导航：首页> 水利工程；基础；疏浚>基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗及其制备方法

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗及其制备方法

文献发布时间：2023-06-19 10:25:58

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗及其制备方法。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，可引起普通感冒乃至中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼吸综合征(SARS)、COVID19 等严重疾病。感染的常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气短和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。冠状病毒是一种在动物与人类之间传播的人畜共患病毒。详细调查结果显示，严重急性呼吸综合征冠状病毒是从果子狸传到人，中东呼吸综合征冠状病毒是从单峰骆驼传到人。除此之外，还有一些已知的冠状病毒在动物中传播，但尚未感染人类。新型冠状病毒SARS-CoV-2是以前从未在人类中发现的一种新冠状病毒毒株。

SARS-CoV-2引起的严重的传染性疾病COVID19。SARS-CoV-2具有好传染性高致死率的特点，截止2020年8月，在全球范围内SARS-CoV-2已经引起2100多万人感染，77万多人死亡和可能高达21万亿美元的损失。据现有数据预测，以新冠病毒为代表的冠状病毒很有可能成为一个长期存在、年度流行的病毒。有效的疫苗是应对冠状病毒感染的最佳手段。

流感是一种由流感病毒(通常是流感A或B亚型)引起的传染性急性呼吸道疾病。流感可导致轻度到重度疾病，也可造成潜在疾病发作或继发细菌感染。某些人很容易患严重流感并发症，如孕妇、老人、小孩以及一些患有慢性疾病的人。每年流感都会造成约300万至500万件重症感染，其中约25万至50万人死亡。免疫接种是预防流感病毒感染的最好干预途径。

按现有的数据和流行病规律预测，冠状病毒和流感病毒的流行时间窗口会有很大程度的重合。因而开发同时针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗将会在免疫接种方案和成本上提供极大的方便和优势。

传统灭活疫苗、重组蛋白疫苗生产周期长，工艺复杂无法应对突发性大规模流行病的大规模接种需要。mRNA则是一种应对爆发性疫情的快速反应疫苗开发平台。近年来Moderna和BioNTech公司开发的mRNA(信使核糖核酸)疫苗启动临床试验，提供了mRNA疫苗的安全性和有效性的前期数据。mRNA疫苗是利用线性化的质粒DNA为模板，在体外进行酶转录反应合成的，该合成策略避免了活细胞培养生产方式，需要考虑的安全性以及复杂的生产工艺等问题。mRNA疫苗平台具有安全，有效，生产周期短，工艺简洁的特点，因而特别适合应对爆发性疫情。

市场至今未出现能够同时表达冠状病毒和流感病毒的抗原的疫苗，需要针对不同的病毒注射两次，增加病人痛苦。

市场需要一种能够同时防疫冠状病毒和流感病毒的联合疫苗，既能减轻病人痛苦，又能够达到注射单种病毒疫苗的免疫效果；本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗及其制备方法，通过使用一条mRNA能够同时表达冠状病毒和流感病毒的抗原，具有强免疫原性，既能减轻病人痛苦，又能够达到注射单种病毒疫苗的免疫效果。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗，包括：脂质体包裹的mRNA-Spike，脂质体包裹的mRNA-HA； mRNA根据α病毒的基因组设计而成；mRNA-Spike包含了新冠肺炎的刺突Spike蛋白基因，mRNA-HA包含了流感的血凝素蛋白基因。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗，包括：脂质体包裹的mRNA-RBD-HA；mRNA根据α病毒的基因组设计而成；mRNA-Spike包含了新冠肺炎的刺突Spike蛋白基因和流感的血凝素蛋白基因。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗，mRNA包括：常规mRNA或自复制mRNA。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗，自复制mRNA利用线性化的质粒DNA为模板，在体外进行酶转录反应合成。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，制备mRNA-Spike制剂的步骤包括：

步骤a，合成Spike基因片段：

查询Spike氨基酸序列，根据人偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，在优化后的序列的上游加入启动子和 ApaI酶切位点GGGCCC，下游加入NotI酶切位点GCGGCCGC，将设计好的序列通过合成获得；

