功能性造血干细胞及其增殖的方法

技术领域

本发明涉及造血干细胞的医疗领域，涉及功能性造血干细胞及其增殖的方法。具体为，基于三维微载体体外培养功能性造血干细胞的方法，所述方法扩增并获得具有治疗功能的巨核偏向造血干细胞，包括但不限于适用于骨髓、外周血和脐带血来源的造血干细胞扩增。

背景技术

造血干细胞(Hemopoietic stem cell，HSC)造血干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有复杂异质性，主要体现在其具有谱系偏向分化和谱系限制的特征。造血干细胞异质性的标志之一是存在巨核细胞/血小板偏向造血干细胞(Mk-biased HSC)。近年来随着单细胞技术的发展和应用，越来越多的证据显示巨核细胞可以由HSC分化而来，而无需经历多潜能或双潜能阶段，且该巨核偏向造血干细胞亚群位于造血干细胞分化谱系的顶端层次。

在人骨髓增殖性肿瘤的研究中发现，造血干细胞层面的调控紊乱与该类疾病的发生发展密切相关。也有研究表明在成人骨髓造血中，人巨核系分化可以直接来源于多能造血祖细胞(MPP)而不经过中间体巨核-红祖细胞(MEP)，提示在人造血干细胞池中，也存在巨核偏向造血干细胞。然而，该人巨核偏向造血干细胞表型特征仍不清楚。在骨髓衰竭性疾病(如再生障碍性贫血AA、范可尼贫血FA等)和原发免疫性血小板减少症(ITP)中，巨核系造血最易受损伤，在治疗过程中也最难恢复；另外，对于需要进行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗的恶性血液病患者，血小板减少是常见的术后并发症，数据显示allo-HSCT后超过10％的患者会出现继发性血小板减少，显著增加出血风险，严重影响患者的长期生存。这些临床现象表明了巨核系造血重建相对困难，其可能与巨核偏向造血干细胞的特性相关。

目前血液相关疾病的治疗中由于成体造血干细胞移植受到极低配型概率、移植物抗宿主病等限制导致无法根治骨髓和恶性造血疾病；即使使用脐带血造血干细胞移植，仍然面临脐带血造血干细胞数量不足、质量欠佳的限制在成人和较大体重儿童中无法应用，因此目前解决造血干细胞数量不足是改善造血干细胞临床应用的瓶颈的首要解决方案。功能性造血干细胞(HSC)的体外扩增对于充分实现基于造血干细胞的治疗至关重要。现有体外扩增人造血干细胞的方法主要利用在培养体系中加入细胞因子(如干细胞生长因子SCF，促血小板生成素TPO等)，小分子化合物(SR1,UM171等)，大分子化合物(聚乙烯醇PVA)，多肽(NOV)等。同时也有利用两性离子水凝胶(ZTG)构建三维培养方式进行造血干细胞的体外扩增。依靠在培养基中加入血清及SCF、TPO、Flt3L等细胞因子的扩增效果并不理想，HSC很快便发生分化、衰竭。嘌呤衍生物SR1可对人动员外周血CD34

于此同时，现阶段对于造血干细胞体外扩增的方案多基于人脐带血细胞中CD34

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出基于三维微载体体外培养人造血干细胞的方法，本方法可直接培养单核细胞，培养体系简单，本方法培养获得的干细胞能够促进造血干细胞，尤其是巨核干细胞绝对数量(absolute number)上的扩增，直接应用于血液病的治疗显示较好的疗效。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一个方面提供一种基于三维微载体的功能性造血干细胞的体外扩增方法，该方法包括将三维微载体添加至扩增培养基，培养人源非贴壁细胞，所述非贴壁细胞为人单核细胞，所述功能性造血干细胞为人巨核偏向造血干细胞。

进一步，所述扩增方法中的人单核细胞来源为骨髓，外周血和脐带血之一。

进一步，所述扩增方法中的人单核细胞采自血液病患者骨髓，优选的为骨髓衰竭性疾病患者，优选的为再生障碍性贫血患者。

进一步，所述扩增方法，中三维微载体在扩增培养基中的浓度为2.5-5mg/mL。

可选的，所述扩增方法中使用的三维微载体为市面销售的三维微载体，优选的为细胞用明胶三维微载体。

可选的，所述扩增方法中使用的三维微载体为颗粒状、片状和/或聚集形式。

可选的，所述扩增方法中使用的三维微载体为三维微载体颗粒，所述颗粒的平均粒径在50-500μm之间，优选的平均粒径为50-200μm、200-400μm或400-500μm；所述颗粒的孔径为10-30μm，优选的孔径为15-25μm。

可选的，所述扩增方法中使用的三维微载体为三维微载体颗粒，所述颗粒的孔隙率大于80％，优选的所述孔隙率为80％、90％或95％。

可选的，所述扩增方法中使用的三维微载体为华龛生物科技有限公司的3D

进一步，所述扩增方法，包括如下步骤：

(1)将骨髓、外周血、脐带血来源的单核细胞使用扩增培养基重悬至细胞浓度为5×10

(2)将三维微载体铺入24孔板内，并紫外照射20-30min；

(3)培养体系中细胞与三维微载体的比例为：5×10

进一步，所述扩增方法，步骤(3)培养条件为在37℃，5％CO

进一步，所述扩增方法，步骤(1)所述扩增培养基为StemSpan

本发明第二方面为一种功能性造血干细胞，根据本发明基于三维微载体的功能性造血干细胞的体外扩增方法培养获得。

本发明第三个方面为一种药物制剂，所述制剂包括根据本发明基于三维微载体的功能性造血干细胞的体外扩增方法培养获得的功能性造血干细胞和药学上可以接受的载体。

本发明第四个方面为将基于三维微载体的功能性造血干细胞的体外扩增方法培养获得的功能性造血干细胞，以包含所述功能性造血干细胞的药物制剂用于制备治疗血液疾病制剂中的用途。

进一步的，所述血液疾病为骨髓衰竭性疾病。

进一步的，所述骨髓衰竭性疾病包括放化疗引起的骨髓性衰竭、再生障碍性贫血AA、范可尼贫血FA、原发免疫性血小板减少症(ITP)。

本发明第五个方面为三维微载体在体外培养功能性造血干细胞中的应用，所述应用为将三维微载体添加到体外培养人单核细胞的培养基中，所述培养基中细胞数与三维微载体的加入量比例为：5×10

