一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用

技术领域

本发明属于抗体筛选技术领域，尤其涉及一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用。

背景技术

单克隆抗体药物具有较高的靶向性，可以直达病变细胞，能够减少正常细胞受损，减少副作用，因此广泛用于临床。新的单克隆抗体药物的研发主要是通过重组抗体的方式在体外进行抗体文库的构建及筛选。在重组抗体的应用中，常见的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体/mRNA展示技术、酵母表面展示技术等，其中大部分的展示技术都是基于原核表达系统，由于原核表达系统中，表达蛋白过程选择的密码子与真核细胞不同，故用原核表达系统筛选获得的抗体可能无法在体内获得高表达，并且原核表达系统糖基化等翻译后修饰过程与人体表达存在区别，不能很好的应用。

采用哺乳动物细胞表面展示技术可以克服不同宿主，尤其是克服噬菌体展示过程中，糖基化等翻译后修饰过程与人体表达的区别。通过哺乳动物细胞尤其是人源细胞直接进行抗体展示不仅可以快速筛选大容量的抗体文库，而且无翻译后修饰的问题，容易快速进入下一步的表达和生产。

然而，现有的哺乳动物展示常用PDGFR等跨膜蛋白的跨膜区域和抗体分子形成融合蛋白的结构。经过流式细胞术筛选表达抗体的细胞时，只能获得跨膜表达抗体分子的候选细胞。为了进一步检测抗体的活力及亲和力，还需要重新进行测序和分子克隆，制备分泌型的抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒、细胞系及应用；所述展示质粒可以在哺乳动物细胞中展示蛋白结构，用于筛选功能性抗体或者具有亲和力的蛋白。间皮素融合表达后的蛋白还可以分泌表达，既可以通过流式细胞术筛选膜上型表达蛋白，又可以通过ELISA等液相检测技术筛选分泌蛋白；本发明提供的展示质粒具有膜上表达和分泌表达双功能，大大加速了蛋白的筛选速度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了间皮素在哺乳动物融合蛋白展示中的应用，将所述间皮素与待筛选蛋白在哺乳动物细胞中融合表达。

本发明提供了一种用于哺乳动物细胞展示的融合蛋白，包括顺次连接的信号肽、所述的待筛选蛋白和间皮素。

优选的，所述间皮素的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了编码所述融合蛋白的融合基因，包括编码信号肽的基因、编码待筛选蛋白的基因和编码间皮素的基因。

优选的，所述编码信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述编码间皮素的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

本发明提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒，包括所述融合基因和初始质粒。

优选的，所述初始质粒为pcDNA-FRT质粒，所述融合基因重组至所述pcDNA-FRT质粒的NheI酶切位点和NotI酶切位点之间。

本发明提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示细胞系，将所述哺乳动物融合蛋白展示质粒转入哺乳动物抗体展示细胞获得。

本发明提供了所述的融合蛋白、所述的融合基因、所述的哺乳动物融合蛋白展示质粒、所述的哺乳动物融合蛋白展示细胞系在药物筛选中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒，利用间皮素融合蛋白即可膜上表达又可分泌表达的特性，实现待筛选蛋白在哺乳动物细胞的展示，能够大大提高待筛选蛋白的筛选效率；待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白表达效率更高，并且间皮素有直标抗体，能够辅助指示筛选结果。本发明提供的待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白不仅能够通过哺乳动物细胞展示技术进行文库筛选，还有部分能够分泌表达，能够通过收集细胞培养上清进一步进行Western Blot或者ELISA实验筛选抗体的活力及亲和力。

附图说明

图1为单克隆细胞的单点整合效率(Lac基因)的qPCR检测结果，对应表格数据见表1；

图2为单克隆细胞表达β-半乳糖苷酶的检测结果；

图3为K562-PB-FRT单克隆细胞转染48h后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；

图4为K562-PB-FRT单克隆细胞转染15d后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；

图5为实施例1中基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒的结构图谱；

图6为K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞表达MSLN蛋白和4D5抗体的流式分析检测结果；

图7为实施例3中YH抗体库的构建结果；

图8为实施例4中S-RBD抗体库的构建结果，其中A为Frist PCR 710～713样本轻链的PCR结果；B为FristPCR 710-713样本重链的PCR结果；C为710～713样本SOE-PCR产物的酶切结果；D为MSLN in pcDNA5载体酶切结果；