步骤b，构建TC-83自复制载体：

根据α病毒家族的基因组设计自复制mRNA序列，所述自复制mRNA序列包含可编码α病毒自复制组件的基因，缺乏制造具有传染性的α病毒颗粒的结构蛋白的基因，将自复制mRNA序列构建到的质粒中做为模板扩增，将设计好的序列通过合成获得；

步骤c，制备重组质粒JCXH-103：

将上游携带ApaI、下游携带NotI的Spike基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒JCXH-103；

步骤d，JCXH-103质粒用限制性内切酶切线性化；

步骤e，将线性化的JCXH-103质粒进行体外转录反应，再对模板DNA进行降解，最后将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mRNA的5’端；

步骤f，mRNA与脂类混合，mRNA包裹进入LNP内，得到mRNA-LNP复合物，通过浓缩及换液至制剂溶液中。

步骤二，制备mRNA-HA制剂的步骤包括：

步骤A，合成Flu基因片段；

步骤B，构建TC-83自复制载体；

步骤C，将上游携带ApaI、下游携带NotI的HA基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒JCXH-104；

步骤D，JCXH-104质粒用限制性内切酶切线性化；

步骤E，将线性化后JCXH-104质粒先开始体外转录反应，再对模板DNA进行降解，最后将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mRNA的5’端；

步骤F，mRNA与脂类混合，将mRNA包裹进入LNP内，得到mRNA-LNP复合物，通过浓缩及换液至制剂溶液中；

步骤三，将mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，合成RBD-HA基因片段；

步骤二，构建TC-83自复制载体；

步骤三，将上游携带ApaI、下游携带NotI的HA基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒JCXH-105；

步骤四，将JCXH-105质粒用限制性内切酶切线性化；

步骤五，将线性化后的JCXH-105质粒进行体外转录反应，再对模板DNA进行降解，最后将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mRNA的5’端；

步骤六，mRNA与脂类混合，使得mRNA包裹进入LNP内，得到mRNA-LNP复合物，通过浓缩及换液至制剂溶液中，得到联合疫苗。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，限制性内切酶为BspQI酶。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，线性化后的JCXH-103质粒、JCXH-104质粒、 JCXH-105质粒使用T7 RNA聚合酶开始体外转录反应，使用Turbo DNase酶对模板DNA进行降解，使用加帽酶将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mRNA的5’端。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，脂类包括：PEG2000，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，阳离子脂类DLinDMA。

前述的基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法，mRNA与脂类混合采用Nanoassemblr混合器进行混合。

本发明的有益之处在于：

本发明通过使用一条mRNA能够同时表达冠状病毒和流感病毒的抗原，具有强免疫原性，既能减轻病人痛苦，又能够达到注射单种病毒疫苗的免疫效果；

基于自复制mRNA疫苗在动物实验中有很强的免疫原性，能够以自身为模板复制出自身的序列，因此相比常规mRNA疫苗需要的接种剂量更少，并且自复制时所诱导的免疫反应形成的佐剂效应，能够诱导出更强的的免疫应答，进一步增强体液和细胞免疫反应；

自复制mRNA是利用线性化的质粒DNA为模板，在体外进行酶转录反应合成的，该合成策略避免了活细胞培养生产方式，需要考虑的安全性以及复杂的生产工艺等问题；

本发明的工艺简单，只需要体外转录及脂质体包裹就能制备mRNA疫苗；

mRNA是一个通用性疫苗平台，可以根据毒株的年度或季节性变异选择新的抗原序列，在不改变工艺流程的情况下快速开发新的疫苗。

附图说明

图1A是本发明的mRNA-Spike质粒结构图谱，含有卡那霉素抗性基因(Kan)、T7启动子基因、nsp基因、Spike基因、 polyA基因；B是本发明的mRNA-HA质粒结构图谱，含有卡那霉素抗性基因(Kan)、T7启动子基因、nsp基因、HA基因、 polyA基因；C是本发明的mRNA-RBD-HA质粒结构图谱，含有卡那霉素抗性基因(Kan)、T7启动子基因、nsp基因、RBD 基因、HA基因、polyA基因；

图2是本发明的mRNA-Spike体外转录后的电泳结果图；A为mRNA-Spike体外转录后大小，B为mRNA-HA体外转录后大小，C为mRNA-RBD-HA体外转录后大小，M为RNA ladder；

