尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在过敏性疾病中的应用

技术领域

本发明涉及尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

背景技术

过敏性疾病又称变态反应性疾病，据世界卫生组织统计，在全球范围内，过敏性疾病患者人群数量庞大，全球约有三分之一的人曾遭受过敏性疾病的侵害。近年来由于工业化程度显著提高，环境污染明显加重以及人们生活方式急剧变化，过敏性疾病的发病率逐年上升，严重的过敏性疾病甚至危及生命，已成为全球公共卫生焦点问题。

目前临床上对于过敏性疾病的辅助检查主要包括皮肤点刺试验（skin pricktest, SPT）及血清sIgE检测等，但SPT试验患者较痛苦依从性差，易受药物影响，并且还可增加全身过敏症状发生的风险，不适于严重过敏体质及儿童与老年群体。sIgE检测也并非无创检测，常需患者反复抽血。为提高过敏性疾病患者的生活质量和依从性，减轻多次采血及点刺试验的痛苦，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病的诊断，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

α1-抗胰蛋白酶( alpha1-antitrypsin，A1AT) 是一种丝氨酸蛋白酶及中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，具有很强的蛋白酶抑制能力，几乎占据了血浆总蛋白酶抑制能力的90%以上。已有研究表明A1AT通过抑制蛋白水解酶,特别是中性粒细胞弹性蛋白酶在肺中起保护作用。 在炎症反应时中性粒细胞弹性蛋白酶被释放，A1AT是维持蛋白酶-抗蛋白酶平衡的重要因素。在本研究中过敏性疾病患者尿液A1AT含量较健康人组出现表达上调，在尿液中含量升高。

与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻过敏性疾病患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

优选地，所述尿液α1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示

(MPSSVSWGIL LLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHH DQDHPTFNKI TPNLAEFAFSLYRQLAHQSN STNIFFSPVS IATAFAMLSL GTKADTHDEI LEGLNFNLTE IPEAQIHEGF QELLRTLNQPDSQLQLTTGN GLFLSEGLKL VDKFLEDVKK LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKELDRDTVFALVN YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFHVDQVTTV KVPMMKRLGM FNIQHCKKLS SWVLLMKYLGNATAIFFLPD EGKLQHLENE LTHDIITKFL ENEDRRSASL HLPKLSITGT YDLKSVLGQL GITKVFSNGADLSGVTEEAP LKLSKAVHKA VLTIDEKGTE AAGAMFLEAI PMSIPPEVKF NKPFVFLMIE QNTKSPLFMGKVVNPTQK )、SEQ ID NO.2所示 ( MPSSVSWGIL LLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHHDQDHPTFNKI TPNLAEFAFS LYRQLAHQSN STNIFFSPVS IATAFAMLSL GTKADTHDEI LEGLNFNLTEIPEAQIHEGF QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKL VDKFLEDVKK LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQINDYVEKGTQ GKIVDLVKEL DRDTVFALVN YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFHVDQVTTV KVPMMKRLGMFNIQHCKKLS SWVLLMKYLG NATAIFFLPD EGKLQHLENE LTHDIITKFL ENEDRRSASL HLPKLSITGTYDLKSVLGQL GITKVFSNGA DLSGVTEEAP LKLSKVRSP )、SEQ ID NO.3所示 (MPSSVSWGILLLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHH DQDHPTFNKI TPNLAEFAFS LYRQLAHQSN STNIFFSPVSIATAFAMLSL GTKADTHDEI LEGLNFNLTE IPEAQIHEGF QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKLVDKFLEDVKK LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKEL DRDTVFALVN YIFFKGKWERPFEVKDTEEE DFHVDQVTTV KVPMMKRLGM FNIQHCKKLS SWVLLMKYLG NATAIFFLPD EGKLQHLENELTHDIITKFL ENEDRR )；或由SEQ ID NO:1~3所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO:1~3所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

优选地，所述制剂为过敏性疾病患者尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

优选地，所述检测方法包括直接检测α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述检测方法包括直接检测α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述标准品包括α1-抗胰蛋白酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：α1-抗胰蛋白酶质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

发明人首先收集了健康人、过敏性疾病患者的尿液标本，2000g离心10min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，酶解后使用C18脱盐柱对样本进行脱盐。调整DDA建库样本质谱色谱条件，质谱分析及建库采用skyline软件处理，调整PRM采集质谱参数设置并完成PRM肽段积分定量，通过定量值校正/计算绝对定量值、差异分析及目标蛋白全局聚类分析对数据进行处理。将过敏性疾病组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算，最终获得差异蛋白α1-抗胰蛋白酶。

本发明通过研究证实与健康人相比，α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在过敏性疾病患者的尿液中呈高表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段可用于过敏性疾病的诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在过敏性疾病组及健康对照组中含量图。

具体实施方式

实施例1

选取过敏性疾病患者作为过敏性疾病组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本2000g离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，留取10ul采用Bradford法进行蛋白定量，对其酶解除盐与分馏分后冻干待上机。

实施例2

调整DDA建库样本质谱色谱条件，采用skyline软件建库，针对每个目标蛋白挑选独有肽段，导出独有肽段离子对列表，PRM靶向采集独有肽段，调整PRM采集质谱参数设置，对PRM肽段积分定量。

实施例3

对数据进行定量校正，计算绝对定量值，针对不同比较组，分析计算每种比较方式的FC值和P值，按照FC＞1.2或FC＜1/1.2，P＜0.05的筛选规则，筛选差异蛋白，对目标蛋白进行全局聚类分析。

与健康人相比，α1-抗胰蛋白酶在过敏性疾病患者的尿液中高表达，其在健康对照组和过敏性疾病组尿液中的含量如图1所示，α1-抗胰蛋白酶在正常对照组和过敏性疾病组尿液中的表达具有显著性差异。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110> 张 曼

<120> 尿液α1-抗胰蛋白酶及其多肽片段在过敏性疾病中的应用

<130> 22PA1AT-CN

<140> 22PA1AT-CN

<141> 2022-01-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> PRT

<213> Human Urine

<400> 1

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 1015

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala

202530

Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn

354045

Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln

505560

Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser

65707580

Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr

859095

His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn

115 120 125

Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu

130 135 140

Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu

165 170 175

Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys

180 185 190

Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu

195 200 205

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val

210 215 220

Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys

245 250 255

Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala

260 265 270

Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu

275 280 285

Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp

290 295 300

Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr

305 310 315 320

Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe

325 330 335

Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys

340 345 350

Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly

355 360 365

Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile

370 375 380

Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu

385 390 395 400

Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr

405 410 415

Gln Lys

<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> Human Urine

<400> 2

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 1015

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala

202530

Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn

354045

Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln

505560

Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser

65707580

Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr

859095

His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn

115 120 125

Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu

130 135 140

Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu

165 170 175

Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys

180 185 190

Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu

195 200 205

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val

210 215 220

Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys

245 250 255

Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala

260 265 270

Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu

275 280 285

Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp

290 295 300

Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr

305 310 315 320

Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe

325 330 335

Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys

340 345 350

Leu Ser Lys Val Arg Ser Pro

355

<210> 3

<211> 306

<212> PRT

<213> Human Urine

<400> 3

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 1015

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala

202530

Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn

354045

Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln

505560

Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser

65707580

Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr

859095

His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn

115 120 125

Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu

130 135 140

Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu

165 170 175

Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys

180 185 190

Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu

195 200 205

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val

210 215 220

Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys

245 250 255

Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala

260 265 270

Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu

275 280 285

Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp

290 295 300

Arg Arg

305