图9为K562-PB-FRT-39-YH-MSLN-pcDNA5抗体库细胞电转48h流式分析结果；

图10为K562-PB-FRT-39-YH-MSLN-pcDNA5抗体库细胞电转72h流式分选结果；

图11为K562-PB-FRT-39-YH-MSLN-pcDNA5抗体库细胞cDNA的PCR扩增结果；

图12为K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞表达胞外蛋白检测结果。

具体实施方式

本发明提供了间皮素在哺乳动物融合蛋白展示中的应用，将所述间皮素与待筛选蛋白在哺乳动物细胞中融合表达。

在本发明中，所述间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种细胞表面糖蛋白，是早期胰腺癌的生物标识，发现于血液和尿液中。研究发现，在间皮素合成过程中，开始先合成69kD前体，然后经酶解得到30kD的N端分泌型和40kD的GPI连接膜结合型。将所述间皮素与待筛选蛋白在哺乳动物细胞中融合表达，能够同时实现待筛选蛋白的膜上表达和分泌表达；大大提高了待筛选蛋白的筛选效率，并且简化了筛选步骤。

本发明提供了一种用于哺乳动物细胞展示的融合蛋白，包括顺次连接的信号肽、所述的待筛选蛋白和间皮素。在本发明中，所述间皮素的氨基酸序列优选的如SEQ ID No.3所示；所述信号肽的氨基酸序列优选的如SEQ IDNo.1所示。本发明对所述待筛选蛋白的序列没有特殊限定，任何类型的待筛选蛋白均可，所述待筛选蛋白可选为单链抗体，例如人全血细胞单链抗体、鼠细胞单链抗体；在本发明具体实施过程中，以4D5ScFv为例进行说明，所述4D5ScFv的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了编码所述融合蛋白的融合基因，包括编码信号肽的基因、编码待筛选蛋白的基因和编码间皮素的基因。在本发明中，所述编码信号肽的基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.4所示，所述编码间皮素的基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.6所示。在本发明中，以4D5ScFv为待筛选蛋白时，编码4D5ScFv的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明对所述融合基因的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可。

本发明提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒，包括所述融合基因和初始质粒。在本发明中，所述初始质粒优选为pcDNA-FRT质粒，所述pcDNA-FRT质粒优选的购自ThermoFisher，货号为V601020。在本发明中，所述融合基因优选的重组至所述pcDNA-FRT质粒的NheI酶切位点和NotI酶切位点之间。在本发明具体实施过程中，优选的在所述融合基因的两端连接NheI酶切位点和NotI酶切位点，以利于后续实验操作。在本发明中，当以4D5ScFv为待筛选蛋白时，所述哺乳动物融合蛋白展示质粒的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。在本发明中，所述哺乳动物融合蛋白展示质粒的制备方法优选的包括以下步骤：人工合成所述融合基因，将所述融合基因和初始质粒分别进行双酶切后连接获得。在本发明中，所述双酶切优选的采用NheI酶和NotI酶进行，本发明对所述双酶切和连接的方法和步骤没有特殊限定，采用本领域常规的双酶切和连接的方法即可。在本发明中，所述哺乳动物融合蛋白展示质粒亦可通过人工合成的方法直接合成。

本发明提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示细胞系，将所述哺乳动物融合蛋白展示质粒转入哺乳动物抗体展示细胞获得。在本发明中，所述哺乳动物抗体展示细胞及其制备方法记载与中国专利CN202011525205.3中，具体制备方法见实施例记载。本发明中，所述转入的方法优选为电转，本发明对所述电转的具体条件和参数没有特殊限定，采用本领域常规的电转方法即可。

本发明还提供了所述的融合蛋白、所述的融合基因、所述的哺乳动物融合蛋白展示质粒、所述的哺乳动物融合蛋白展示细胞系在药物筛选中的应用。在本发明中，优选的利用所述融合基因进行哺乳动物融合蛋白的展示，构建哺乳动物抗体基因文库，实现抗体药物的筛选。本发明对所述抗体药物的具体筛选方法没有特殊限定，采用本领域常规的抗体药物筛选方法即可。在本发明具体实施过程中，构建的抗体基因文库以人ScFv抗体文库和鼠ScFv抗体文库为例说明。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

