CmoCK1蛋白构建到pGBKT7载体上作为诱饵载体，并与空载pGADT7共同转化酵母Y2HGold菌株进行自激活验证；

步骤3、CmoCK1互作蛋白筛选：用诱饵载体Cmo/CsaCK1-BD分别对步骤1获得的黄瓜/南瓜和南瓜/黄瓜根系文库进行筛库，对在四缺培养基上筛选出的阳性斑测序鉴定，得到CmoCK1互作蛋白为南瓜/黄瓜根系中的CsaTIFY10a蛋白；

步骤4、CsaTIFY10a蛋白与CmoCK1蛋白互作结构域确定：鉴定CmoCK1蛋白与CsaTIFY10a蛋白的结构域区域，根据上述两个结构域区域分别构建结构域截断蛋白进行酵母双杂交实验，具体为，将二缺培养基上的阳性克隆挑斑，点在三缺与四缺培养基上，上述三缺与四缺培养基为点斑生长1d的阳性克隆。

一种黄瓜和南瓜幼苗冷响应及CBFs-COR冷通路基因的表达变化分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、对自根黄瓜和南瓜幼苗进行冷处理，观察幼苗随冷处理时间的表型变化，考察CBFs-COR冷通路基因及CmoCK1及CsaTIFY10a基因在幼苗根和叶片中表达量的变化；

上述CBFs-COR通路基因包括CBF1、CBF2、COR15b。

步骤2、对嫁接幼苗进行冷处理，观察嫁接幼苗随冷处理时间的表型变化，考察CBFs-COR冷通路基因及CmoCK1及CsaTIFY10a基因在嫁接幼苗根和叶片中表达量的变化；

上述嫁接幼苗为南瓜/黄瓜嫁接幼苗或者黄瓜/南瓜嫁接幼苗；

上述CBFs-COR冷通路基因包括CBF1、CBF2、COR15b。

一种过表达CmoCK1和CsaTIFY10a的转基因拟南芥响应低温处理的生理及基因表达分析方法，其特征在于，包括以下步骤；

步骤1：构建pSuper 1300的35S::CmoCK1-GFP、35S::CsaTIFY10a-GFP过表达载体，转基因拟南芥，RT-PCR及PCR筛选出纯合转基因CmoCK1-GFP及CsaTIFY10a-GFP的T2代株系；

步骤2、将T2代纯合的3个CmoCK1-GFP株系CmoCK1#4、CmoCK1#6、CmoCK1#7，3个CsaTIFY10a-GFP株系CsaTIFY10a#1、CsaTIFY10a#6、CsaTIFY10a#8和野生型(Col-0)种子点种于1/2MS培养基上，光照培养后进行冻处理，考察冻处理后拟南芥幼苗植株表型、成活率和离子渗透率；

步骤3、将T2代纯合的3个CmoCK1-GFP株系，即CmoCK1#4、CmoCK1#6、CmoCK1#7，3个CsaTIFY10a-GFP株系，即CsaTIFY10a#1、CsaTIFY10a#6、CsaTIFY10a#8和野生型(Col-0)种子点种于1/2MS培养基上，光照培养后进行冷处理，考察冷处理后拟南芥幼苗基因表达量变化；

上述考察基因表达量变化中，所述基因包括CmoCK1、CsaTIFY10a、AtCBFs、AtCOR15b，其中AtCBFs包括AtCBF1、AtCBF2。

一种外源施加茉莉酸甲酯影响植物抗冷性分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、光照培养后使用茉莉酸甲酯施加在根据前文所述方法培养得到的拟南芥幼苗上；

步骤2、对步骤1所得经茉莉酸甲酯处理的拟南芥幼苗进行冻处理，考察冻处理后拟南芥幼苗的表型及离子渗透率；

步骤3、对步骤1所得经茉莉酸甲酯处理的拟南芥幼苗进行冷处理，考察冷处理后基因表达量变化；

上述考察基因表达量变化中，所述基因包括CBFs、COR和CmoCK1；

步骤4、使用100μM的MeJA喷施黄瓜幼苗第一真叶，至叶片表面浸润，每天早晚两次，处理3天；

步骤5、对步骤4所得经茉莉酸甲酯处理的黄瓜幼苗进行冷处理，考察冷处理后黄瓜幼苗的相对电导率、丙二醛含量。

本发明所述的一种南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a互作调控冷响应的分子机制的方法，其有益效果为：