进一步的，所述应用中的单核细胞来源为外周血、脐带血或骨髓。

进一步的，所述单核细胞采自血液病患者外周血，优选的为骨髓衰竭性疾病，优选的为再生障碍性贫血。

进一步的所述的应用，使用三维微载体培养患者单核细胞的方法为：

(1)将单核细胞使用培养基重悬至细胞浓度为2×10

(2)将浓度为5mg/ml的三维微载体按照10mg/孔铺入24孔板内，并紫外照射20-30min；

(3)吸取100μL细胞悬液加入孔内，使三维微载体充分吸收细胞悬液，放入培养箱培养2小时后，补加1.9mL培养基至终体系2mL，搅动微载体使其分散开，均匀分布到培养基中，培养条件为在37℃，5％CO

本发明的第六个方面为，将基于三维微载体的功能性造血干细胞的体外扩增方法用于制备人巨核偏向造血干细胞的用途，所述人巨核偏向造血干细胞富集在CD34

本发明的第七个方面为，将三维微载体在体外培养人造血干细胞中的应用，所述人造血干细胞能较长期地维持其干性且偏向巨核谱系分化。

本发明第八个方面为，将三维微载体在体外培养人造血干细胞中的应用，所述人造血干细胞具有短期造血干细胞集落形成的特性，且培养后向多谱系分化的潜能得以保持。

本发明的第九个方面为，将三维微载体在体外培养人造血干细胞中的应用，所述人造血干细胞能引起环境细胞因子的重编程，且具有促进巨核谱系的激活和分化的功能。

相对于现有技术，本发明的有益效果：

本发明克服现有技术的不足提供体外培养人造血干细胞的方法，培养体系简单，使用无血清培养基且仅需额外加入两种细胞因子，无需加入小分子化合物、大分子化合物，满足临床需求且兼顾降低成本的需求对于应用于广大血液病患者治疗有重要的意义。

本发明克服现有技术无法解决的难以长期造血干细胞的技术瓶颈，惊奇的发现，将用于贴壁细胞培养的仿生微载体应用到人造血干细胞培养领域，能够获得人功能性长期造血干细胞。

同时本发明预料不到的发现，仿生微载体在体外培养人造血干细胞可以长期维持造血干细胞的干性，并增强其向巨核谱系分化的潜能。仿生微载体用于体外培养造血干细胞能够促进巨核干细胞绝对数量(absolute number)上的扩增。

通过分析基于仿生微载体体外培养获得的功能性造血干细胞，惊奇的发现一个特定的CD34

本发明使用三维微载体对血液病患者自身的单核细胞培养，制备回输细胞治疗制剂，克服了现有细胞治疗领域异体移植成功率低，自体脐带血扩增数量不够的缺陷，对血液病的治疗的便捷性、普适性具有重要的意义，极具临床推广的价值。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1.实施例1和实施例2中脐带血CD34

图2.实施例1中脐带血CD34

图3.实施例2中正常人骨髓单核细胞、外周血单核细胞、脐带血单核细胞体外培养后细胞表型典型流式图；

图4.实施例3中空白对照组、三维微载体组培养后脐带血CD34

图5.实施例4中空白对照组、三维微载体组培养后脐带血CD34

图6.实施例5中免疫缺陷鼠极限稀释移植的实验设计流程图、一次与二次移植长期干细胞频率统计表、小鼠骨髓内各系细胞典型流式图与植入率水平统计图；

图7.实施例6中体外长期培养前后(0、4、6周)细胞表型典型流式图及各亚群活细胞比例与绝对数量随时间(0-7周)变化统计图；

图8.实施例7中免疫缺陷鼠极限稀释移植后小鼠骨髓内巨核系细胞典型流式图与巨核造血干细胞频率统计图；

图9.实施例8中RNA-seq测序结果GO:MF与GSEA富集分析及蛋白质谱分析及实时荧光定量PCR分析及Luminex液相芯片多因子定量分析图；

图10.实施例8中10X Genomics单细胞RNA-seq测序结果分析图；

图11.实施例9中脐带血CD34

图12.实施例9中BD Rhapsody单细胞RNA-seq测序结果分析图；

图13.实施例9中脐带血CD34

图14.实施例10中免疫缺陷鼠异种移植后小鼠外周血血小板计数及骨髓内巨核系细胞典型流式图与巨核重建成功率统计图；

图15.实施例12中再障病人单核细胞体外培养后总细胞及各亚群细胞比例与绝对数量变化统计图；

图16.实施例12中再障病人单核细胞体外培养后CD34

图17.实施例13中培养后再障病人单核细胞体外克隆形成细胞实验不同类型集落数目统计图；

图18.实施例14中免疫缺陷鼠移植培养后再障病人单核细胞的小鼠骨髓内hCD45

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

“三维微载体”，也称为微载体颗粒或者微载体，指微米尺度范围大小的颗粒物，能适用于贴壁细胞生长附着于其上生长。大多数贴壁细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，而微载体多孔、大表面积、生物相容性等特征使细胞可以生长在微载体的内部，形成三维培养模式，这种仿生型三维培养模式得到了越来越广泛的应用。

本发明使用的三维微载体颗粒的大小优选在50-500μm之间，孔隙率通常大于80％，例如，90％或95％，包括但不限于聚集形式、片状、和/或粉末状的微载体颗粒。本发明说明书实施例使用三维微载体为华龛生物科技有限公司的3D

下面结合实施例来详细说明本发明。

表1：本发明实施例使用试剂

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实施例1基于仿生微载体对人脐带血CD34

1.使用三维微载体对造血干细胞培养包括如下步骤：

1)将人新鲜脐带血按照脐带血：HESpan＝4：1的比例在高温高压灭菌过的玻璃血浆瓶中混匀后室温静置沉降45min以充分交联沉降血液中的红细胞。

2)使用10ml一次性无菌移液管及1ml移液枪将血浆瓶上层淡黄色上清液体小心吸出至2个50ml离心管，1600r 10min离心弃上清。

3)离心管中加入少量ACK红细胞裂解液吹打混匀，再加入40ml ACK充分颠倒混匀，37℃水浴约25min，1500r 10min离心弃上清。

4)适量无菌PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心弃上清。此步获得人脐带血单核细胞，用适量PBS缓冲液重悬取10μl使用0.4％ Trypan Blue Solution染色计数。

5)根据单核细胞的数量加入适量PBS缓冲液重悬，然后依次加入适量FcRBlocking Reagent(用以封闭非特异性结合位点)及CD34磁珠，吹打混匀，4℃避光孵育30min，期间每隔10min上下颠倒离心管混匀细胞数次。

6)适量无菌PBS缓冲液洗涤细胞后过LS柱，收集CD34

7)新鲜配制含1％PS、100ng/ml hTPO、10ng/ml hSCF的SFEMⅡ培养基。设置A.未培养组(Fresh)B.空白对照组(Control)C.三维微载体组(Microniche)D.材料对照组(PVA,Cytodex3,Cytopore1)E.小分子对照组(SR1,UM171)：