图3是本发明通过Western检测，A是mRNA-Spike在体外转染BHK细胞后Spike蛋白表达图，B是mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗在体外转染BHK细胞后Spike和HA蛋白表达图，C是mRNA-RBD-HA在体外转染 BHK细胞后RBD和HA蛋白表达图；

图4是本发明通过ELISA检测，mRNA-Spike免疫小鼠后所诱导的Spike抗体滴度结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗一，包括：脂质体包裹的mRNA-Spike，脂质体包裹的mRNA-HA； mRNA根据α病毒家族的基因组设计而成；mRNA-Spike包含了新冠肺炎的刺突Spike蛋白基因，mRNA-HA包含了流感的血凝素Hemagglutinin蛋白基因。

基于α病毒家族的Spike高表达新冠mRNA疫苗，为mRNA-Spike。

基于α病毒家族的HA高表达流感mRNA疫苗，为mRNA-HA。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗二，包括：脂质体包裹的mRNA-RBD-HA；mRNA根据α病毒家族的基因组设计而成；mRNA-Spike包含了新冠肺炎的刺突Spike蛋白基因和流感的血凝素Hemagglutinin蛋白基因。

基于α病毒家族的Spike-RBD高表达新冠mRNA疫苗，为mRNA-RBD-HA。

作为一种实施例，α病毒家族的病毒包括：委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(TC83Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)，辛德毕斯病毒(Sin-dbis virus)、屈曲病毒(Chikungunya virus)、东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephali-tisvirus)、西方马脑脊髓炎病毒(Western equineencephalitis virus)、马雅鲁病毒(Mayarovirus)、生里基森林病毒(Semliki forest virus)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)等；作为一种优选，选用委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(TC83 Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)。需要说明的是：此处的α病毒家族的病毒并非穷举，只要是设计得到的mRNA 能够同时表达新冠肺炎的刺突Spike蛋白基因和血凝素Hemagglutinin蛋白基因的病毒都在本发明的保护范围内。

作为一种实施例，mRNA包括：常规mRNA或自复制mRNA。现有的mRNA疫苗平台技术有两个主要路线，一个是基于常规mRNA，另一个是基于自复制mRNA；这两个路线都可以应用于本发明。其中基于自复制mRNA疫苗在接种到动物体内后，能够以自身为模板复制出自身的序列，因此相比常规mRNA疫苗需要的接种剂量更少，并且自复制时所诱导的免疫反应形成的佐剂效应，能够诱导出更强的的免疫应答，进一步增强体液和细胞免疫反应；所以作为一种优选，选用自复制，自复制mRNA利用线性化的质粒DNA为模板，在体外进行酶转录反应合成。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法一，包括如下步骤：

步骤一，制备mRNA-Spike的步骤包括：

步骤a，合成Spike基因片段；

查询Spike氨基酸序列，然后根据人偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入启动子和ApaI 酶切位点(GGGCCC)，下游加入NotI酶切位点(GCGGCCGC)，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；

步骤b，构建TC-83自复制载体；

自复制mRNA是根据α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(TC83 VenezuelanEquine Encephalitis Virus，VEEV)的基因组进行设计的，其包含了可编码α病毒自复制组件的基因，但是缺乏编码用于制造具有传染性的α病毒颗粒的结构蛋白，并且构建到的质粒中做为模板来扩增，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示

步骤c，重组质粒JCXH-103的制备方法如下：

将上游携带ApaI、下游携带NotI的Spike基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒 JCXH-103(见图1)，基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；

步骤d，JCXH-103质粒用BspQI酶切线性化；

步骤e，线性化后JCXH-103质粒第一步使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，第二步使用Turbo DNase 酶对模板DNA进行降解，第三步使用加帽酶(Vacciniacapping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap0)加至转录的mRNA的5’端(见图2)。

步骤f，mRNA与脂类(组成包括1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(DMG-PEG2000)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以及阳离子脂类DLinDMA通过Nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mRNA包裹进入LNP内。mRNA-LNP复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