本方法为进一步探究南瓜砧木调控黄瓜冷响应的砧穗互作机制提供研究基础，为未来耐冷砧木南瓜品种选育提供新的思路，对生产中提高黄瓜冬春季节栽培具有重要意义。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为CmoCK1自激活验证图；

图2为CmoCK1与CsaTIFY10a发生在酵母中的相互作用图；

图3为CmoCK1与CsaTIFY10a发生在烟草中的相互作用图；

图4为CmoCK1与CsaTIFY10a发生在烟草中的相互作用图；

图5为CmoCK1与CsaTIFY10a的蛋白结构域图；

图6为Cmo/CsaCK1与CsaTIFY10a互作结构域图；

图7为4℃冷处理的黄瓜和南瓜表型图；

图8为4℃冷处理的黄瓜和南瓜中CBFs、COR、CK1和TIFY表达量图；

图9为4℃冷处理嫁接苗(黄瓜/南瓜)的表型变化图；

图10为4℃冷处理的嫁接苗(黄瓜/南瓜)中CBFs、COR、CK1和TIFY表达量图；

图11为过表达CmoCK1的转基因拟南芥阳性鉴定图；

图12为过表达CsaTIFY10a的转基因拟南芥阳性鉴定图；

图13为CmoCK1过表达拟南芥冻处理表型(A)和离子渗透率(B)图。

图14为CsaTIFY10a过表达拟南芥冻处理表型(A)和离子渗透率(B)；

图15为4℃冷处理后CBFs、COR和CmoCK1的表达量分析图；

图16为4℃冷处理后CBFs、COR和CsaTIFY10a的表达量分析图；

图17为外源施加MeJA对CmoCK1过表达拟南芥冻处理表型(A)和离子渗透率(B)图；

图18为4℃冷处理后CBFs、COR和CmoCK1的表达量影响分析图；

图19为外源施加MeJA对黄瓜幼苗抗冷(4℃)生理表型分析图。

具体实施方式

以下结合附图1-19对本发明作进一步详细说明。

实施例1一种寻找南瓜CmoCK1与黄瓜CsaTIFY10a蛋白互作结构域的方法

1.植物材料

1.1实验室自留纯合材料‘新泰密刺’黄瓜，商用砧木材料‘强力士’南瓜，实验室自留纯和本氏烟烟草。

1.2黄瓜和南瓜播种和栽培：将黄瓜和南瓜种子于55℃温汤浸种20min后置于28℃恒温培养箱内黑暗条件下催芽。将露白的种子播种于50孔穴盘，放置在光照培养箱中培养。基质中草炭、蛭石和珍珠岩体积比为2∶1∶1；光照强度：190-600μmol·m-2·s-1，相对湿度：60-70％，温度：白天28℃/夜晚18℃，光照期16h/黑暗期8h。

1.3黄瓜和南瓜的嫁接

南瓜与黄瓜前后间隔一周播种，待生长至下胚轴粗细一致时，用刀片削去砧木生长点和一片子叶，接穗留8-10mm下胚轴处斜切，砧木与接穗切面大小一致。再将削好的接穗与砧木斜面紧贴对齐并用嫁接夹固定。将嫁接苗用透明盖盖住，四周用保鲜膜密封，放入于28±2℃先黑暗培养2-3d，再弱光培养1-2d，最后开盖进行正常光照培养。嫁接7d后选取成活且长势一致嫁接植株进行后续试验。

1.4烟草播种与栽培：将烟草播散于配比为蛭石：珍珠岩：草炭＝1∶1∶2的基质上，保鲜膜覆盖保温保湿，培养温度为22-25℃；光照强度：200μmol·m-2·s-1；光照周期：光照期16h、黑暗期8h；相对湿度：50％-70％。在光照培养箱中培养约1周揭膜再培养约1周后进行取长势较为一致的苗分于营养钵中，每四天浇一次植物通用型营养液。定植后约四周，可进行注射，观察荧光。