A.对于未培养组，经上述步骤1至6分离得到脐带血CD34

B.对于空白对照组，用培养基重悬新鲜分离的CD34

C.对于三维微载体组，按照10mg/孔(5mg/ml)将微载体铺入24孔板内，并紫外照射20-30min。吸取100μl细胞悬液加入孔内，使细胞与载体充分吸收细胞悬液，孔板边缘培养孔补充2ml PBS缓冲液，放入培养箱待2h后，补加1.9ml培养基至终体系2ml，并轻轻用枪头搅动微载体使其分散开，均匀分布到培养基中。初始铺板细胞浓度为2×10

D.对于材料对照组，使用培养基将水溶性聚合物聚乙烯醇(PVA)的10％储备液稀释到适宜浓度，然后加入到事先铺好培养基和细胞悬液的孔中，达到文献报道的终浓度0.1％，反复吹打混匀。按照说明书对GE材料Cytopore1和Cytodex3进行水合(膨胀干燥的材料粉末)与高压无菌化预处理，然后尽可能多地吸出无菌材料中的PBS，用培养基润洗材料，调整培养基体积使得材料终浓度为2mg/ml Cytopore1和5mg/ml Cytodex3(处于推荐使用范围内)，将材料悬浮液和细胞悬液加入培养孔中，吹打混匀。初始铺板细胞浓度为2×10

E.对于小分子化合物组，使用培养基将化合物储备液稀释到适宜浓度，阳性对照StemRegenin(SR1)采用文献报道的终浓度1μM，UM171采用文献报道的终浓度40nM，配制过程注意避光操作。每孔先加入1.8ml培养基，然后吸取100μl细胞悬液加入孔内，再加入100μl化合物稀释液，反复吹打混匀。初始铺板细胞浓度为2×10

8)B、C、D、E组每组安排4-6个平行复孔，37℃、5％ CO

9)1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬，取10μl收获的细胞悬液使用0.4％ Trypan Blue Solution染色对活细胞进行计数。

10)1500r 10min离心弃上清，调整每流式管细胞浓度在2×10

11)孵育结束后每管加入1ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬细胞，上机前使用DAPI染色。

12)使用BD FACS CANTOⅡ流式细胞仪上机检测并使用FlowJo 10软件圈门分析细胞比例及绝对数。

2.实验结论：

表2：

表3：

由图1、图2及表2-3展示的数据可以看出原始HSC亚群：CD34

基于上述数据可知，脐带血CD34

实施例2基于三维仿生微载体对骨髓、外周血、脐带血来源人单核细胞培养以及表型分析

1、脐带、骨髓、外周血来源单核细胞采集

1.1分离脐带血单核细胞：

1)人新鲜脐带血按照脐带血：HESpan＝4：1的比例在高温高压灭菌过的玻璃血浆瓶中混匀后室温静置沉降45min以充分交联沉降血液中的红细胞。

2)使用10ml一次性无菌移液管及1ml移液枪将血浆瓶上层淡黄色上清液体小心吸出至2个50ml离心管，1600r 10min离心弃上清。

3)离心管中加入少量ACK红细胞裂解液吹打混匀，再加入40ml ACK充分颠倒混匀，37℃水浴约25min，1500r 10min离心弃上清。

4)适量无菌PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心弃上清。此步获得人脐带血单核细胞，用适量PBS缓冲液重悬取10μl使用0.4％ Trypan Blue Solution染色计数。

1.2分离骨髓、外周血来源单核细胞：

5)抗凝管采集的人骨髓样本或外周血样本，1200r 5min离心，吸弃上层血清。

6)向剩余样本加入与离心后样本等量的无菌PBS缓冲液稀释样本，吹打混匀。

7)另取无菌15ml离心管，做好标记，PBS稀释后样本2/3倍体积的淋巴细胞分离液，用一次性移液管将稀释后的样本小心转移至淋巴细胞分离液面上，注意不要将界面打破，保持界面清晰，1800r20min离心(升速3降速3)。

8)离心后液面分三层，1ml枪尖小心吸取中间白膜层于15ml无菌离心管中，加入6-8倍体积PBS缓冲液，吹打混匀，1500r 10min离心。

9)吸弃离心后上清液，获得人骨髓或外周血来源单核细胞，加入适量PBS重悬，吹打混匀，取10μl使用0.4％ Trypan Blue Solution染色计数。

2.培养方法包括如下步骤:

新鲜配制含1％PS、100ng/ml hTPO、10ng/ml hSCF的SFEMⅡ培养基。设置A.未培养组(Fresh)B.空白对照组(Control)C.三维微载体组(Microniche)D.小分子化合物组(SR1和UM171)：

A.对于未培养组，经上述步骤1)至9)分离得到人脐带血、骨髓或外周血单核细胞不进行培养，直接进行后续流式检测分析；

B.对于空白对照组，用培养基重悬新鲜分离的人脐带血、骨髓或外周血单核细胞至2×10

C.对于三维微载体组，按照10mg/孔(5mg/ml)将微载体铺入24孔板内，并紫外照射20-30min。吸取100μl细胞悬液加入孔内，使细胞与载体充分吸收细胞悬液，孔板边缘培养孔补充2ml PBS缓冲液，放入培养箱待2h后，补加1.9ml培养基至终体系2ml，并轻轻用枪头搅动微载体使其分散开，均匀分布到培养基中。初始铺板细胞浓度为2×10

D.对于小分子化合物组，使用培养基将化合物储备液稀释到适宜浓度，阳性对照StemRegenin(SR1)采用文献报道的终浓度1μM，UM171采用文献报道的终浓度40nM，配制过程注意避光操作。每孔先加入1.8ml培养基，然后吸取100μl单核细胞悬液加入孔内，再加入100μl化合物稀释液，反复吹打混匀。初始铺板细胞浓度为2×10

11)后续步骤同实施例1步骤8)至12)。

3.实验结论：

表4：

由图1、图3及表4可知对于正常人骨髓来源单核细胞(BM MNCs)、外周血来源单核细胞(PB MNCs)和脐带血来源单核细胞(UCB MNCs)，相比于空白对照组和小分子化合物组，三维微载体能稳定维持扩增原始HSC亚群：CD34

由以上结果可知，相比于目前已知的外周血扩增手段，三维微载体具有显著的优势，具有扩增多种来源(骨髓、外周血、脐带血)人造血干细胞的能力。

实施例3三维微载体促进人造血干细胞克隆形成作用分析

1.实验方法：

1)脐带血hCD34

2)每管细胞加入适量IMDM培养基重悬，调整细胞浓度为4×10

3)向4℃过夜解冻的H4434半固体培养基中按1：10体积加入调整好浓度的细胞悬液(每ml H4434半固体培养基配比100μl细胞悬液)，Vortex充分震荡混匀后短暂静置使气泡浮到表面消失。分别设置溶剂对照组、微载体实验组两组，使用6孔板铺板，每组安排4-5个复孔。