步骤二，制备mRNA-HA的步骤包括：

步骤A，合成Flu基因片段；

查询Flu氨基酸序列，然后根据人偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入启动子和ApaI酶切位点(GGGCCC)，下游加入NotI酶切位点(GCGGCCGC)，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；

步骤B，构建TC-83自复制载体；

步骤C，重组质粒JCXH-104的制备方法如下：

将上游携带ApaI、下游携带NotI的HA基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒JCXH-104 (见图1)，基因序列为序列表中SEQ ID NO.5所示；

步骤D，JCXH-104质粒用BspQI酶切线性化；

步骤E，线性化后JCXH-104质粒第一步使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，第二步使用Turbo DNase 酶对模板DNA进行降解，第三步使用加帽酶(Vacciniacapping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap0)加至转录的mRNA的5’端(见图2)。

步骤F，mRNA与脂类(组成包括1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(DMG-PEG2000)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以及阳离子脂类通过Nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mRNA包裹进入LNP内。mRNA-LNP复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

步骤三，将mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗；作为一种优选，mRNA-Spike制剂与mRNA-HA 制剂1:1摩尔比混合。

基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗的制备方法二，包括如下步骤：

步骤一，合成RBD-HA基因片段；

查询RBD-HA氨基酸序列，然后根据人偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入启动子和ApaI 酶切位点(GGGCCC)，下游加入NotI酶切位点(GCGGCCGC)，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中SEQ ID NO.6所示；

步骤二，构建TC-83自复制载体；

步骤三，重组质粒JCXH-105的制备方法如下：

将上游携带ApaI、下游携带NotI的RBD-HA基因插入TC-83复制载体的ApaI和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒 JCXH-105(见图1)，基因序列为序列表中SEQ ID NO.7所示；

步骤四，JCXH-105质粒用BspQI酶切线性化；

步骤五，线性化后JCXH-105质粒第一步使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，第二步使用Turbo DNase 酶对模板DNA进行降解，第三步使用加帽酶(Vacciniacapping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap0)加至转录的mRNA的5’端(见图2)。

步骤六，mRNA与脂类(组成包括1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(DMG-PEG2000)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以及阳离子脂类通过Nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mRNA包裹进入LNP内。mRNA-LNP复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

基于α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(TC83 Venezuelan EquineEncephalitis Virus，VEEV)的新冠流感HA高表达mRNA-Spike和mRNA-HA的应用方法采用疫苗的初免-加强给药应用方式；疫苗的初免-加强给药使用混合的mRNA-Spike， mRNA-HA疫苗或者mRNA-RBD-HA单独给药。

疫苗的给药方式为首次注射和至少两次加强注射，加强注射的次数根据患者需要确定。

需要说明的是：mRNA-Spike、mRNA-HA和mRNA-RBD-HA体外转录mRNA产物，且说明书已经详细描述了体外转录及脂质体包裹的全部过程，任何公司或个人，按照说明书上的步骤均能制备的体外转录脂质体包裹的mRNA疫苗。

以下用实验验证本发明的有益效果；

按照以下实施例制备mRNA疫苗。

实验一，

疫苗mRNA-Spike的制备及在细胞中表达情况验证实验；

1，Spike基因片段合成

从NCBI上查询Spike蛋白基因，然后根据人密码子进行相应优化，并在上游加入ApaⅠ酶切位点和启动子，下游加入NotⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-Spike的形式获得)，(序列如序列表序列1所示)。

2，构建TC-83自复制载体

3，重组质粒JCXH-103的制备方法如下，

pUC57-Spike和TC-83自复制载体用Apa和Not双酶切，酶切体系20μL：pUC57-Spike或TC-83自复制载体＜1μg，ApaI 1μL，NotI 1μL，10×CutSmart Buffer 2μL，ddH

分别取Spike基因片段与TC-83自复制载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，T4 Ligase 1μL，10×Ligase Buffer 5μL，ddH

PCR筛选：以煮沸法提取的细菌质粒为模板，扩增目的条带Spike，上游引物F：5’-TATGGCCATGACTACTCTAGCTA-3’，下游引物R：5’-GGGAAACGCCTGGTATCTTT-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃3min)×30 个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：Spike 片段约4300bp。

酶切验证：PCR筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以Apa和INot进I行酶切，将酶切混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。

