一种III型胶原蛋白肽及其制备方法

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体涉及一种III型胶原蛋白肽及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白肽是将大分子胶原蛋白经蛋白酶降解后制成的小分子肽类产品，具有较高的消化吸收性。胶原蛋白肽能够促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高骨强度，以达到预防骨质疏松的作用；胶原蛋白肽还具有保护胃黏膜和抗溃疡、抗过敏的作用；特别的是，胶原蛋白肽还具有极好的美容效果，有提高皮肤水分、减少皱纹，抗衰老等作用，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用，其作为口服美容产品的基本原料，也已经为广大消费者接受。

胶原蛋白有20多种类型，目前对于I型和II胶原蛋白肽的研究较多，已经实现工业化生产。如王琳在《Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究》中，以猪皮为材料，比较了酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提的方法，发现酶解法进行粗提得率最高，并结合高效液相色谱进行分离纯化制得Ⅰ型胶原蛋白，该方法具有高效性、高选择性，所得Ⅰ型胶原蛋白具有防止UVA氧化损伤的作用。专利CN114085285A公开了一种具有骨关节养护功效的高纯II型胶原蛋白肽的制备方法及其应用，经软骨除杂、骨粒清洗、骨粒酶解、多级过滤、纳滤除杂浓缩、树脂精制除杂、杀菌、浓缩、喷雾干燥步骤制得高纯II型胶原蛋白肽，该方法能够大大提高II型胶原蛋白肽的含量，实现速溶性较好的胶原蛋白颗粒粉的制备。

目前III型胶原蛋白肽的制备主要集中在胶原蛋白的重组表达，即由基因重组技术制备的经设计、修饰后的特定基因编码的氨基酸序列或其片段，或是这类功能性氨基酸序列片段的组合。而从动物组织中提取III胶原蛋白的研究较少。

专利CN101717804A公开了一种医用级III型胶原的制备方法，具体是新鲜新生犊牛皮作为原料进行前处理，然后用限制胃蛋白酶降解法和盐析法提取I和III型胶原混合物，接着用Tris-NaCl缓冲液溶解掉大部分的I型胶原，Tris-HCl缓冲液使胶原变性制得III型胶原。

尽管目前对于III型胶原蛋白肽的开发研究已经取得了一定的进展，但从动物组织提取III胶原蛋白仍存在难度大、纯度低、成本高等严峻问题。因此，开发一种III型胶原蛋白肽的制备方法至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种III型胶原蛋白肽及其制备方法，所得III型胶原蛋白肽的含有III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为300-3000道尔顿，能够用于改善皮肤水分，促进机体内III型胶原蛋白生成，起到延缓组织老化的作用。

为了实现上述技术目的，本发明采取如下技术方案。

第一方面，一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1、原料脱脂、超声、发酵得总蛋白粗提物；

S2、酸性条件下提取胶原蛋白粗提物；

S3、加澄清剂去除杂蛋白；

S4、凝结芽孢杆菌发酵得到III型胶原蛋白；

S5、复合蛋白酶酶解、模仿葡萄球菌发酵；

S6、分离纯化得III型胶原蛋白肽成品。

本申请通过采用上述方法，优化了从动物组织中提取III型胶原蛋白肽的生产条件，特别是通过凝结芽孢杆菌发酵、复合蛋白酶酶解、模仿葡萄球菌发酵工艺相互协调、共同作用，获得III型胶原蛋白肽，其含有III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量在300-3000道尔顿范围之间，并且安全无毒副作用，易于消化，可以作为药品、化妆品、保健食品和食品的原料，并且能够添加至酸性饮料中，能够用于改善皮肤水分，促进机体内III型胶原蛋白生成。

在一个优选的实施方式中，所述步骤S1的具体操作为：将原料浸于NaOH溶液中浸泡，取出后水洗至中性，然后按照料液质量比1:5-40与水混合，超声1-3次，取出物料并重新加入到1-10倍体积的水中，按照料液重量接种一定量的枝孢菌和/或法马塔假丝酵母发酵，得到总蛋白粗提物。

进一步地，步骤S1中，所述原料是动物皮、鳞或骨中的一种，优选为罗非鱼、鳕鱼、羊皮、牛皮、禽类皮中的任一种。

进一步地，步骤S1中，所述NaOH溶液的质量分数为0.1-5%，浸泡时间为4-18h。

进一步地，步骤S1中，所述超声的功率为150-400W，超声风速为5-500m/s，超声时间为10-80min，超声次数为1-3次。

进一步地，步骤S1中，所述枝孢菌的接种量为1-8×10

进一步地，步骤S1中，所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为2-10h。

在另一个优选的实施方式中，所述步骤S2的具体操作为：总蛋白粗提物加入到2-50倍质量的纯化水中，调节总蛋白粗提物的pH值至2-5，加热至50-90℃，保温提胶2-8h，制得胶原蛋白粗提物。