2.酵母转化

将保存在-80℃超低温冰箱的酵母感受态细胞液在冰上融化备用；鲑鱼精DNA溶液95℃金属浴中加热10min，迅速插入冰中备用。在超净台中依次向灭菌的1.5mL离心管中加入0.5μg质粒、100μg鲑鱼精DNA(步骤2处理后)30μL酵母感受态细胞液吸打混匀；再向离心管中加入500μL TE/PEG溶液，吸打混匀；于30℃金属浴中处理30min，期间颠倒混匀一次；再于42℃金属浴中处理15min，期间颠倒混匀一次。5000g离心1min，弃上清。用500μ灭菌水将菌块重悬，5000g离心30s，弃上清。用100μL灭菌水将菌块重悬，并涂布于相应缺素培养基。28℃培养箱中倒置培养3-5d。

3.酵母双杂交文库构建与筛库

取生在适宜的嫁接苗(黄瓜/南瓜和南瓜/黄瓜)根系，提取根系总RNA进行酵母文库构建。建库与初筛由上海睿星基因技术有限公司完成。

4.CmoCK1蛋白自激活验证

将CmoCK1构建到pGBKT7载体上作为诱饵载体，将诱饵载体与空载体pGADT7共同转化酵母菌株。将菌液涂布于二缺培养基(SD/-Trp-Leu)培养3-5d；将二缺培养基中生长的阳性克隆划线到三缺(SD/-Trp-Leu-His)与四缺SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基上；28℃培养3-5d检验诱饵载体是否具有自激活性，鉴定发现CmoCK1-BD诱饵蛋白不具备自激活性(参考附图1)。

5.CmoCK1互作蛋白筛选

基于前期构建黄瓜/南瓜和南瓜/黄瓜嫁接植株根系的酵母双杂交文库，用诱饵载体CmoCK1-BD分别对南瓜(黄瓜/南瓜)和黄瓜(南瓜/黄瓜)根系文库进行筛库。对在四缺培养基上筛选出的若干个阳性斑经初步测序鉴定，发现CmoCK1筛选到黄瓜(南瓜/黄瓜)根系中CsaTIFY10a候选蛋白(Csa3G645940，NCBI数据库中命名为Cucumis sativus proteinTIFY 10a)与之互作。

6.CsaTIFY10a与CmoCK1互作验证

从黄瓜中克隆CsaTIFY10a基因并连接到pGADT7载体上作为猎物蛋白，与CmoCK1-BD诱饵蛋白进行酵母双杂交回转验证，发现CmoCK1与CsaTIFY10a在酵母中可以发生相互作用(参考附图2)。于是，将二者分别构建至pCAMBIA1300-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC荧光素酶载体，并将CsaTIFY10a-nLUC和CmoCK1-cLUC载体通过农杆菌共注射烟草叶片，正常培养72h后检测共表达的荧光信号。结果表明，CmoCK1与CsaTIFY10a在酵母及烟草中均存在相互作用(参考附图3)。最后将诱导表达的GST-CsaTIFY10a融合蛋白和GST蛋白分别结合在GSTSepharose4B beads上，然后与His-CmoCK1融合蛋白在4℃条件中孵育过夜，再将非特异结合的蛋白洗涤干净后进行蛋白质免疫印迹实验，His-CmoCK1可以特异地结合GST-CsaTIFY10a，但不能被GST蛋白结合下来。以上结果证实，CmoCK1能在体外直接与CsaTIFY10a发生相互作用(参考附图4)。

7.CsaTIFY10a与CmoCK1互作区域鉴定

利用生物信息学技术鉴定CmoCK1与CsaTIFY10a结构域区域，将CmoCK1和CsaTIFY10a各分为两个结构域(参考附图5)，并分别构建结构域截断蛋白进行酵母双杂交实验。将二缺培养基上的阳性克隆挑斑，点在三缺与四缺培养基上，其中三缺与四缺培养基为点斑生长1d的阳性克隆，可以看到CmoCK1两个片段CmoCK1-d1(0-804bp)和CmoCK1-d2(804-1062bp)均与CsaTIFY10a-d1(0-364bp)互作，且这两个CmoCK1-d1/2与CsaTIFY10a-d1的互作性均强于与完整CsaTIFY10a的互作性(参考附图6)。