测序验证：提取PCR及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。

4，JCXH-103质粒用BspQI酶切线性化及回收方法如下，

JCXH-103质粒10μg，BspQI 1μL，10×NEBuffer 3.1 5μL，ddH

5，线性化后JCXH-102质粒使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，TurboDNase酶对模板DNA进行降解，和加帽酶(Vaccinia capping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap 0)加至转录的 mRNA的5’端，具体方法如下。

10X Reaction Buffer 2μL，NTP每种0.5mM，线性化JCXH-102 1μg，T7 RNAPolymerase 2μL，补水至20μL，30 ℃反应1小时后加入，1μL TURBO

6，mRNA-Spike与脂类包裹步骤如下。

,mRNA与脂类(摩尔组成包括1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(DMG-PEG2000)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以及阳离子脂类，溶解在酒精内)通过Nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mRNA包裹进入LNP内。mRNA-LNP复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

7，Western blot检测mRNA-Spike在细胞中的表达情况。将购于上海细胞中心的BHK-21细胞传代培养，待细胞数量足够，胰酶消化至细胞培养6孔板每孔，铺板37℃CO2培养箱过夜。第二天将脂质体包裹的mRNA-Spike转染到铺好BHK-21 细胞中，培养72h后，将细胞裂解收集蛋白样品。具体方法：

1)细胞培养及铺板：将复苏好的BHK-21细胞接种在75cm2的培养瓶中，培养基为DMEM高糖培养基+5％的双抗+10％胎牛血清，待细胞在瓶底的汇集度达到80％以上，用胰酶将细胞消化下来，并计数。在6孔细胞培养板中铺入适宜数量的细胞，37℃CO2培养箱过夜。

2)脂质体mRNA转染BHK-21细胞：吸干铺好的6孔板中的培养基，用PBS缓冲液清洗一遍，将脂质体包裹的mRNA与1mL Opti-MEM培养基混合，加至清洗好的6孔板中，37℃CO2培养箱6h后补充1mL含有20％胎牛血清的DMEM高糖培养基。37℃CO2培养箱，培养72h。

3)蛋白样品的处理：在72小时后的BHK-21细胞中加入200μL细胞裂解液及1％的PMSF，冰上放置5分钟，离心机14000g离心5分钟，将上清转移至新的离心管，加入5×SDS 95℃金属浴12分钟。放在-20℃备用。

4)Western blot检测：

电泳：聚丙稀酰胺分离胶浓度为6％，蛋白上样量20μL，积层胶电泳条件150V，10min，分离胶电泳条件为200V， 30min。

电转：使用硝酸纤维素膜膜，在100V电压下转膜1小时。

封闭：使用1X PBST配制5％BSA作为封闭液，4℃封闭过夜。

一抗孵育：使用封闭液将SARA-Cov-2(2019-nCov)spike抗体以1：500进行稀释，在室温下孵育2小时。用1X PBST 洗3次，每次5分钟。

二抗孵育：使用封闭液稀释二抗，稀释比为1：10000，在室温下孵育1小时。用1XPBST洗3次，每次5分钟。

显影：显影液A液：B液＝1：1，在成像系统中进行显影。

实验结果见图片3A，3A是mRNA-Spike在体外转染BHK细胞后Spike蛋白表达图；

由图可知mRNA-Spike在体外转染BHK细胞后Spike蛋白表达情况较好。

8，mRNA-Spike免疫小鼠诱导的抗Spike抗体滴度检测

6～8周龄的BALB/c雌鼠适应性喂养3天后，2只为对照组注射PBS，4只为0.2μg组，2只为0.5μg组，5只为1μg 组，分别肌肉免疫mRNA-Spike疫苗，注射0.2μg，0.5μg和1μg剂量。35天后，再加强注射0.2μg，0.5μg和1μg剂量。 70天后，取血检测针对spike抗体滴度。

抗体滴度检测方法为ELISA具体操作如下，96孔酶标板每孔包被50ng Spike RBD结构域蛋白室温过夜，第二天用PBST 清洗3遍，用5％牛奶封闭，37度1小时后，PBST清洗3遍，加入对应稀释比例的小鼠血清，37度1小时后，PBST清洗 3遍，加入抗小鼠igg重链轻链HRP，37度1小时后，PBST清洗3遍，最后加入显色液显色。

