BV2外泌体在制备治疗术后谵妄的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及BV2外泌体在制备治疗术后谵妄的药物中的应用。

背景技术

术后谵妄(postoperative delirium，POD)是指在麻醉手术后数天内发生的、涉及意识状态、认知功能、定向力、逻辑思维能力、记忆力以及睡眠状况等方面的功能紊乱为主要表现的可逆性、波动性的急性脑紊乱综合征，是引起高龄患者术后跌伤，抑郁和自残的重要危险因素，同时能够增加术后肺部感染，褥疮以及静脉血栓的发生率及病死率，延长住院时间，增加医护人员的工作负荷，给家庭和社会带来巨大的经济负担。

目前高龄患者POD已被国内外广泛关注，但至今麻醉深度是否为高龄患者POD发生的相关因素，不同麻醉深度是否会对老年患者术后POD发生率产生影响，其发生机制是什么仍无确切结论。

发明内容

基于以上，本发明的目的在于提供BV2外泌体在制备治疗术后谵妄的药物中的应用，通过制备小鼠小胶质细胞BV2外泌体并构建大鼠术后谵妄模型，研究在长时间深度麻醉情况下，大鼠大脑认知障碍的发生及其机制。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了BV2外泌体在制备治疗术后谵妄的药物中的应用。

优选地，所述药物通过改善海马组织神经细胞受损及减少细胞凋亡治疗术后谵妄。

优选地，所述应用包括构建大鼠术后谵妄模型，构建方法包括：将SD大鼠用异氟烷麻醉机麻醉后进行手术造模，从胸骨到耻骨联合近端0.5CM处通过皮肤，腹部肌肉和腹膜做一个纵向中线切口，腹部器官部分暴露2分钟，然后用5-0的缝合线逐渐缝合，术后放回麻醉室麻醉2小时，每只大鼠手术前，手术结束后及术后一天给予EMLA乳膏涂抹。

优选地，包括向大鼠术后谵妄模型注射BV2外泌体。

优选地，所述BV2外泌体通过超速离心法制备。

更优选地，BV2外泌体的制备方法包括：

1)在37℃中速融细胞上清。

2)将细胞上清移动至一个新的离心管内，2000×g，4℃，30min离心。

3)小心地在将上清液移至新的离心管中，12,000×g，4℃，45min再次离心，以去除较大的囊泡。

4)取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。

5)将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，110,000×g离心70min。

6)去除上清，用10mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4℃，110,000×g，超速离心70min。

7)去除上清用90μL预冷的1×PBS重悬。

本发明的有益效果在于：

成功构建了大鼠术后谵妄模型，通过向大鼠术后谵妄模型注射BV2外泌体研究了BV2外泌体在治疗术后谵妄中的作用，研究结果表明，BV2外泌体能够改善海马组织神经细胞受损及减少细胞凋亡，从而能够部分逆转大鼠的术后谵妄。

附图说明

图1为本发明实施例中外泌体样品透射电镜成像结果。

图2为本发明实施例中术前纯氧长时间麻醉示意图。

图3为本发明实施例中手术损伤示意图。

图4为本发明实施例中模型构建后的旷场实验结果。

图5为本发明实施例中模型构建后的埋藏食物实验结果。

图6为本发明实施例中模型给药后的旷场实验结果。

图7为本发明实施例中模型给药后的埋藏食物实验结果。

图8为本发明实施例中的海马组织HE染色以及凋亡检测结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

一.小鼠小胶质细胞BV2提取与鉴定

1.超速离心法提取外泌体

1)在37℃中速融小鼠小胶质细胞BV2的细胞上清(本申请对细胞上清的来源及制备方法不做限定，按照本领域常规技术手段，直接用吸管吸取细胞上清即可。)。

2)将细胞上清移动至一个新的离心管内，2000×g，4℃，30min离心。

3)小心地在将上清液移至新的离心管中，12,000×g，4℃，45min再次离心，以去除较大的囊泡。

4)取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。

5)将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，110,000×g离心70min。

6)去除上清，用10mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4℃，110,000×g，超速离心70min。

7)去除上清用90μL预冷的1×PBS重悬。

2.外泌体样品透射电镜观察

1)将外泌体取出10μL。

2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。

3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。

4)常温干燥数分钟。

5)100kv进行电镜检测成像。

6)获得透射电镜成像结果，如图1所示，电镜结果显示外泌体为囊泡状。二.术后谵妄模型的构建与验证

1.实验材料

实验动物：SD大鼠，雌，12w，共12只。

实验材料：2-0缝合线，角针和圆针，自制拉线弯钩，生理盐水，中号和小号手术剪，弯镊，持针器，棉签，纱布，络合碘消毒液，氧气(100％)，异氟烷麻醉机，自发活动箱。

2.操作规程

2.1实验动物分组：将实验SD大鼠随机分为2组，正常对照组，模型组。

2.2术前准备：动物全部给予维持饲料于手术前12h禁食不禁水。

2.3模型建立：动物全部给予维持饲料。大鼠正常组老鼠放入99.9％氧气笼子里面2小时，不做其它处理，如图2所示，除正常组外老鼠用异氟烷麻醉机麻醉后进行手术造模，从胸骨到耻骨联合近端0.5CM处通过皮肤，腹部肌肉和腹膜做一个纵向中线切口，如图3所示，腹部器官部分暴露2分钟，然后用5-0的缝合线逐渐缝合，术后放回麻醉室麻醉2小时，每只老鼠手术前，手术结束后及术后一天给予EMLA乳膏涂抹。

2.4模型验证

1)旷场实验：如图4所示，与对照组比，模型组在6h、24h运动总路程和平均速度都显著下降(P<0.05)，表明模型组大鼠接受一定的麻醉深度后，活动减退，有出现谵妄的倾向。

2)埋藏食物实验：如图5所示，与对照组比，模型组在6h、24h寻找食物时间显著增加(P<0.05)，表明模型组大鼠接受一定的麻醉深度后，活动减退，有出现谵妄的倾向。

三.外泌体治疗与验证

1.治疗方法：

将小鼠小胶质细胞BV2外泌体按照100μg/只注射(用100μl PBS溶解100μg外泌体)至模型组大鼠。

2.实验验证：

1)旷场实验：如图6所示，与模型组比，外泌体治疗6h、24h总路程、平均速度增加(P>0.05)，表明外泌体治疗可以部分逆转大鼠的术后谵妄。

2)埋藏食物实验：如图7所示，与模型组比，外泌体治疗6h、24h寻找食物时间显著减少(P<0.05)，表明外泌体治疗可以部分逆转大鼠的术后谵妄。

3)HE染色以及凋亡检测：

为了进一步观察小鼠小胶质细胞BV2外泌体治疗对术后谵妄大鼠海马组织的影响，对海马组织进行了HE染色以及凋亡检测，由图8A得出，对照组大鼠海马组织神经细胞结构完整清晰，排列紧密有序，神经元数目较多，发育完整；模型组大鼠海马组织神经细胞萎缩明显，神经元数目减少，且结构受到破坏，细胞核皱缩；与模型组比较小鼠小胶质细胞BV2外泌体组海马组织神经细胞受损情况均改善，可见神经细胞结构较清晰完整。从图8B结果显示，蓝色荧光为细胞核(对应图8B中第2排)，红色荧光为凋亡细胞(对应图8B中第1排)；与对照组相比，模型组中凋亡细胞明显增加，与模型组相比，小鼠小胶质细胞BV2外泌体组中凋亡细胞显著减少，表明小鼠小胶质细胞BV2外泌体组能显著减少细胞凋亡。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。