在另一个优选的实施方式中，所述步骤S3的具体操作为：调节胶原蛋白粗提物pH为2-7，加入澄清剂，静置2-8h去除杂蛋白，取上清液备用。

进一步地，步骤S3中，所述澄清剂为大豆多糖、蛋清和土豆淀粉的混合物，混合质量比为1:2-4:1-3；澄清剂的加入量为胶原蛋白粗提物质量的0.5-3%。

在另一个优选的实施方式中，所述步骤S4的具体操作为：向步骤S3所得上清液中加入凝结芽孢杆菌，调节pH至6-7.5，40-55℃下发酵2-6h得到III型胶原蛋白。

进一步地，步骤S4中，所述凝结芽孢杆菌的添加量为溶液质量的0.1-1%。

在另一个优选的实施方式中，所述步骤S5的具体操作步骤为：将III型胶原蛋白调节pH值为7.5-8.0，加入复合蛋白酶酶解，得到酶解液；调节酶解液pH至6-7.5，按酶解液重量接种一定量的模仿葡萄球菌发酵，得酶解发酵液。

进一步地，步骤S5中，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶和自制蛋白酶的组合，自制蛋白酶为生姜蛋白酶和鱿鱼内脏蛋白酶，三种酶的质量比为2.5-4:0.8-1.5:1，优选为3:1:1；复合蛋白酶的加入量为III型胶原蛋白质量的0.5-2%，酶解温度为50-60℃，酶解时间为2-8h。

进一步地，步骤S5中，模仿普通球菌为自行从湖南腊肉中分离，通过表型和生化鉴定为模仿葡萄球菌，模仿普通球菌的接种量为1-9×10

在另一个优选的实施方式中，步骤S6中，所述分离纯化步骤包括超滤、纳滤、喷雾干燥。

进一步地，步骤S6中，所述超滤所用超滤膜的截留分子量在1-10kD，超滤膜为聚砜类、聚酰胺类卷式膜中的任一种。

进一步地，步骤S6中，所述纳滤膜的截留分子量100-2000D，纳滤膜为聚酰胺、磺化聚醚砜、磺化聚砜中空纤维膜中的任一种。

进一步地，步骤S6中，所述喷雾干燥的进风温度设置为160-220℃，出风温度设置为90-120℃。

本申请中采用膜过滤的方法进行分离纯化，用超滤、纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸等，均在常温下操作、无相态变化、高效节能，不会影响小分子肽的活性，并且生产过程中不产生污染。

第二方面，由第一方面所述方法制备得到的III型胶原蛋白肽，该III型胶原蛋白肽的平均分子量在300-3000道尔顿之间，含有III型胶原蛋白的标志性肽段。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本申请提供了一种III型胶原蛋白肽的制备方法，通过凝结芽孢杆菌发酵、复合蛋白酶酶解、模仿葡萄球菌发酵工艺相互配合共同作用，使制备的III型胶原蛋白肽的平均分子量为300-3000道尔顿，含有III型胶原蛋白的标志性肽段，具有安全无毒副作用，易于消化，可以作为药品、化妆品、保健食品和食品的原料，并且能够添加至酸性饮料中，能够用于改善皮肤水分，促进机体内III型胶原蛋白生成，起到延缓组织老化的作用。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

在本发明的具体实施方式中，提供了一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1：将原料浸于质量分数为0.1-5‰的NaOH溶液中浸泡4-18h，水洗至中性，按照料液比1:5-40与水混合，在功率为150-400W、风速为5-500m/s的条件下超声1-3次，每次超声10-80min；超声后的物料取出并重新加入到1-10倍体积的水中，按照料液重量接种枝孢菌和/或法马塔假丝酵母，枝孢菌的接种量为1-8×10

S2：总蛋白粗提物加入到2-50倍质量的纯化水中，加入pH调节剂（NaOH和/或HCl溶液，pH调节剂的质量分数为5-30%）调整pH值为2-5，加热至50-90℃，保温提胶2-8h，制得胶原蛋白粗提物；

S3：调节胶原蛋白粗提物pH为2-7，将1g大豆多糖、蛋清和土豆淀粉按照质量比1:2-4:1-3混合均匀制得澄清剂，将澄清剂加入到胶原蛋白粗提物中，澄清剂的加入量为胶原蛋白粗提物质量的0.5-3%，静置2-8h去除杂蛋白，取上清液备用；