实验结果如图4所示；为小鼠血清中抗Spike抗体滴度。

1#mock～2#mock表示不给疫苗也不造模的空白对照组；1#0.5μg～2#0.5μg分别表示给药剂量为0.5μg的5只小鼠；1#0.2 μg～4#0.2μg分别表示给药剂量为0.2μg的4只小鼠；1#1.0μg～5#1.0μg分别表示给药剂量为1.0μg的5只小鼠。

由此可知mRNA-Spike能够很好的实现在细胞中表达。

实验二：

疫苗mRNA-HA的制备及在细胞中表达情况验证实验

1，HA基因片段合成

从NCBI上查询流感HA蛋白基因，然后根据人密码子进行相应优化，并在上游加入ApaⅠ酶切位点，下游加入NotⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-HA的形式获得)，(序列如序列表序列4所示)。

2，构建TC-83自复制载体

同实施例1-2

3，重组质粒JCXH-104的制备方法如下

此步同实施例1-3，其中Spike换为HA，酶切长度为825bp，PCR筛选片段大小为1228bp。

4，JCXH-104质粒用BspQI酶切线性化及回收方法如下

此步同实施例1-4，其中JCXH-103换为JCXH-104。

5，线性化后JCXH-104质粒使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，TurboDNase酶对模板DNA进行降解，和加帽酶(Vaccinia capping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap 0)加至转录的 mRNA的5’端，具体方法如下。

同实施例1-5，其中JCXH-103换为JCXH-104。

6，mRNA-HA与脂类包裹步骤如下。

此步同实施例1-6，其中Spike换为HA。

7，Western blot检测mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗在细胞中的表达情况。

此步同实施例1-7。一抗为抗HA抗体或抗SARA-Cov-2(2019-nCov)spike抗体。

实验结果如图3B所示，B是mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗在体外转染BHK细胞后Spike和 HA蛋白表达图；

由图3B可知mRNA-Spike制剂与mRNA-HA制剂混合得到联合疫苗在细胞中具有很好的表达。

实验三：疫苗mRNA-RBD-HA的制备及在细胞中表达情况验证实验

1，Spike-RBD-HA基因片段合成

从NCBI上查询流感Spike-RBD-HA蛋白基因，然后根据人密码子进行相应优化，并在上游加入ApaⅠ酶切位点，下游加入NotⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-Spike-RBD-HA的形式获得)，(序列如序列表序列6所示)。

2，构建TC-83自复制载体

同实施例1-2

3，重组质粒JCXH-105的制备方法如下

此步同实施例1-3，其中Spike换为RBD-HA，酶切长度为2642bp，PCR筛选片段大小为3045bp。

4，JCXH-105质粒用BspQI酶切线性化及回收方法如下

此步同实施例1-4，其中JCXH-103换为JCXH-105。

5，线性化后JCXH-105质粒使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，TurboDNase酶对模板DNA进行降解，和加帽酶(Vaccinia capping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap 0)加至转录的 mRNA的5’端，具体方法如下。

同实施例1-5，其中JCXH-103换为JCXH-105。

6，mRNA-HA与脂类包裹步骤如下。

此步同实施例1-6，其中Spike换为RBD-HA。

7，Western blot检测mRNA在细胞中的表达情况。

此步同实施例1-7。其中Spike换为RBD-HA，一抗为抗HA抗体或抗SARA-Cov-2(2019-nCov)spike抗体。

实验结果如图3C所示，C是mRNA-RBD-HA在体外转染BHK细胞后RBD和HA蛋白表达图；

由图可知mRNA-RBD-HA在体外转染BHK细胞后RBD和HA蛋白具有很好的表达情况。

从实验一到三可知，运用本发明的方法得到的联合疫苗能够很好的细胞中表达，能够与单独使用单种病毒疫苗的效果基本持平。

本发明通过使用一条mRNA能够同时表达冠状病毒和流感病毒的抗原，具有强免疫原性，既能减轻病人痛苦，又能够达到注射单种病毒疫苗的免疫效果，具有良好的应用前景。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 嘉晨西海（杭州）生物技术有限公司