4)用连有Syringes针头的螺口注射器吸取半固体细胞混悬液，向6孔板中间2孔内各加入1ml，轻轻摇匀使半固体混悬液均匀铺满整个孔板底面，孔板四周用PBS缓冲液液封，小心放置在37℃，5％CO

5)培养12-16天后每天在显微镜下观察培养板，待集落密度适宜时取出，对红细胞爆式集落形成单位(BFU-E)，红细胞集落形成单位(CFU-E)，粒细胞、巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)，粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)分别计数并扫描拍照。

2.实验结论：

由图4可知，三维微载体培养的脐带血CD34

实施例4三维微载体促进人造血干细胞长周期造血克隆形成作用分析

1.实验方法：

(1)基质细胞准备

1)复苏冻存的小鼠骨髓基质M2-10B4细胞系，新鲜配置传代培养基(高糖1640+10％FBS+1％PS)重悬细胞，取出少量细胞使用0.4％ Trypan Blue Solution染色后进行活细胞计数。

2)将细胞悬液铺入T75细胞培养瓶或10cm细胞培养皿，培养过夜后观察基质细胞贴壁状态。

3)显微镜下观察基质细胞增殖至理想数量时超净台内弃去培养基上清，加入适量PBS缓冲液轻轻摇晃洗涤2次，再向其中加入3mL0.25％ Trypsin-EDTA溶液，充分振荡混匀，镜下观察大部分纤维状贴壁细胞悬浮脱落且形态变圆时，向体系中加入适量FBS终止消化。

4)反复吹打细胞收集细胞悬液，取出少量细胞使用0.4％ Trypan Blue Solution染色后进行活细胞计数。

5)1000r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液洗涤2次后重悬细胞转移至流式管中，调整M2-10B4基质细胞浓度为10

6)新鲜配置人长周期培养基(Human long term culture media，HLTCM)，其中添加终浓度为10

(2)基质细胞铺被

1)超净台内使用排枪在平底96孔板中央60孔内每孔加入50μL Collagen胶原蛋白溶液，轻摇铺匀后平置孔板常温静置晾干，使胶原蛋白均匀平铺于孔板底部，约1h后封口膜密封，4℃保存一周内使用，至此胶原蛋白孔板包被完成。

2)基质细胞铺被前使用排枪在胶原蛋白孔板中每孔轻轻加入100μL PBS缓冲液静置片刻再吸出，总共洗涤2次，以充分洗去胶原蛋白表面产生的浮酸避免酸性环境对基质细胞的影响。

3)将X射线照射过后的基质细胞悬液充分吹打混匀，每孔加入100μL M2-10B4细胞悬液在孔板胶原蛋白上层，轻摇96孔平板使其均匀铺被在胶原蛋白表面，即每孔包含1.2×10

(3)铺入上层细胞

1)脐带血hCD34

2)上层细胞铺被前使用排枪在基质细胞孔板中每孔轻轻吸出50μL上清液体。

HLTCM培养基重悬细胞至合适的细胞密度。随后按照预先设定的上层细胞浓度梯度(通常为1000、500、250、125、63个起始细胞/孔，每个浓度梯度设置12个副孔)倍比稀释铺入孔中，铺入体积为150μL，96孔平板每孔终体积为250μL。37℃，5％ CO

(4)长周期培养阶段

1)整个长周期培养过程中需要每周进行半量换液，尤其要密切注意下层M2-10B4基质细胞的细胞密度及生长状态。考虑到长周期培养过程中培养基水分的蒸发，具体半量换液操作为每周每孔吸出约40μL，再加入约60μL新鲜配置的HLTCM人长期培养基，吸去培养基时尤其要注意动作轻柔，千万注意不要触及孔板底部搅动基质细胞层。

2)5-6周后培养结束，显微镜下观察96孔板中鹅卵石区域形成情况。若有大于10个细胞克隆的鹅卵石样原始造血区域，则判定该孔为阳性孔，显微镜下拍照随后统计不同细胞浓度下出现鹅卵石样原始造血区域的概率，统计数据使用ELDA软件计算不同组别具有长期造血功能的长期培养起始细胞(LTC-IC)出现的频率。

2.实验结论：

由图5可知，LTC-IC的频率空白对照组为1/1218，三维微载体组为1/662，基于该数据可知，三维微载体体外培养能促进人造血干细胞具有长周期造血能力的鹅卵石样造血区的形成，提高LTC-IC的频率，在功能上维持原始HSC的干性特征。

实施例5验证三维微载体体外扩增人HSC作用

1.免疫缺陷鼠移植实验

1)移植当天X射线照射NOG免疫缺陷小鼠，照射剂量为120cGy，照射结束4小时后进行移植。

2)脐带血hCD34

3)超净台内无菌PBS缓冲液洗涤两遍，1500r 10min 4℃离心，弃上清。

4)细胞按梯度细胞数用无菌PBS缓冲液稀释成合适的浓度具体如下：

A.未培养组100000、50000、10000、1000、100、10个CD34

B.空白对照组50000、10000、2000、400、80、16个对应培养前初始CD34

C.三维微载体组100000、20000、4000、800、160、32个对应培养前初始CD34

尾静脉注射NOG免疫缺陷小鼠，200μL/只。

5)分别于移植后的第4周、第8周、第12周和第16周取10μL尾血检测人CD45

6)第16周CO

7)将收集到的小鼠骨髓细胞用30μm无菌尼龙膜过滤，制成单细胞悬液，1500r10min 4℃离心，弃上清，适量PBS缓冲液重悬，每只小鼠对应取50％骨髓细胞进行二次移植，另取出适量细胞到流式管进行流式检测，剩余细胞离心后用冻存液冻存于-80℃冰箱。

8)用含有2％ FBS的PBS缓冲液配制抗体混合液，流式管中加入适量抗体混合液标记细胞，吹打混匀后4℃避光孵育30-60min。

9)孵育结束后每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min 4℃离心后弃上清，100-200μLPBS缓冲液重悬。BD LSRII/LSRFortessa/CantoII流式细胞仪上机检测，并使用FlowJo 10软件圈门分析小鼠骨髓中人CD45

由图6展示数据可知，三维微载体组长期干细胞频率(1/2394)显著高于空白对照组(1/16624)(具有显著差异，p<0.001)和未培养组(1/11994)(具有显著差异，p<0.01)；三维微载体组长期干细胞频率分别为对照组的6.94倍和未培养组的5.01倍。