实施例2一种黄瓜和南瓜幼苗冷响应及CBFs-COR冷通路基因的表达变化分析的方法

1.植物材料

黄瓜和南瓜植物材料和栽培方式同实施例1。

2.冷处理实验材料

将适宜的植物材料，放入提前降温至4℃的光照培养箱，于设置的处理时间对植物材料进行取样或备用。每个试验组至少设置3个重复。

3.自根黄瓜和南瓜幼苗冷响应表型及CBFs-COR通路基因表达的差异

对两叶一心的黄瓜和南瓜幼苗进行0h、1h、3h、6h、12h、24h、36h的4℃冷处理，观测随冷处理时间的表型变化，结果表明冷处理6h时黄瓜表现萎蔫，12h时叶片明显失水而南瓜表现出较强的耐冷表型，冷处理12h后黄瓜出现轻微萎蔫冷敏感表型(参考附图7)。对0h、1h、3h、6h、12h、24h、36h时间点的材料进行实时荧光定量分析，观察CBFs-COR通路基因及CmoCK1及CsaTIFY10a基因在根和叶片中表达量的变化，发现无论黄瓜还是南瓜中4℃冷处理均诱导CBFs-COR通路的响应，且该通路上游因子CBF1、CBF2在根中的表达量高于叶片，而下游因子COR15b的冷响应表达则是叶片高于根，说明植物响应冷信号是根系更敏感，但最终作用是发生在叶片；除此之外，南瓜和黄瓜中CK1与TIFY10a均响应冷信号，其中CsaTIFY10a在黄瓜根中的表达为先下调后上调，响应趋势与Csa/CmoCBFs相近，说明CsaTIFY10a是CBFs上游的冷响应因子(参考附图8)。CBFs-COR通路基因包括CBF1、CBF2、COR15b。

4.嫁接黄瓜/南瓜幼苗的冷响应表型及CBFs-COR冷通路基因表达分析

黄瓜/黄瓜、黄瓜/南瓜嫁接后7d，分析0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h 4℃冷处理后的表型变化。结果发现，嫁接苗黄瓜/南瓜抗冷能力明显提高，表现为冷处理24h嫁接苗叶片未出现明显萎蔫；将冷处理时间延长到72h，嫁接苗叶片仍未出现脱水萎蔫，且植株也未出现倒伏。相对自根苗嫁接明显提高了黄瓜的耐冷表型(参考附图9)。实时荧光定量PCR检测黄瓜/南瓜嫁接组合中接穗和砧木中CBFs-COR冷通路基因、CmoCK1和CsaTIFY10a基因的表达差异，发现嫁接黄瓜接穗CsaTIFY10a和CBFs通路基因对冷响应显著变化的时间从3h提前到1h，且南瓜根系CmoCBF1、CmoCBF2对冷的响应时间延后；根系中CmoCK1冷处理1h时表达上调，接穗CsaTIFY10a表现出与自根黄瓜根系相同的冷响应趋势及先下调后上升(参考附图10)。

实施例3过表达CmoCK1和CsaTIFY10a的转基因拟南芥响应冷的生理及基因表达分析

1.植物材料

1.1拟南芥材料：col-0野生型、CmoCK1、CsaTIFY过表达拟南芥。

1.2拟南芥播种与栽培：取少许拟南芥种子均匀铺撒于基质上进行培养，保鲜膜覆盖保温保湿，并标记。在光照培养箱中培养，约1周揭膜再培养约1周后进行取长势较为一致的苗分于32孔穴盘中，按照处理时段数要求合理分配每个处理的苗数(每个处理苗数不少于3)，同时设置对照组。培养温度为白天22℃、夜晚18℃，光周期为光照16h、黑暗8h；所用基质配比为蛭石：珍珠岩：草炭＝1∶1∶2；拟南芥较耐旱浇水不宜过多，每隔一天浇一次。