<120> 一种基于mRNA的针对冠状病毒和流感病毒的联合疫苗及其制备方法

<141> 2020-10-26

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3894

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctataactct ctacggctaa cctgaatgga ctacgacata gtctagtccg ccaagatgtt 60

cgtgttcctc gtgctgctgc ccctggtgtc tagccagtgc gtgaacctga ccaccagaac 120

ccagctgcct ccagcctaca ccaacagctt caccagggga gtgtactacc ccgacaaggt 180

gttccggagc agcgtgctgc atagcaccca ggacctgttc ctgcccttct tcagcaacgt 240

gacttggttc cacgccatcc acgtcagcgg aaccaacggc accaagcgct ttgacaaccc 300

agtgctgccc ttcaacgacg gagtgtactt cgccagcacc gagaagtcca acatcatccg 360

gggttggatc ttcggcacca cactggacag caagacccag agcctgctga tcgtgaacaa 420

cgccaccaac gtcgtgatca aggtctgcga gttccagttt tgcaacgacc ccttcctggg 480

cgtgtactac cacaagaaca acaagtcttg gatggagagc gagttccggg tgtacagcag 540

cgccaacaat tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcccttc ctgatggacc tggaaggcaa 600

gcagggcaac ttcaagaacc tgcgggagtt cgtgttcaag aacatcgacg gctacttcaa 660

gatctacagc aagcacaccc ccatcaacct cgtgagagac ctgccacagg gcttcagcgc 720

tctggaacct ctggtggatc tgccaatcgg catcaacatc acccggttcc agaccctgct 780

ggctctgcac agaagctacc tgaccccagg cgattcttct agcggctgga cagcaggagc 840

cgccgcttat tacgtgggct atctgcagcc ccggaccttc ctgctgaagt acaacgagaa 900

cggcaccatc accgacgcag tggattgcgc tctggatcct ctgagcgaga ccaagtgcac 960

cctgaagtcc ttcaccgtgg agaagggcat ctaccagacc agcaacttcc gggtgcagcc 1020

tacagagagc atcgtgcggt tccctaacat caccaacctc tgccccttcg gcgaggtgtt 1080

caacgccacc agattcgcca gcgtctacgc ctggaaccgg aagcggatca gcaattgcgt 1140

ggccgactac agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt 1200

gtcccctacc aagctgaacg atctgtgctt caccaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat 1260