三维微载体组在20000和100000细胞剂量组的平均植入水平分别为24.37％和29.45％，而未培养组在最高100000细胞剂量组的平均植入水平为24.45％，对照组在最高50000细胞剂量组的平均植入水平为8.11％，可见经过三维微载体培养后的细胞移植植入水平更高，且需要的细胞更少，即具有更高的移植成功率。

由图6流式图中对小鼠骨髓中髓系、B淋系、T淋系、自然杀伤细胞、红细胞表面分子标记(小鼠骨髓中鼠CD45

图6进一步给出了二次移植的实验步骤以及二次移植的成功率结果：三维微载体组的二次移植成功率(22.2％)高于未培养组(16.3％)和对照组(3.3％)。

以上结果说明三维微载体组具有体外扩增人功能性长期造血干细胞的作用，经三维微载体体外培养体系可以提高移植成功率，具有广阔的前景。

实施例6三维微载体促进人巨核系干、祖细胞作用分析

1.实验方法：

1)新鲜配制含1％PS、100ng/ml hTPO、100ng/ml hSCF的SFEMⅡ培养基，脐带血hCD34

3)每两周取出显微镜下观察细胞状态，超净台内将细胞或细胞与材料复合物反复吹打混匀，使用30μm无菌尼龙膜过滤同时从孔板转移至流式管，适量PBS缓冲液洗涤孔板和尼龙膜一次。

4)1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬，取10μl收获的细胞悬液使用0.4％ Trypan Blue Solution染色对活细胞进行计数。

5)根据计数结果取出适量细胞进行流式分析、CFC实验、CFU-Mk实验、RNA冻存以及传代培养，一直到第8周培养结束。

6)用作流式分析的细胞：

①1500r 10min离心弃上清，调整每流式管细胞浓度在2×10

②孵育结束后每管加入1ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬细胞，上机前使用DAPI染色。

③BD FACS CANTOⅡ/LSRⅡ/AriaIII流式细胞仪上机检测并使用FlowJo 10软件圈门分析细胞比例及绝对数。

2.实验结论：

通过分析干细胞亚群和巨核组细胞亚群的表面标记，进一步验证三维微载体在培养功能性造血干细胞方面预料不到的效果，结果表明：

与B.空白对照组(control)和D.小分子化合物组(UM171)相比，C.三维微载体组CD34

实施例7验证三维微载体体外扩增人巨核造血干细胞作用

1.免疫缺陷鼠移植实验方法：

具体步骤与实施例5步骤1)-6)步骤一致，设置相同的三维微载体组(microniche)、未培养组(fresh)和空白对照组(control)

1)将移植后小鼠骨髓细胞加入适量PBS缓冲液后1500r 10min 4℃离心，弃上清，适量PBS缓冲液重悬，流式管中加入100μl配制好的抗体混合液标记细胞，吹打混匀后4℃避光孵育30-60min，抗体混合液含2％FBS的PBS缓冲液配制APC-Cy7-conjugated anti-MouseCD45、APC-conjugated anti-Mouse CD41、Percp-Cy5.5-conjugated anti-Mouse CD42d、BV786-conjugated anti-Mouse CD61、PE-Cy7-conjugated anti-Mouse Ter119、BV605-conjugated anti-Mouse CD71、FITC-conjugated anti-Human CD45、BV510-conjugatedanti-Human CD41a、PE-conjugated anti-Human CD42b、BV650-conjugated anti-HumanCD61、Alexa Fluor700-conjugated anti-Human CD235a、BV711-conjugated anti-HumanCD71流式抗体mixture；

2)孵育结束后每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min 4℃离心后弃上清，100-200μLPBS缓冲液重悬，上机前DAPI染色。BD AriaIII流式细胞仪上机并使用FlowJo10软件圈门检测小鼠骨髓中鼠CD45

2.实验结论：

由图8可知，经过三维微载体(microniche)体外培养的脐带血CD34

实施例8基于三维微载体体外培养具有调控细胞因子重编程和免疫细胞亚群的作用

1.分析对象：

脐带血hCD34

其中，PCR、转录组测序及10x Genomics单细胞测序对象为两组培养后细胞经磁珠分选得到的CD34

2.具体分析方法为：

(1)实时荧光定量PCR：

1)使用RNeasy Micro Kit(QIAGEN)提取细胞RNA，并使用NanoDrop 2000荧光光谱仪(ThermoFisher Scientific)检测RNA的数量和质量。

2)参考Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase说明书,mRNA逆转录反应体系如下：

3)取Nuclease-free的EP管，将Oligo(dT)18，Total RNA，dNTP，Nuclease-freewater按照上表配制成Mixture，恒温金属浴65℃加热5 min后置于冰上。

4)短暂离心后，在EP管中添加5×First-Strand Buffer，0.1M DTT(可选择性添加RNase抑制剂)，轻轻混匀后恒温金属浴37℃加热2 min。

5)在Nuclease-free EP管中添加1μl M-MLV RT后轻轻吹打混匀，恒温金属浴37℃孵育50 min,恒温金属浴70℃加热15 min终止反应。

6)添加180μl Nuclease-free water到逆转录合成的cDNA中，混匀后保存于-20℃.

7)采用SYBR Green染料法(参考Takara SYBR@Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)说明书，384孔板体系为10μl),实时定量PCR反应体系如下：

8)将体系中的反应液涡旋混匀，逐个小心添加到相应的384-well PCR板，短暂离心后置于Q6Real-Time PCR仪中，设置反应条件如下：

9)溶解曲线程序为仪器默认，根据ΔΔCt法分析实验数据。

(2)转录组测序分析

准备1×10

(3)基因集富集分析(GSEA)

转录组测序获得的总基因列表用于GSEA分析，从GSEA基因集数据库(http://www.gsea-494msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中搜索参考基因集，具体为：

KEGG_CYTOKINE_CYTOKINE_RECEPTOR_INTERACTION，

GRAHAM_NORMAL_QUIESCENT_VS_NORMAL_DIVIDING_UP，GOBP_CELL_CYCLE_ARREST，

REACTOME_FACTORS_INVOLVED_IN_MEGAKARYOCYTE_DEVELOPMENT_AND_PLATELET_PRODUCTION，GO_MEGAKARYOCYTE_DEVELOPMENT

(4)蛋白质谱定量分析

每组准备1×10

(5)采用Luminex液相悬浮芯片检测

Luminex液体悬浮芯片检测由华盈生物医药科技有限公司(中国上海)进行。根据制造商的说明使用Bio-Plex Pro Human Chemokine Panel 40-plex试剂盒。将每组3个重复的条件培养基在嵌入磁珠的96孔板中孵育1h，然后加入检测抗体孵育30min。然后将链霉亲和素-PE加入每个孔中反应10min，使用Bio-Plex MAGPIX系统(Bio-Rad)读取数据值。