哺乳动物抗体展示细胞K562-PB-FRT-39单克隆细胞的制备

实验材料

1.细胞：K562细胞

2.培养基：IMDM完全培养基、1640完全培养基

3.质粒：PB-FRT-LacZeo质粒(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)

4.试剂：Galacto-Star

实验方法

双质粒共转：

取1×10

药物筛选：

培养48h后，将K562-PB-FRT-LacZeo细胞400g离心5min收集细胞沉淀，用5ml的新鲜的IMDM完全培养基重悬K562-PB-FRT-LacZeo细胞沉淀，取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数，然后补加新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞密度为3×10

单克隆化：

准备10块圆底96孔板，将新鲜的IMDM完全培养基按照150μl/孔的体积加入到圆底96孔板，然后取5×10

单克隆细胞在含5％CO

分子生物学鉴定：

单克隆细胞扩大培养后，每个单克隆各取3×10

插入基因的功能验证：

由于展示细胞构建载体PB-FRT-LacZeo含有β-半乳糖苷酶标签。因此5个单克隆细胞各取1×10

实验结果：

筛选获得的K562-PB-FRT单克隆细胞为第39、58、76、86、105次挑选的产物，因此命名为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-39mono。

如图1所示，K562-PB-FRT-LacZeo单克隆细胞的qPCR检测结果显示：5个单克隆细胞PB-FRT-LacZeo质粒单点整合率由高到低依次为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-39mono。

表1 K562-PB-FRT-LacZeo单克隆细胞的qPCR检测结果数据

检测K562-PB-FRT-LacZeo的5个单克隆细胞的β-半乳糖苷酶表达结果(图2)表明：与K562对照组相比，以上5个单克隆均可表达β-半乳糖苷酶。由于与一对等位基因的内参基因比较，K562-PB-FRT-LacZeo-86mono单克隆细胞Lac基因相对拷贝数RQ高于0.5，且β-半乳糖苷酶表达量为最高，因此认为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono克隆是单点整合细胞的可能性最低，予以淘汰。

进而，保留余下4个K562-PB-FRT-LacZeo：K562-PB-FRT-LacZeo-39mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono四个单克隆细胞系，进行单个FRT整合位点的功能鉴定。

单个FRT整合位点的功能鉴定利用K562-PB-FRT宿主细胞展示双荧光蛋白质粒混合库进行。

实验材料

1.细胞：

K562-PB-FRT-39mono、K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono

2.质粒：

采用全基因合成技术，合成红色荧光蛋白mScarlet和蓝色荧光蛋白mtagBFP2基因分别通过上游NheI和下游NotI构建到pcDNA5-FRT(购自赛默飞生物科技有限公司)，并进行无内毒素的大提制备(委托金唯智生物科技有限公司完成)。得到mScarlet inpcDNA5-FRT和mtagBFP2 in pcDNA5-FRT

mScarlet(带红色荧光，SEQ ID No.9)

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mtagBFP2(带蓝色荧光，SEQ ID No.10)

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3.培养基：

IMDM培养基、1640培养基

实验方法：

1.将上述获得的4个K562-PB-FRT单克隆细胞扩增培养至细胞数大于1×10

2.用120μl的1640培养基(无FBS、无双抗)分别重悬每个单克隆细胞，每个单克隆细胞均加入2.2μg的mScarlet in pcDNA5-FRT质粒、4.4μg的mtagBFP2 in pcDNA5-FRT质粒和13.3μg的pOG44质粒(Thermofisher品牌辅助质粒，货号V600520表达Flp重组酶。mScarlet：mTag BFP2：pOG44三种质粒质量比为1：2：6，设置电转参数为：560V、30ms，电转结束后立即用5ml的IMDM完全培养基重悬电击后的细胞后加入到T25培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO

3.电转48h后，每个克隆细胞各取1×10

4.药物筛选15天后，每个克隆细胞各取1×10

如图3所示：K562-PB-FRT-39mono、K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono等4个单克隆细胞电转mScarlet in pcDNA5-FRT和mtagBFP2 inpcDNA5-FRT质粒48h后，均可以有效的表达mScarlet和mTag BFP2。流式细胞术图表现为两种荧光蛋白同时表达，为瞬时转染后两种质粒同时进入细胞的标志。