caggggcgac gaagtgcgac agatcgcccc aggacagaca ggaaagatcg ccgattacaa 1320

ctacaagctg cccgacgact tcaccggttg cgtgatcgct tggaacagca acaacctgga 1380

cagcaaggtc ggcggcaact acaactacct gtaccggctg ttccggaagt ccaacctgaa 1440

gcccttcgag cgggacatca gcacagagat ctaccaggcc ggcagcacac cttgtaacgg 1500

cgtggagggc ttcaactgct acttccctct gcagagctac ggcttccagc ctacaaacgg 1560

cgtgggatac cagccttaca gggtggtggt gctgagcttc gaactgctgc acgctccagc 1620

caccgtctgc ggacctaaaa agagcaccaa cctggtgaag aacaagtgcg tgaatttcaa 1680

cttcaacggc ctgaccggaa ccggcgtgct gaccgagagc aacaagaagt tcctgccctt 1740

ccagcagttc ggcagagaca tcgcagacac cacagacgcc gtgagagatc ctcagaccct 1800

ggagatcctg gacatcaccc cttgcagctt tggcggagtg tccgtgatca ccccaggaac 1860

caacaccagc aatcaggtgg ccgtgctgta ccaggacgtg aattgcaccg aggtgccagt 1920

ggccattcac gcagatcagc tgacccctac ctggagagtg tacagcaccg gaagcaacgt 1980

gttccagacc agggcaggtt gcctgatcgg agccgagcac gtgaacaaca gctacgagtg 2040

cgatatccct atcggcgccg gcatttgcgc ctcttaccag acccagacca acagccctag 2100

gagagccaga agcgtggcct ctcagagcat catcgcctac accatgagcc tgggagccga 2160

gaacagcgtg gcctacagca acaacagcat cgccatcccc accaacttca ccatcagcgt 2220

gaccaccgag attctgcccg tgtctatgac caagaccagc gtcgactgca ccatgtacat 2280

ctgcggcgac agcaccgagt gctctaacct gctgctgcag tacggctcct tttgcaccca 2340

gctgaacagg gctctgacag gcatcgcagt ggagcaggac aagaacaccc aggaggtctt 2400

cgcccaggtc aagcagatct acaagacccc ccctatcaag gacttcggcg gctttaactt 2460

cagccagatc ctgcccgatc ccagcaagcc tagcaagcgg agcttcatcg aggacctgct 2520

gttcaacaag gtcaccctgg ccgacgcagg cttcatcaag cagtacggcg attgcctggg 2580

cgacattgcc gccagagacc tgatttgcgc ccagaagttc aacggcctga cagtgctgcc 2640

tcctctgctg accgacgaga tgatcgccca gtatacaagc gctctgctgg caggaaccat 2700

caccagcggt tggacctttg gagccggagc cgctctgcag atcccttttg ccatgcagat 2760

ggcctaccgc ttcaacggaa tcggcgtgac ccagaacgtg ctctacgaga accagaagct 2820

gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag gacagcctga gcagcacagc 2880

tagcgctctg ggcaagctgc aggatgtggt gaaccagaac gcccaggctc tgaacaccct 2940

ggtgaagcag ctgagcagca acttcggagc catcagcagc gtgctgaacg acatcctgag 3000

caggctggac aaggtggaag ccgaagtgca gatcgacagg ctgatcaccg gcagactgca 3060

gtctctgcag acctacgtga cccagcagct gatcagagcc gccgagatca gagctagcgc 3120

taatctggcc gccaccaaga tgagcgagtg cgtgctggga cagagcaaga gagtggactt 3180

ctgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt tcctcagagc gctcctcacg gagtggtgtt 3240

tctgcacgtg acctacgtgc cagcccagga gaagaacttc accacagccc cagccatttg 3300

ccacgacgga aaggcccact tccccagaga aggcgtgttc gtgtccaacg gcacccattg 3360

gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt 3420

gagcggcaat tgcgacgtgg tcatcggcat cgtgaacaac accgtgtacg accccctgca 3480

gccagagctg gactccttca aggaggagct ggacaagtac ttcaagaacc acaccagccc 3540

agacgtggac ctgggagata tcagcggcat caacgccagc gtggtgaaca tccagaagga 3600

gatcgacagg ctgaacgagg tggccaagaa cctgaacgag agcctgatcg acctgcagga 3660

gctgggcaag tacgagcagt acatcaagtg gccttggtac atttggctgg gcttcatcgc 3720

cggcctgatc gcaatcgtca tggtgaccat catgctctgt tgcatgacca gttgctgcag 3780

ctgcctgaag ggttgctgca gttgcgggag ttgctgcaag ttcgacgagg acgacagcga 3840

gccagtgctg aaaggcgtga agctgcacta cacatgataa ggcgcgccca ccca 3894

<210> 2

<211> 9636

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840

gcatcattgg tgctatagcg cggctgttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960

acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740

tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa 7560

gtaaggcgcg cccacccagc ggccgcatac agcagcaatt ggcaagctgc ttacatagaa 7620

ctcgcggcga ttggcatgcc gccttaaaat ttttatttta tttttctttt cttttccgaa 7680

tcggattttg tttttaatat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7740

aaaagaagag ctagggataa cagggtaatt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 7800

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 7860

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 7920

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 7980

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 8040

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 8100

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 8160

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 8220

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 8280

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 8340

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 8400

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 8460

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 8520

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 8580

acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat 8640

caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt 8700

tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac 8760

aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga 8820

cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag 8880

gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg 8940

attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa 9000

tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag 9060

gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg agtaaccatg 9120

catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc 9180

agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca 9240

gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc 9300

cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc 9360

gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt tttcaatatt 9420

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 9480

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 9540

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 9600

tagggataac agggtaatta atacgactca ctatag 9636

<210> 3

<211> 13458

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3