(6)10x Genomics单细胞测序(scRNA-seq)

准备约1×10

3.实验结论：

基于转录组测序分析三维微载体组和空白对照组之间mRNA谱的差异获得如下结论：其中273个基因在微载体培养细胞中上调，由图9a可知，GO功能注释和KEGG通路富集分析揭示了几个差异显著的基因集和通路受微载体培养调控，其中包括趋化因子和细胞因子相关通路。

基于基因集富集分析(GSEA)，评估了文献和数据库报道的细胞因子-细胞因子受体相互作用相关基因集、干性相关基因集(静息、细胞停滞)和巨核谱系发育相关基因集，获得如下结论：如图9b上所示的5个基因集均在三维微载体组富集。

基于蛋白质谱数据的KEGG富集分析，由图9c获得如下结论：微载体培养细胞中黏着斑和血小板活化蛋白被激活，这与RNA-seq结果一致，表明三维微载体体外培养促进了巨核谱系激活。图9d实时定量PCR再次证实细胞因子-细胞因子受体通路中的大多数基因经过微载体培养上调。

基于Luminex液相悬浮芯片检测，定量比较空白对照与三维微载体培养细胞中40种趋化因子的差异，由图9e获得如下结论：其中大多数受试因子在三维微载体组中含量均升高。以上结果提示细胞因子谱在三维微载体培养环境中被重新编程。

基于10x Genomics单细胞测序(scRNA-seq)结果的降维和UMAP可视化分析，获得如下结论：由图10可知，根据其相应典型标志基因注释了9个细胞簇(C0-8)，其中发现C1、C6和C8中来自微载体组的细胞比例高于空白对照组。根据巨核细胞(Mk)系和红细胞(Er)系标志基因的富集，如IGTA2B(CD41)、VWF、ITGB3(CD61)、NFE2、GATA1和TFRC(CD71)，以及干细胞标志基因TAL1、IGTA6(CD49f)和HES1，C6被注释为Mk和Er干祖细胞。这些结果与通过三维微载体培养促进巨核谱系激活一致。

在CellMarker数据库中搜索每个簇的典型标志基因，其他簇被定义为C0：粒细胞-单核细胞祖细胞1(GMP1)；C1：CD4

此外，基于CellPhoneDB细胞通讯(图10k)分析各细胞簇内的细胞因子-受体通信，发现C1与其他细胞簇广泛通信。这些结果表明，三维微载体细胞培养体系中特定的细胞群(C1)引起环境细胞因子的重编程，可能有助于巨核谱系的激活和分化。

综上结果表明三维仿生仿生微载体体外培养具有调控细胞因子重编程及免疫细胞亚群作用。

实施例9仿生微载体体外培养促进特异性细胞亚群即巨核造血干细胞作用

1、分析对象：

脐带血hCD34

BD Rhapsody单细胞测序对象为两组培养后细胞经FACS ArialIII流式细胞仪分选得到的CD34

2、具体分析方法：

2.1流式分析方法：

1)脐带血hCD34

2)孵育结束后每管加入1ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬细胞，上机前使用DAPI染色。

3)BD FACS CANTOⅡ/AriaIII流式细胞仪上机检测并使用FlowJo 10软件圈门分析细胞比例及绝对数。

2.2BD Rhapsody单细胞测序分析：

1)使用BD FACS AriaIII流式细胞分选仪分选各2×10

2)加入适量CD34、CD38、CD45RA、CD90、CD49f的AbSeq antibody，冰上孵育30min，适量BD Pharmingen

3)用低吸附枪头吸取620μL预冷的Sample Buffer(Cat.No.650000062)将细胞轻轻吹打混匀，加入3.1μL的2mM Calcein AM(BD Biosciences，Cat.No.564061)和3.1μL的0.3mM Draq7(BD Biosciences，Cat.No.564904)，用枪轻轻吹打混匀10次左右，37℃避光孵育5分钟吸取10μL进行活细胞计数，剩余细胞置于冰上备用。

4)调P1200M移液器到Prime/Treat模式，按以下步骤处理Cartridge：

①100％乙醇，700μL

②Air

③Cartridge Wash Buffer 1，700μL，室温1min

④Air

⑤Cartridge Wash Buffer 1，700μL,室温10min

⑥Air

⑦Cartridge Wash Buffer 2，700μL，室温≤4小时

5)Loading细胞和磁珠：调P1200M移液器到Prime/Treat模式，吸700μL空气打入cartridge中，然后将P1200M移液器调到cell load模式Loading细胞。将Loading细胞后的cartridge小心取出，立即放入BD Scanner计数。

6)Loading磁珠：调P1200M移液器到Prime/Treat模式，吸700μL空气打入cartridge中，立即将P1200M移液器调到bead load模式Loading磁珠，静置3min后扫描。

7)Washing磁珠：调P1200M移液器到Wash模式，经过2次720μL预冷的samplebuffer处理Cartridge后扫描。

8)裂解细胞，回收捕获并清洗磁珠：调P1200M移液器到Lysis模式，吸550μL含有DTT的Lysis Buffer，2min后将front slider滑动到“BEADS”档，将left slider滑动到“RETRIEVAL”档，调P5000M移液器在Retrieval模式，30s后将front slider滑动到“0”档，加入4950μL含有DTT的Lysis Buffer。将front slider滑动到“OPEN”档，拿出5ml的低吸附管，立即置于15mL磁力架上1min后立即清洗磁珠。再次扫描cartridge。

9)反转录：配制200μL(1library)体系cDNA Mix(包含40μL RT Buffer,20μLdNTP,10μL RT0.1M DTT,12μL Bead RT/PCR Enhancer，10μL R Nase Inhibiter,10μLReverse Transcriptase，98μL无核酶水)，放到金属震荡器上，1200rpm,37℃，45min。

10)Exonuclease I处理：配制200μL(1library)体系Exonuclease I Mix(包含20μL Exonuclease I Buffer,10μL Exonuclease I，170μL无核酶水)，放到金属震荡器上，1200rpm，37℃，30min。80℃金属块上孵育20min，不震荡。冰上1min，磁力架上弃上清。200μL预冷的Bead Resuspension Buffer(Cat.No.650000066)重悬，4℃保存。

11)RPE for WTA文库构建：

配制Random Primer Mix：For 1library：20μL WTA Extension Buffer,20μL WTAExtension Primers，134μL无核酶水。

磁珠置于磁力架上弃上清。75μL Elution Buffer重悬，95℃孵育5min(不震荡)，磁力架上取上清。200μL Elution Buffer洗磁珠，磁力架上弃上清。Random Primer Mix重悬执行如下步骤：

