一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸的制备方法和应用。

背景技术

免疫层析技术，也称测流免疫法(Lateral flow immunoassay)，起源于上世纪80年代，是建立在层析膜上以抗原抗体特异性反应为基础的免疫检测技术，以其快捷简便、间隔低廉、灵敏度高等优势而广泛运用于并于病原体检测、食品安全测量、环境监测等方面，其中以胶体金免疫层析技术发展最为成熟，但多局限于定性或半定量检测。伴随着材料科学和生物工程技术的蓬勃发展，新型荧光层析技术已逐渐在定量检测领域站稳脚跟。

免疫层析的反应均会受到温度的影响是公认的，现阶段的解决方案一般是采用加温度控制，但因为整个层析系统是固相的，所以温控并不能很好控制对反应的影响，而且添加温控带来的高成本也会增加投入。尤其是对糖化血红蛋白这种受环境比较大的项目，评测市面上主流的厂家A，当环境温度由22℃变化到25℃时，测试值由6.2％变化到8％。经我们研究发现，按照主流的试剂盒做法，荧光微球上标记目标蛋白的抗体作为检测微球，标记兔IGG抗体作为质控微球；硝酸纤维素膜上包被目标蛋白抗体作为检测线T，包被羊抗兔IGG抗体作为质控线检测。以糖化血红蛋白试剂盒为例，荧光微球上标记HbA1c抗体作为检测微球，标记兔IGG抗体作为质控微球；硝酸纤维素膜上包被Hb抗体作为检测线T，包被羊抗兔IGG抗体作为质控线检测，反应值就是T线的荧光信号比上C线的荧光信号。这种传统模式在测试不同的环境问题的时候就会有问题，因为T线的反应是传统夹心法反应，首先样本中的糖化血红蛋白会跟荧光微球上的糖化血红蛋白抗体反应，再被包被在硝酸纤维素膜上的血红蛋白抗体捕获，整个反应是分两步进行的，而C线的反应则是标记的兔IGG和包被在硝酸纤维素膜上的羊抗兔IGG直接捕获，反应只有一步。温度不同时对T线反应和C线反应必然不同，我们在做测试时，温度从22℃上涨到28℃，T线信号值上涨了50％，而C线信号值只上涨了8％，导致最终的T/C信号上涨了40％左右，造成测试偏差。

发明内容

为此，本发明提供一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸的制备方法和应用，以解决现有检测方法偏差较大的问题。

本发明开创性的提出，做夹心法的C线系统。在荧光微球标记兔IGG抗体，在稀释液中加入羊抗兔IGG，最后在硝酸纤维素膜上包被驴抗羊IGG，形成兔IGG-羊抗兔IGG-驴抗羊IGG的夹心系统。与T线一样是两步法反应，以此来校正温度对反应的影响。现未发现市面上有与本发明相近的方案。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明一方面提供的一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸的制备方法，所述方法包括：

步骤一，荧光微球的制备

将荧光微球离心后，去除上清；加入偶联缓冲液，混匀；再加入EDC溶液和sμLfo-NHS溶液，混匀并孵育，孵育结束后离心去上清；接着继续加入偶联缓冲液，混匀后加入抗Hb单克隆抗体，混匀并孵育；孵育结束后离心，去上清；再加入封闭液，混匀并孵育；孵育结束后离心，去上清；加入保存液，混匀得Hb抗体的荧光微球，为检测线微球；按上述同样的方法，制备兔IGG抗体的荧光微球，为质控线微球。

步骤二，硝酸纤维素膜的制备

将HbA1c抗体，使用稀释液稀释，划线于纤维素膜上一侧作为检测线；将驴抗羊抗体使用稀释液稀释，划线于纤维素膜上作为质控线；烘干；

步骤三，样本垫的制备：

将玻纤裁切，并使用喷金仪将处理液喷涂于玻纤一侧，烘干；

步骤四，样本稀释液的配置

取纯化水、Tris、0.9％的氯化钠，1％曲拉通(Triton X-100)，混匀后调pH；再加入羊抗兔IGG抗体；混匀后得稀释液；

步骤五，组装

将PVC底板上贴好吸水纸、制备好的玻纤垫，硝酸纤维素膜，即得降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸。

进一步的，所述步骤一中，荧光微球为1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nm。

进一步的，所述步骤一中，离心条件为12000rpm-20000rpm，10min。

进一步的，所述步骤一中，偶联缓冲液为50mM MES，pH＝6.0。

进一步的，所述步骤一中，封闭液为1％BSA水溶液。

进一步的，所述步骤一中，保存液为1％BSA，1％蔗糖，Tirs-HCl，pH＝9.0。

进一步的，所述步骤二中，稀释液为5％蔗糖，50mM PBS，pH＝7.5。

进一步的，所述步骤二中，处理液为阻断剂10％，吐温20 0.5％，50mM PBS，pH7.2。

根据本发明另一方面提供的一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸在制备检测糖化血红蛋白试剂盒中的应用。

进一步的，所述试剂盒的使用方法为将不同浓度的样本和HbA1c检测试剂恢复至室温，取5μL样本加入至400μL稀释液中，混匀，取75μL加入至试纸条中，5min后使用荧光检测仪读取结果即可。

