一种抑癌基因COTL1在制备肾透明细胞癌诊断和/或预后判断药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是指一种抑癌基因COTL1在制备肾透明细胞癌诊断与预后判断药物中的应用。

背景技术

肾透明细胞癌是肾癌中最常见的恶性肿瘤，占原发性肾脏恶性肿瘤的75-82％。在各种临床和基因组研究中，肾透明细胞癌被证明是一种高度免疫浸润的肿瘤，是最早的免疫治疗肿瘤之一。由于肾透明细胞癌对常规放疗和化疗不敏感，其治疗主要依赖于靶向治疗和免疫治疗。靶向治疗包括酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼和索拉非尼。然而，肿瘤异质性、动态变化和对治疗的适应细胞死亡相关信号通路的改变显著限制了靶向药物在肾透明细胞癌治疗中的应用。

COTL1是一种肌动蛋白结合蛋白，可结合α-肌动蛋白、β-肌动蛋白和f-肌动蛋白。此外，当与5-脂氧合酶(5-LO)相互作用时，COTL1导致促炎白三烯生物合成时期5-LO活性增加。COTL1在癌症中的作用是矛盾的，COTL1抑制乳腺癌生长，但在体外和体内促进胶质母细胞瘤生长。有趣的是，很明显COTL1在肺癌中同时具有肿瘤促进和抑制活性。因此，COTL1在肾透明细胞癌(KIRC)中的作用值得研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抑癌基因COTL1在制备肾透明细胞癌诊断与预后判断药物中的应用。

本发明的第一个目的在于提供一种抑癌基因COTL1及其突变体在制备肾透明细胞癌的诊断和/或预后判断的药物中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述抑癌基因COTL1的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，所述药物还包括药学上可以接受的药物载体。

在本发明的一个实施例中，所述药物载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体以及香味剂和甜味剂中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述赋形剂包括水，所述填充剂包括淀粉、蔗糖或乳糖中的至少一种；所述粘合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；所述湿润剂包括甘油；所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠中的至少一种；所述吸收促进剂包括季铵化合物；所述表面活性剂包括十六烷醇；所述吸附载体包括高岭土或皂粘土中的至少一种；所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸或口服液。

本发明的第二个目的在于提供一种用于肾透明细胞癌诊断和/或预后判断的实时定量检测试剂盒，包括所述抑癌基因COTL1及其突变体。

在本发明的一个实施例中，所述实时定量检测试剂盒还包括至少一对特异性扩增COTL1基因的引物，引物序列：上游引物为ATATGACGGCTCCACCAT，下游引物为AATTCTGTACGACCTCCTTC。

本发明的第三个目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述抑癌基因COTL1。

本发明的第四个目的在于提供所述药物组合物在制备肾透明细胞癌的诊断和/或预后判断的药物中的应用。

本发明的第五个目的在于提供所述的抑癌基因COTL1的RNA干扰靶点序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。干扰靶点：GTTTGTGATCAGTGATCGGAA(SEQ ID NO.2)和AGATTTCATCAAGAGCGAGCT(SEQ ID NO.3)。

本发明的第六个目的在于提供所述的RNA干扰靶点序列在制备治疗肾透明细胞癌药物中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述药物还包括药学上可以接受的药物载体。

在本发明的一个实施例中，所述药物载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体以及香味剂和甜味剂中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述赋形剂包括水，所述填充剂包括淀粉、蔗糖或乳糖中的至少一种；所述粘合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；所述湿润剂包括甘油；所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠中的至少一种；所述吸收促进剂包括季铵化合物；所述表面活性剂包括十六烷醇；所述吸附载体包括高岭土或皂粘土中的至少一种；所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸或口服液。

本发明通过免疫组化发现COTL1在肾透明细胞癌中相比于癌旁为低表达，进一步通过敲低COTL1的表达，探讨COTL1在肾透明细胞癌细胞中的增殖，克隆，迁移和周期的作用。首先通过PCR和蛋白印迹确认COTL1敲低成功，发现干扰COTL1表达可以抑制肾透明细胞癌细胞增殖、克隆、迁移等。同时还发现干扰COTL1表达，细胞周期S期增加。同时评估了COTL1表达与KIRC中肿瘤免疫浸润的关系。研究结果揭示了COTL1在KIRC中与免疫浸润淋巴细胞密切相关。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明首次证实COTL1是一个肾透明细胞癌诊断标记物，首次发现COTL1可作为肾透明细胞癌诊断和预后判断的分子标记及治疗药物的靶标。COTL1可以作为肾透明细胞癌的免疫治疗靶点。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明COTL1在肾透明细胞癌组织中呈现低表达。

图2是本发明COTL1在肾透明细胞癌细胞中敲低COTL1 mRNA的表达。

图3是本发明COTL1肾透明细胞癌细胞中敲低COTL1蛋白的表达。

图4是本发明敲低COLT1表达促进肾透明细胞癌细胞中细胞增殖。

图5是本发明敲低COTL1表达促进肾透明细胞癌细胞克隆能力。

图6是本发明敲低COTL1表达促进肾透明细胞癌细胞迁移能力。

图7是本发明敲低COTL1表达使肾透明细胞癌周期阻滞在G1期。

图8是本发明COTL1与肾透明细胞癌免疫浸润相关性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。本发明所使用的试剂或试剂盒均属于市售产品，检测方法均为常规检测方法。

1，SEQ ID NO.1：

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2，干扰靶点：GTTTGTGATCAGTGATCGGAA(SEQ ID NO.2)和AGATTTCATCAAGAGCGAGCT(SEQ ID NO.3)。