95℃孵育5minutes(不震荡)；

37℃孵育5minutes(1200rpm震荡)；

25℃孵育15minutes(1200rpm震荡)。

配制Primer Extension Enzyme Mix。For 1library：8μL 10Mm dNTP,12μL BeadRT/PCR Enhancer，6μL WTA Extension Enzyme。执行如下步骤：

25℃孵育10minutes(1200rpm震荡)；

37℃孵育15minutes(1200rpm震荡)；

45℃孵育10minutes(1200rpm震荡)；

55℃孵育10minutes(1200rpm震荡)；

磁力架上弃上清。Elution Buffer重悬，95℃孵育5minutes(不震荡)；1200rpm震荡10S，磁力架上取上清，200μL预冷的Bead Resuspension Buffer重悬磁珠，4℃保存；

12)PCR1 For WTA+AbSeq+SMK文库构建，

步骤12)使用试剂如下：

反应程序如下：

13)RPE产物纯化：配制50mL 80％的酒精,AMPure XP磁珠室温并充分旋涡震荡1min。吸360ul AMPure XP磁珠于200μL RPE产物中，吹打混匀,室温孵育10min，磁力架上弃上清，保持在磁力架上，小心加入1mL 80％无水乙醇，30s后弃上清。重复一次后室温干燥5min，40μL Elution Buffer重悬,室温孵育2min,磁力架上取刷上清。

14)配制RPE PCR Mix：For 1 library：60μL PCR MasterMix，10μL UniversalOligo，10μL WTA Amplification Primer；

反应程序如下：

15)纯化RPE PCR产物及AbSeq+SMK PCR1产物，用Qubit定量，2100测文库片段大小；

16)进行WTA Index PCR：For 1library：60μL PCR MasterMix，5μL LibraryForward Primer，5μL无核酶水；

反应程序如下：

17)纯化WTA Index PCR产物，用Qubit定量，2100测文库片段大小；

18)进行AbSeq Index PCR：For 1 library：25μL PCR MasterMix，2μL LibraryForward Primer，18μL无核酶水；

反应程序如下：

19)纯化AbSeq Index PCR产物，用Qubit定量，2100测文库片段大小；

20)进行Sample Tag PCR2：For 1library：25μL PCR MasterMix,2μL UniversalOligo，3μL Sample Tag PCR2 Primer，15μL无核酶水；

反应程序如下：

21)纯化Sample Tag PCR2产物，Qubit定量；

22)进行Sample Tag Index PCR：For 1library：25μL PCR MasterMix，2μLLibrary Forward Primer，18μL无核酶水；

反应程序如下：

23)纯化Sample Tag Index PCR产物，用Qubit定量，2100测文库片段大小；

24)BD SeqGeq软件分析单细胞测序结果。

3.实验结论：

(1)一般来说CD49f表达分为CD49f阴性(CD49f

CD34

(2)根据先前关于干细胞和巨核系标记基因的文献可知原始干细胞标记基因倾向于在C2亚群中富集；偏向巨核系的多能祖细胞标记基因在C3亚群中富集；巨核系祖细胞标记基因倾向于在C3和C4亚群中富集。拟时分析的可视化提示了C2亚群位于造血层级结构的顶端。

由图12展示的单细胞测序结果可知，k均值聚类(k-means clustering)分析存在于空白对照组和三维微载体组的CD34

(3)由图13通过对脐带血CD34

以上结果表明三维微载体体外培养维持了在空白对照培养中容易丢失的(未培养细胞中也存在的)人巨核偏向造血干细胞天然亚群，该亚群富集在CD34

实施例10基于免疫缺陷鼠髓腔移植实验验证三维微载体体外扩增特异性细胞亚群的作用

1.实验方法

免疫缺陷鼠髓腔移植实验

1)移植当天X射线照射NOG免疫缺陷小鼠，照射剂量为120cGy，构建免疫缺陷鼠模型，照射结束4小时后进行移植。

2)脐带血hCD34

3)适量PBS缓冲液重悬，流式管中加入100μL配制好的抗体混合液标记细胞，吹打混匀后4℃避光孵育30-60min。(含2％FBS的PBS缓冲液配制FITC-conjugated anti-HumanCD34、PE-Cy7-conjugated anti-Human CD38、APC-H7-conjugated anti-Human CD45RA、Percp-Cy5.5-conjugated anti-Human CD90、PE-conjugated anti-Human CD49f流式抗体mixture)

4)孵育结束后每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min 4℃离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬，上机前DAPI染色。BD AriaIII流式细胞仪上机，以适量无菌PBS缓冲液作为接受液，对两组细胞分别进行二路分选DAPI

5)按照分得细胞数用无菌PBS缓冲液调整成合适的浓度，200个细胞/25μL/只，髓腔注射到经过麻醉的NOG免疫缺陷小鼠。

6)分别于移植后的第4周、第8周、第12周和第16周取10μL尾血流式检测人CD45

7)第16周CO

8)将收集到的小鼠骨髓细胞用30μm无菌尼龙膜过滤，制成单细胞悬液，1500r10min 4℃离心，弃上清，适量PBS缓冲液重悬，取出适量细胞到流式管进行流式检测，剩余细胞离心后用冻存液冻存于-80℃冰箱。

9)用含有2％ FBS的PBS缓冲液配制抗体混合液(APC-Cy7-conjugated anti-Mouse CD45、APC-conjugated anti-Mouse CD41、Percp-Cy5.5-conjugated anti-MouseCD42d、BV786-conjugated anti-Mouse CD61、PE-Cy7-conjugated anti-Mouse Ter119、BV605-conjugated anti-Mouse CD71、FITC-conjugated anti-Human CD45、BV510-conjugated anti-Human CD41a、PE-conjugated anti-Human CD42b、BV650-conjugatedanti-Human CD61、Alexa Fluor700-conjugated anti-Human CD235a、BV711-conjugatedanti-Human CD71 mixture)，各待测流式管中加入适量抗体混合液标记细胞，吹打混匀后4℃避光孵育30-60min。

10)孵育结束后每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min 4℃离心后弃上清，100-200μL PBS缓冲液重悬，上机前DAPI染色。BD AriaIII流式细胞仪上机并使用FlowJo 10软件圈门检测小鼠骨髓中鼠CD45

实验结论：

由图14血常规结果统计(右)可知，在移植后第16周时无论是未培养组还是三维微载体组，CD49f

图14流式可以看出相比于nonCD49f

基于上述实验数据得出结论，巨核造血干细胞在生理状态和三维微载体培养体系中均富集于CD34

实施例11再生障碍性贫血患者骨髓单核细胞采集

1.实验对象：AA再生障碍性贫血，NSAA非重症再生障碍性贫血

实验对象年龄性别疾病和采集细胞数量如下：

2.培养方法包括如下步骤：

1)抗凝管采集的病人骨髓样本，1200r 5min离心，吸弃上层血清。

2)向剩余样本加入与离心后样本等量的无菌PBS缓冲液稀释样本，吹打混匀。

3)另取无菌15ml离心管，做好标记，PBS稀释后样本2/3倍体积的淋巴细胞分离液，用一次性移液管将稀释后的样本小心转移至淋巴细胞分离液面上，注意不要将界面打破，保持界面清晰，1800r20min离心(升速3降速3)。