2.拟南芥遗传转化

2.1小摇：挑取单克隆菌落于1.5mL离心管中，加入1mL含有相应抗性的LB液体培养基，28℃ 180rpm过夜培养。

2.2大摇：小摇菌液和含相应抗性的LB液体培养基按1∶200比例加入50mL离心管28℃ 180rpm摇至菌液OD600为0.8-1.0。

2.34000g离心8min，弃上清，保留底部菌块；

2.4用等体积拟南芥侵染液将菌块重悬，室温静置2-3h。

表1实施例3所用的拟南芥侵染液

2.5拟南芥侵染：侵染前将拟南芥种荚剪去，侵染时将侵染液倒入玻璃培养皿中，将花序完全浸入侵染液中约30s。侵染后的拟南芥暗培养24h，再放入培养箱中正常条件培养至收种。

3.冷处理试验及冻处理实验

冷处理：将适宜的植物材料，放入提前降温至4℃的光照培养箱，于设置的处理时间对植物材料进行取样或备用。每个试验组至少设置3个重复。

冻处理：将适宜的植物材料，放入-10℃环境中进行冻害处理，冻处理后置于正常条件下培养3d。

4.拟南芥离子渗透率测定

取一定数目的拟南芥(15-30株)为一个试验组，用蒸馏水清洗后放入含有10mL蒸馏水的15mL离心管中，于摇床(180rpm)摇1h后测定电导值记为EC

计算公式如下：

离子渗透率＝(EC

5.过表达CmoCK1的转基因拟南芥响应冷的生理及基因表达分析

5.1过表达CmoCK1、CsTIFY10a的转基因拟南芥获取

构建pSuper 1300的35S::CmoCK1-GFP、35S::CsaTIFY10a-GFP过表达载体，转基因拟南芥，RT-PCR及PCR筛选出纯合转基因CmoCK1-GFP、CsaTIFY10a-GFP T2代株系(参考附图11、12)。

5.2CmoCK1-GFP、CsaTIFY10a-GFP株系低温处理相应生理及基因表达分析

5.2.1将T2代纯合的3个CmoCK1-GFP株系，即CmoCK1#4、CmoCK1#6、CmoCK1#7，3个CsaTIFY10a-GFP株系，即CsaTIFY10a#1、CsaTIFY10a#6、CsaTIFY10a#8和野生型(Col-0)种子点种于1/2MS培养基上，22℃光照培养箱中培养一周后，进行本实施例所述冻处理实验，考察冻处理后植株表型、成活率和离子渗透率。发现2个CmoCK1 OE株系(CmoCK1#6、CmoCK1#7)表现出弱于Col-0的抗冻表型，即幼苗受损伤程度更大(参考附图13A)，离子渗透率高于Col-0(参考附图13B)；2个OE株系CsaTIFY10a#1和CsaTIFY10a#8冻处理后叶片黄化更多且有幼苗死亡，表现出弱于Col-0的抗冻表型(参考附图14A)，离子渗透率高于Col-0(参考附图14B)。

5.2.2将T2代纯合的3个CmoCK1-GFP株系，即CmoCK1#4、CmoCK1#6、CmoCK1#7，3个CsaTIFY10a-GFP株系，即CsaTIFY10a#1、CsaTIFY10a#6、CsaTIFY10a#8和野生型(Col-0)种子点种于1/2MS培养基上，22℃光照培养箱中培养一周后，进行本实施例所述冷处理实验，考察基因表达量变化，具体为：

考察荧光定量检测冷处理1h时CmoCK1/CsaTIFY10a OE株系中CmoCK1/CsaTIFY10a基因、AtCBFs(AtCBF1、AtCBF2)以及冷处理6h时下游冷响应基因AtCOR15b的表达。荧光定量结果发现，冷处理1h时CmoCK1 OE株系中CmoCK1基因表达极显著高于Col-0，AtCBFs(AtCBF1、AtCBF2)以及下游冷响应基因AtCOR15b的表达显著低于Col-0；呈现出OE株系中CmoCK1表达高会抑制AtCBFs和AtCOR15b对冷响应的程度的现象。以上结果表明，CmoCK1位于CBFs上游，负调控植物的抗冻性以及4℃冷胁迫下CBFs及其下游COR基因的表达，说明CmoCK1可以通过调控CBFs依赖的冷响应途径参与植物冷信号途径(参照图15)。CsaTIFY10aOE株系冷处理1h时，CsaTIFY10a基因表达极显著高于Col-0，AtCBF1以及下游AtCOR15b冷响应基因的表达明显低于Col-0；呈现出CsaTIFY10a表达显著高于Col-0时，AtCBFs和AtCOR15b的响应受到抑制。上述结果说明，CsaTIFY10a响应冷信号抑制CBFs-COR通路基因的表达，进一步抑制植物的耐冷性(参照图16)。