实施例

1、免疫组化

(1)脱蜡前，应将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。

(2)组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟；

(3)更换二甲苯后再浸泡15分钟；

(4)二甲苯：乙醇＝1:1混液中浸泡10分钟；

(5)无水乙醇中浸泡10分钟；

(6)95％乙醇中浸泡10分钟；

(7)85％乙醇中浸泡10分钟；

(8)75％乙醇中浸泡10分钟；

(9)蒸馏水中浸泡10分钟；

(10)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H

(11)抗原修复：在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；

(12)自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；

(13)10％血清(TBS配制)封闭30分钟；

(14)吸弃血清，勿洗加入对应的一抗孵育过夜；

(15)回收一抗，TBS洗2遍，每次5分钟；

(16)加入二抗，室温孵育60分钟；

(17)TBS洗4遍，每次5分钟；

(18)加入VULCAN FAST RED CHROMOGEN kit2染色15分钟，终止；

(19)加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；

(20)苏木素染色30s，放入蒸馏水中终止反应；

(21)脱水封片：75％乙醇中，浸置5分钟；

(22)85％乙醇中浸泡5分钟；

(23)95％乙醇中浸泡5分钟；

(24)无水乙醇中浸泡5分钟；

(25)二甲苯：乙醇＝1:1混液中浸泡5分钟；

(26)二甲苯后再浸泡5分钟；

(27)更换二甲苯后再浸泡5分钟；

(28)取出后，滴加30μL中性树胶，用盖玻片封片；

(29)晾干，观察结果，拍照。实验结果见图1。

由图1可知，结果显示COTL1在肾癌组织中相比于癌旁低表达。

2.PCR

(1)接种细胞：接种肾透明细胞癌786-0和Caki-1细胞于35mm平皿中。

(2)病毒感染：用COTL1病毒感染，嘌呤筛选，构建稳转株，分为对照组NC，实验组shCOTL11#，shCOTL12#；COTL11#和shCOTL12#干扰靶点分别为GTTTGTGATCAGTGATCGGAA和AGATTTCATCAAGAGCGAGCT。

(3)引物设计：NCBI数据库中编码COTL1的登录号为NM_021149.5，引物序列如下：ATATGACGGCTCCACCAT(上游引物)；AATTCTGTACGACCTCCTTC(下游引物)。

(4)RNA提取，反转录。实验结果见图2，由图可知荧光定量检测COTL1的mRNA表达量，结果显示干扰组COTL1的表达明显下降。

3.Westernblot

(1)接种细胞：接种肾透明细胞癌786-0和Caki-1细胞于35mm平皿中。

(2)病毒感染：用COTL1病毒感染，嘌呤筛选，构建稳转株，分为对照组NC，实验组shCOTL11#，shCOTL12#。

(3)蛋白提取，BCA蛋白定量。

(4)蛋白电泳，转膜，封闭，孵育对应的一抗和二抗，显影。

(5)结果显示干扰组COTL1蛋白显著降低，实验结果见图3。

4、细胞增殖

(1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。

(2)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)，每组3-5重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)。

(3)统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现Con组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。

(4)从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。

(5)4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μL DMSO溶解甲瓒颗粒。

(6)振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。

(7)数据统计分析。实验结果见图4。

由图4可知，结果显示干扰COTL1的表达，肾透明细胞癌细胞增殖能力增加。

5、细胞克隆

(1)准备感染后细胞：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。

(2)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定)，每个实验组设3个复孔。

(3)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。

(4)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涤细胞1次。

(5)每孔加入1mL4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，PBS洗涤细胞1次。

(6)每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000μL，染细胞10-20min。

(7)ddH

由图5可知，结果显示干扰COTL1的表达，促进肾透明细胞癌细胞的增殖克隆能力。

6、细胞迁移

(1)细胞接种：与6孔板细胞培养板中各实验组接种细胞，对照组和干扰组。

(2)划痕：待细胞长满后，用细的枪头划个十字形

(3)拍照：指定时间拍照。实验结果见图5。

由图6可知，结果显示干扰COTL1的表达，肾透明细胞癌细胞786-0和Caki-1迁移能力增加。

7、细胞周期

(1)细胞接种：35mm平皿中接种对照和干扰组786-0和Caki-1细胞。

(2)准备样品：细胞用胰酶消化成单细胞悬液，收集至离心管中，控制细胞总数在50-100万之间，1500rpm室温离心5分钟，小心吸除上清，加入1mL PBS吹打细胞沉淀后转移至流失上样管中，再次离心并吸除上清，可留50μL上清以免吸走细胞。

(3)处理样品：加100μL试剂A，轻轻混匀，不用振荡，室温放置10分钟，不丢弃上清；加100μL试剂B，轻轻混匀，不用振荡，室温放置10分钟，不丢弃上清；加150μL试剂C，轻轻混匀，不用振荡，室温放置10分钟，不丢弃上清；

(4)流失分析：每个样本收集至少2万个细胞，记录488nm激发波长处的红色荧光，在FSC/SSC图中圈出要分析的细胞群，通过FL2-W和FL2-A去除黏黏细胞后，用FL2-A分析细胞的DNA直方图，通过自动软件Modfit来分析结果，计算出G0/G1％，S％及G2/M％。结果显示干扰COTL1的表达后，肾透明细胞癌的G1期增加，S和G2期减少(图7)。

8、免疫浸润相关性分析

通过TIMER数据，分析COTL1与肾透明细胞癌中主要免疫浸润细胞B细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，树突状细胞的相关性，实验结果见图8，由图8结果发现COT1在肾透明细胞癌中与主要免疫浸润细胞呈正相关。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。