本发明具有如下优点：

本发明开创性的提出，做夹心法的C线系统。在荧光微球标记兔IGG抗体，在稀释液中加入羊抗兔IGG，最后在硝酸纤维素膜上包被驴抗羊IGG，形成兔IGG-羊抗兔IGG-驴抗羊IGG的夹心系统。与T线一样是两步法反应，以此来校正温度对反应的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例2提供的一种检测糖化血红蛋白试纸条原理图；其中，1-样本垫；2-检测线；3-质控线；

图2为本发明对比例1提供的一种传统检测糖化血红蛋白试纸条原理图；其中，1-样本垫；2-检测线；3-质控线；

图3为本发明实验例1提供的实施例2和对比例1提供的检测6％糖化血红蛋白温度对比图；

图4为本发明实验例1提供的实施例2和对比例1提供的检测10％糖化血红蛋白温度对比图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

MES：厂家国药沃凯批号20200922；

BSA：牛血清白蛋白，厂家PROLIANT，批号20220405；

PBS：磷酸盐缓冲液(无水磷酸氢二钠厂家国药批号20210111；磷酸二氢钠厂家广东光华批号20200107)。

实施例1

本实施例提供一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸条：

一.荧光微球的制备

1.取出1支500μL荧光微球(1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nM)放入离心管中。

2.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。

3.加入500μL偶联缓冲液(50mM MES pH6.0)，混匀。

4.加入20μLEDC溶液(200mM)，20μLsμLfo-NHS溶液(200mM)，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。

5.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。

6.加入500μL偶联缓冲液(50mM MES pH6.0)，混匀后分别加入0.1mg抗Hb单克隆抗体，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。

7.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。

8.各加入封闭液(1％BSA水溶液)，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。

9.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。

10.各加入500μL保存液(1％BSA，1％蔗糖，Tirs-HCl pH 9.0)，混匀.

二.硝酸纤维素膜的制备

将HbA1c抗体，使用稀释液(5％蔗糖，50mM PBS pH7.5)稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为检测线；将驴抗羊抗体使用稀释液(5％蔗糖，50mM PBS pH7.5)稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为质控线；划膜量1μL/cm，37℃烘干24h。

样本垫的制备：

将玻纤裁切为2*30cm的规格，使用喷金仪将处理液(阻断剂：主要作用是消除HAMA和RF等异嗜性抗体干扰)10％，吐温20 0.5％，50mM PBS pH7.2)喷涂于玻纤一侧，喷量4μL/cm。37℃烘干24h。

三.稀释液的配置

取1L纯化水，加入50mM的Tris(6.057g)，0.9％的氯化钠(9g)，1％曲拉通(Triton-X100)(增加必要的破膜剂，把全部血红蛋白从红细胞释放出来)。混匀后调pH至7.0±0.05。再加入0.03mg/mL的羊抗兔IGG抗体(30mg)混匀后备用。

四.组装：

将PVC底板上贴好吸水纸、制备好的玻纤垫，硝酸纤维素膜，斩切为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装至铝箔袋。

实施例2

本实施例提供一种降低温度对夹心法免疫层析反应影响的试纸条检测糖化血红蛋白使用方法；本发明检测糖化血红蛋白试纸条原理图如图1所示。

本发明中样本垫1：HbA1c与标记有Hb抗体的荧光微球结合；检测线2：免疫复合物与检测线包被的HbA1c抗体结合产生信号；质控线3：免疫复合物与包被有另一种Hb抗体的微球结合产生信号。

将不同浓度的样本和HbA1c检测试剂恢复至室温，取5μL样本加入至400μL稀释液(50mM PBS pH7.2)中，混匀，取75μL加入至试纸条中，5min后使用荧光检测仪读取结果。

对比例1

利用传统检测糖化血红蛋白的试纸条进行测试血红蛋白。原理如图2所示。样本垫1：HbA1c与标记有Hb抗体的荧光微球结合，标记有兔IGG的荧光微球不参与样本反应；检测线2：免疫复合物与检测线包被的HbA1c抗体结合产生信号；质控线3：标记有兔IGG的荧光微球与包被的羊抗兔IGG结合，产生信号。

实验例1

使用本发明实施例2的试纸条(本发明模式)与对比例1的试纸条(传统模式)进行检测糖化血红蛋白，样本6％浓度，不同温度对比如表1和图3所示。

表1

由表1和图3可见，本发明能消除温度对层析反应的影响(糖化为例)。

实验例2

使用本发明实施例2的试纸条(本发明模式)与对比例1的试纸条(传统模式)进行检测糖化血红蛋白，样本10％浓度，不同温度对比如表2和图4所示。

表2

由表2和图4可见，本发明能消除温度对层析反应的影响(糖化为例)。

本发明的C线为夹心法系统，包括但不限于兔IGG-羊抗兔IGG-驴抗羊IGG，鸡IGY-山羊抗鸡IGY-驴抗羊IGG等。凡是使用夹心法抗体解决温度对夹心法免疫层析反应影响的专利都受保护。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。