4)离心后液面分三层，1ml枪尖小心吸取中间白膜层于15ml无菌离心管中，加入6-8倍体积PBS缓冲液，吹打混匀，1500r 10min离心。

5)吸弃离心后上清液，获得单核细胞，加入适量PBS重悬，吹打混匀，取10μl使用0.4％ Trypan Blue Solution染色计数。

6)新鲜配制含10％胎牛血清(FBS)、1％PS、100ng/ml hTPO、100ng/ml hSCF、100ng/ml hFlt3L、100ng/ml hIL-3、100ng/ml hIL-6和100ng/ml hEPO的IMDM培养基，重悬新鲜分离的单核细胞，将细胞放置于37℃、5％ CO

3.实验结论：

将培养后的细胞进行活细胞计数，用PBS缓冲液充分洗涤后制备成单细胞悬液备用；或用细胞冻存液重悬后，梯度冻存法存放于液氮保存。

实施例12三维微载体扩增再障病人表型造血干细胞作用分析

1.培养方法和流式检测方法：

1)用新鲜配制的相应培养基重悬实施例11分离的病人骨髓单核细胞至2×10

2)设置A.三维微载体组(microniche)、B.空白对照组(control)

A.三维微载体组，按照5mg/孔(2.5mg/ml)将载体铺入24孔板内，并紫外照射20-30min。吸取100μl细胞悬液(即2×10

B.空白对照组，每孔先加入1.9ml培养基，然后吸取100μl细胞悬液加入孔内，反复吹打混匀。

2)将细胞放置于37℃、5％ CO

3)培养结束后将细胞或细胞与材料复合物反复用移液枪吹打混匀，使用30μm无菌尼龙膜过滤同时从孔板转移至流式管，适量PBS缓冲液洗涤孔板和尼龙膜一次。

4)1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬，取10μl收获的细胞悬液使用0.4％ Trypan Blue Solution染色对活细胞进行计数。

5)1500r 10min离心弃上清，调整每流式管细胞在适宜浓度，加入100μl配制好的抗体混合液(含2％FBS的PBS缓冲液配制APC-conjugated anti-Human CD34、PE-Cy7-conjugated anti-Human CD38、PE-conjugated anti-Human CD49f流式抗体mixture)，充分吹打混匀后4℃避光孵育30-60min。

6)孵育结束后每管加入1ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min离心后弃上清，适量PBS缓冲液重悬细胞，上机前使用DAPI染色。

7)BD FACS CANTOⅡ流式细胞仪上机检测并使用FlowJo 10软件圈门分析细胞比例及绝对数。

3.实验结论：

由图15和图16可知，再障病人骨髓单核细胞经过三维微载体的体外培养后，干祖细胞CD34

实施例13三维微载体促进再障病人造血干细胞克隆形成作用分析

1.CFC方法如下：

再障病人骨髓单核细胞三维微载体孔板培养细胞及收获细胞方法同时实例11-12，分组设置同实施例11：A.三维微载体组(microniche)、B.空白对照组(control)。

1)将培养后的细胞加入适量IMDM培养基重悬，调整细胞浓度为5×10

2)向4℃过夜解冻的H4434半固体培养基中按1：10体积加入调整好浓度的细胞悬液(每ml H4434半固体培养基配比100μl细胞悬液)，Vortex充分震荡混匀后短暂静置使气泡浮到表面消失。使用6孔板铺板，每组安排4-5个复孔。

3)用连有Syringes针头的螺口注射器吸取半固体细胞混悬液，向6孔板中间2孔内各加入1ml，轻轻摇匀使半固体混悬液均匀铺满整个孔板底面，孔板四周用PBS缓冲液液封，小心放置在37℃，5％CO

4)培养14-16天后每天在显微镜下观察培养板，待集落密度适宜时取出，对红细胞爆式集落形成单位(BFU-E)，红细胞集落形成单位(CFU-E)，粒细胞、巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)，粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)分别计数并扫描拍照。

2.实验结论：

实验结果展示在图17，经过三维微载体培养后的再障病人骨髓单核细胞与空白对照组相比CFU-E集落数目显著增多(p<0.001)，BFU-E集落总数显著增多(p<0.01)，且BFU-E与CFU-GM集落数目与空白对照组相比无显著性差别，无明显偏系分化倾向。

以上结果说明三维微载体在体外培养再障病人造血干细胞能促进红细胞集落单位形成，且培养后细胞向多谱系分化的潜能得以保持。

实施例14验证仿生微载体体外扩增再障病人HSC作用

1.实验方法

免疫缺陷鼠移植实验

1)移植当天X射线照射NOG免疫缺陷小鼠，照射剂量为120cGy。照射结束4小时后进行移植。

2)再障病人骨髓单核细胞三维微载体孔板培养细胞收获方法同实施例11-12，分组设置同实施例11：A.三维微载体组(microniche)、B.空白对照组(control)。

3)超净台内无菌PBS缓冲液洗涤两遍，1500r 10min 4℃离心，弃上清。适量PBS缓冲液重悬，取10μl收获的细胞悬液使用0.4％ Trypan Blue Solution染色对活细胞进行计数。

4)根据细胞数目选择合适的移植方法：若细胞数目较多，将细胞用无菌PBS缓冲液稀释到1×10

5)分别于移植后的第4周、第8周、第12周和第16周取10μL尾血检测人CD45

6)第16周CO

7)将收集到的小鼠骨髓细胞用30μm无菌尼龙膜过滤，制成单细胞悬液，1500r10min 4℃离心，弃上清，适量PBS缓冲液重悬，取出适量细胞到流式管进行流式检测，剩余细胞离心后用冻存液冻存于-80℃冰箱。

8)用含有2％ FBS的PBS缓冲液配制抗体混合液，流式管中加入适量抗体混合液标记细胞，吹打混匀后4℃避光孵育30-60min。

9)孵育结束后每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500r 10min 4℃离心后弃上清，100-200μLPBS缓冲液重悬。BD LSRII/LSRFortessa/CantoII流式细胞仪上机检测，并使用FlowJo 10软件圈门分析小鼠骨髓中人CD45

实验结论：

由图18可知，经过三维微载体培养的再障病人造血细胞在免疫缺陷小鼠异种移植中能观察到阳性植入，而在空白对照组中没有观察到人CD45

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。