S4：上清液中加入溶液质量0.1-1%的凝结芽孢杆菌，调节pH至6-7.5，40-55℃下发酵时间2-6h得到III型胶原蛋白；

S5：调节pH至7.5-8.0，加入III型胶原蛋白质量0.5-2%的复合蛋白酶（复合蛋白酶为碱性蛋白酶和自制蛋白酶的组合，自制蛋白酶为生姜蛋白酶和鱿鱼内脏蛋白酶，三种酶的质量比为2.5-4:0.8-1.5:1，优选为3:1:1），50-60℃下酶解2-8h，得到酶解液；用盐酸溶液、氢氧化钠溶液调节pH至6-7.5，按照料液重量接种1-9×10

S6：用截留分子量为1-10kD的超滤膜进行超滤，截留分子量100-2000D的纳滤膜进行纳滤，在进风温度160-220℃℃、出风温度90-120℃条件下进行喷雾干燥即得III型胶原蛋白肽成品。

本发明使用的枝孢菌购自上海宝录生物科技有限公司；法马塔假丝酵母为湖南腊肉中自行分离，通过表型和生化实验鉴定为法马塔假丝酵母；凝结芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司，人III型胶原蛋白试剂盒购自上海初态生物科技有限公司。

本申请中，利用酸性pH调节剂或碱性调节剂对物料进行pH调节；其中，酸为可溶性酸，具体为柠檬酸、乳酸、苹果酸、盐酸、醋酸、磷酸、酒石酸中的一种或几种的混合物；碱为可溶性碱，具体为NaOH、Na

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。

实施例1

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1：将1000g羊皮浸于10kg质量分数为0.5%的NaOH溶液中浸泡12h，水洗至中性，按照料液比1:10与水混合，在功率为200W、风速为150m/s的条件下超声2次，每次超声60min，超声后的羊皮取出并重新加入到10倍体积的水中，按照料液重量接种枝孢菌2×10

S2：总蛋白粗提物加入10kg纯化水，调节pH值为2.5，加热至60℃，保温提胶4h，制得胶原蛋白粗提物；

S3：调节胶原蛋白粗提物pH为2.5，将1g大豆多糖、4g蛋清和2g土豆淀粉混合均匀制得澄清剂，加入到胶原蛋白粗提物中，静置4h去除杂蛋白，取上清液备用；

S4：上清液中加入溶液重量0.5%的凝结芽孢杆菌，调节pH至7.5，50℃下发酵3h得到III型胶原蛋白；

S5：调节pH至7.5，加入9g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶，55℃下酶解4h得到酶解液，调节pH至7.5，按照酶解液重量接种2×10

S6：用截留分子量为10kD的聚砜超滤膜对酶解发酵液进行超滤，截留分子量100D的聚酰胺纳滤膜进行纳滤，在进风温度190℃、出风温度90℃条件下进行喷雾干燥即得III型胶原蛋白肽成品。

采用质谱方法对本实施例所得成品进行测定，液相色谱-质谱为美国ThermoFisher公司Vanquish液相和Orbitrap Exploris 480质谱组成，结果显示成品里包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1267道尔顿。

实施例2

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶为7.5g碱性蛋白酶、4g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。采用质谱方法对本实施例所得成品进行测定，结果显示成品里包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1348道尔顿。对本实施例所得成品进行测定，结果显示成品里包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1348道尔顿。

实施例3

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶为12g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。对本实施例所得成品进行测定，结果显示成品里包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1052道尔顿。

实施例4

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶为3g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。对本实施例所得成品进行测定，结果显示成品里包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1495道尔顿。

对比例1

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶为9g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶，无鱿鱼内脏蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1467道尔顿。

对比例2

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶为9g碱性蛋白酶、3g鱿鱼内脏蛋白酶，无自制的生姜蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1726道尔顿。

对比例3

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1的区别在于，步骤S5中的复合酶替换为9g碱性蛋白酶，无鱿鱼内脏蛋白酶、自制的生姜蛋白酶。其余步骤与实施例1均相同。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为1863道尔顿。

对比例4

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1：将1000g羊皮浸于10kg质量分数为0.5%的NaOH溶液中浸泡12h，水洗至中性，按照料液比1:10与水混合，在功率为200W、风速为150m/s的条件下超声2次，每次超声60min，超声后的羊皮取出并重新加入到10倍体积的水中，按照料液重量接种枝孢菌2×10

S2：总蛋白粗提物加入10kg纯化水，调节pH值为2.5，加热至60℃，保温提胶4h，制得胶原蛋白粗提物；

S3：调节胶原蛋白粗提物pH为2.5，将1g大豆多糖、4g蛋清和2g土豆淀粉混合均匀制得澄清剂，加入到胶原蛋白粗提物中，静置4h去除杂蛋白，取上清液备用；

S4：调节上清液pH至7.5，加入9g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶，55℃下酶解4h得到酶解液，调节pH至7.5，按照酶解液重量接种2×10