实施例4一种外源施加茉莉酸影响植物抗冷性分析

1.植物材料

所用黄瓜植物材料和栽培方式同实施例1，所用拟南芥植物材料和栽培方式同实施例3。

2.外源施加MeJA

外源施加茉莉酸甲酯(MeJA)的处理组在冷处理和冻处理前提前进行预处理。

2.1拟南芥的外源施加。

将拟南芥播种再含有MeJA的1/2MS培养基，培养条件同实例3，置于22℃培养室中生长8-10d，进行后续处理。

2.2黄瓜幼苗的外源施加。

对两叶一心黄瓜幼苗的第一和第二真叶页面喷施100μM的MeJA，至叶片浸润，每天喷施两次，持续三天。最后一次喷施结束后，静置12小时，开始冷处理。

3.植物冷处理生理指标测定

3.1拟南芥离子渗透率测定。

拟南芥离子渗透率测定方法同实施例3。

3.2黄瓜离子渗透率测定。

对处理后的黄瓜幼苗第一真叶进行取样，取样时避开叶片的主叶脉，用直径8mm的打孔器取10个圆片作为一个试验组，每个试验组设置9个重复。将取的10个圆片放入含20mL蒸馏水的50mL离心管中，于摇床(180rpm)摇2h后测定电导值记为EC

计算公式如下：

离子渗透率＝(EC

3.3黄瓜MDA含量测定

称取0.1g左右叶片，剪碎后加入2ml 10％三氯乙酸(TCA)溶液和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mL TCA进一步研磨，匀浆在离心机中4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心后的上清液2mL，加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混合后于沸水中反应15min，迅速冷却后离心10min(4000r/min)。

取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的吸光度，最后计算丙二醛(MDA)含量。计算公式如下：

比色测定液中MDA浓度：C

提取液中MDA浓度(μmol mL

4.外源施加MeJA对过表达CmoCK1拟南芥抗冷性的影响分析

将CmoCK1 OE株系和野生型(Col-0)种子种植于1/2MS培养基，培养条件同实例3，用50μM茉莉酸甲酯(MeJA)预处理拟南芥后进行冻处理试验。观察MeJA处理后的CmoCK1 OE株系和野生型相比的表型变化，发现MeJA处理后的CmoCK1 OE株系在冻处理后叶片为深绿色，相比单独冻处理后的苗叶色更深，且生长势优于Col-0(参考附图17A)，测定离子渗透率，发现CmoCK1 OE株系离子渗透率明显低于Col-0(参考附图17B)。

荧光定量检测MeJA处理后的CmoCK1 OE株系在4℃冷处理0h、1h、3h时CBFs、COR和CmoCK1的表达量变化。发现，MeJA处理同样也会导致CBFs(CBF1、CBF2)和COR15b表达上调；MeJA处理1h时CBFs(CBF1、CBF2)表达达到最高，3h时COR15b仍有显著上调；但MeJA处理下CmoCK1的表达有略微下降但不显著。

以上结果表明，CBFs-COR通路也可以响应JA信号，且JA处理将导致CBFs通路基因以及下游冷响应基因COR15b表达量上调；而单独过表达CmoCK1或CsaTIFY10a将导致植物中CBFs通路对冷信号的响应程度减弱。(参考附图18)。

5.外源施加MeJA对黄瓜幼苗抗冷性的影响分析

100μM的MeJA预处理3d，后进行4℃冷处理12h试验，处理的黄瓜幼苗MDA下调且离子渗透率显著下降。以上结果表明，100μM的MeJA可以提高黄瓜的耐冷性(参考附图19)。所述抗冷性测定低温胁迫指标为MDA、相对电导率。

上述实施例只为说明本发明的技术构思，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明提出的技术构思与路线所作的任何等效修饰或改动，均应涵盖在本发明的保护范围内。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。