S5：用截留分子量为10kD的聚砜超滤膜对酶解发酵液进行超滤，截留分子量100D的聚酰胺纳滤膜进行纳滤，在进风温度190℃、出风温度90℃条件下进行喷雾干燥即得成品。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为2425道尔顿。

对比例5

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1：将1000g羊皮浸于10kg质量分数为0.5%的NaOH溶液中浸泡12h，水洗至中性，按照料液比1:10与水混合，在功率为200W、风速为150m/s的条件下超声2次，每次超声60min，超声后的羊皮取出并重新加入到10倍体积的水中，按照料液重量接种枝孢菌2×10

S2：总蛋白粗提物加入10kg纯化水，调节pH值为2.5，加热至60℃，保温提胶4h，制得胶原蛋白粗提物；

S3：调节胶原蛋白粗提物pH为2.5，将1g大豆多糖、4g蛋清和2g土豆淀粉混合均匀制得澄清剂，加入到胶原蛋白粗提物中，静置4h去除杂蛋白，取上清液备用；

S4：上清液中加入溶液重量0.5%的凝结芽孢杆菌，调节pH至7.5，50℃下发酵3h得到III型胶原蛋白；

S5：调节pH至7.5，加入9g碱性蛋白酶、3g自制的生姜蛋白酶和3g鱿鱼内脏蛋白酶，55℃下酶解4h得到酶解液；

S6：用截留分子量为10kD的聚砜超滤膜对酶解发酵液进行超滤，截留分子量100D的聚酰胺纳滤膜进行纳滤，在进风温度190℃、出风温度90℃条件下进行喷雾干燥即得成品。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为2298道尔顿。

对比例6

一种III型胶原蛋白肽的制备方法，包括：

S1：将1000g羊皮浸于10kg质量分数为0.5%的NaOH溶液中浸泡12h，水洗至中性，按照料液比1:10与水混合，在功率为200W、风速为150m/s的条件下超声2次，每次超声60min，超声后的羊皮取出并重新加入到10倍体积的水中，按照料液重量接种枝孢菌2×10

S2：总蛋白粗提物加入10kg纯化水，调节pH值为2.5，加热至60℃，保温提胶4h，制得胶原蛋白粗提物；

S3：调节胶原蛋白粗提物pH为2.5，将1g大豆多糖、4g蛋清和2g土豆淀粉混合均匀制得澄清剂，加入到胶原蛋白粗提物中，静置4h去除杂蛋白，取上清液备用；

S4：调节上清液pH至7.5，加入9g碱性蛋白酶，55℃下酶解4h得到酶解液；

S5：用截留分子量为10kD的聚砜超滤膜对酶解发酵液进行超滤，截留分子量100D的聚酰胺纳滤膜进行纳滤，在进风温度190℃、出风温度90℃条件下进行喷雾干燥即得成品。对本对比例所得成品进行测定，结果显示成品里不包含III型胶原蛋白的标志性肽段，平均分子量为2761道尔顿。

结果

上述实施例1-4所述方法制得的胶原蛋白肽中含有III型胶原蛋白的标志性肽段，而对比例1-6制得的胶原蛋白肽中不含有III型胶原蛋白的标志性肽段，由此可知，凝结芽孢杆菌发酵、复合蛋白酶酶解、模仿葡萄球菌发酵工艺会影响III型胶原蛋白的提取，各工艺相互配合共同作用，可有效提取III型胶原蛋白。

以上述实施例、对比例所得产品为样品，测试其对人成纤维细胞分泌III型胶原蛋白的影响，测试方法如下：

将处于对数生长期的HSF细胞（人皮肤成纤维细胞）使用0.25%胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80-90%；将本申请得到的III型胶原蛋白肽分别稀释100mg/L，加入细胞上清液，空白组为生理盐水，轻轻混匀后继续培养，培养3天后，得到的培养物离心，取上清液用人III型胶原蛋白试剂盒检测。

测得结果如下表1所示。

表1

注：**为与空白组相比，p＜0.01。

从实验结果可以看出，实施例1-4得到的III型胶原蛋白能够特异性促进III型胶原蛋白生成，与空白组差异显著，对比例1-6与空白组对比，差异不显著，由此可知，本发明通过，凝结芽孢杆菌发酵、复合蛋白酶酶解、模仿葡萄球菌发酵工艺相互配合，可制得III型胶原蛋白肽，能促进机体内III型胶原蛋白生成。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本说明书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。