经过潮霉素药物筛选15天后，细胞中质粒已消耗殆尽，宿主细胞仅表达由pcDNA5-FRT引入的基因。如果宿主细胞只有一个FRT整合位点，则只能在流式细胞术上表现为单阳性群。也就是说只有蓝色荧光或者红色荧光，而双阳性区域(右上象限)应无明显细胞群。

潮霉素药物筛选15天后的细胞流式结果如图4所示，4个单克隆细胞均出现了明显的分群，其中K562-PB-FRT-39mono细胞分群效果最佳。K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono三个单克隆在双阳区有极少数细胞存在，可以证明以上4个单克隆细胞均成功具备了Flp-In整合系统，且只存在单个FRT整合位点。

实施例2

通过已知功能的抗体片段4D5，利用哺乳动物展示细胞系K562-PB-FRT-39(即K562-PB-FRT-39mono)，构建基于MSLN锚定的哺乳动物融合蛋白展示细胞，检测基于MSLN的抗体展示功能。

实验材料

1.细胞：K562-PB-FRT-39单克隆细胞

2.培养基：IMDM完全培养基、1640完全培养基

3.展示质粒：4D5 inpcDNA5-FRT-MSLN(核苷酸序列如SEQ ID No.7，委托生物技术公司构建)

pOG44质粒(Thermo Fisher，货号V600520)

4.流式抗体：

Rb mAb to Mesothelin(Abcam公司，PE荧光素偶联，货号ab252136)

Biotinylated Human Her2(ACRO公司，货号HE2-H82E2)

PE-Streptavidin(Biolegend公司，货号405203)。

实验方法

1.取1×10

2.用120μl的1640培养基(无FBS、无双抗)细胞，加入4μg的4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒和16μg的pOG44质粒(4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN：pOG44＝1:4)，用移液器将细胞与质粒充分混匀，然后将其缓慢加入到120μl电击管中，避免产生气泡，设置电转参数为：560V、30ms。注意电击前后分别冰浴5min。冰浴结束后立即将电击后的细胞用10ml的IMDM完全培养基重悬，然后加入到T25培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO

3.电转48h后，分别取2×10

电转48h后，K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞补加新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞培养密度为3×10

4.药筛10天后，将K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN抗体库细胞和未电转的K563-FRT-B11细胞再次分别取1×10

实验结果如图6所示，K562-PB-FRT-39单克隆细胞在转染sifi-4D5-MSLN质粒48h后MSLN蛋白的表达效率为3.63％，4D5抗体的表达效率为7.92％。经过潮霉素药物筛选10天后，K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞中MSLN蛋白的表达量明显增加，MSLN蛋白的表达效率提高到了90.8％，4D5抗体的表达效率提高到75.9％。结果表明：K562-PB-FRT-39细胞可以成功表达MSLN蛋白和4D5抗体，证明K562-PB-FRT-39展示4D5抗体成功。

实施例3

人类ScFv抗体文库的构建

实验材料

1.细胞：K562-PB-FRT-39-细胞、YH全血细胞(来自健康志愿者的外周血)。

2.试剂盒：

TRIzol(Thermo 15596026)

SuperScript

Primer

Kodaq 2XPCR Master Mix(abm G497)

Bestaq

Gel Extraction Kit(OMAGA D2500-03)

琼脂糖(invitrogen 75510-019)

动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(庄盟生物ZP404)

大量DNA产物纯化试剂盒(天根DP205)

SfiⅠ(NEB#R0123L)

T4连接酶(NEB#M0202S)

DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司DL1001)

DH10B感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司DE1072)

超薄DNA产物纯化试剂盒(天根DP203)

EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN 12362)

3.仪器

PCR仪(BIO-RAD T100)

电泳仪(BIO-RAD POWERPAC HC)

凝胶成像仪(BIO-RAD Universal HoodⅡ)

高速台式离心机(Gene 1730R)

离心机(eppendorf Minispin PLUS)

水浴锅(上海博讯HHS-11-2)

酶标仪(Thermo 1510)

金属浴

4.引物序列，参见已发表文献(Generation of Human scFv AntibodyLibraries:PCR Amplification and Assembly of Light-and Heavy-Chain CodingSequences.Cold Spring Harb Protoc.2011 Sep 1；2011(9))

实验方法

1.RNA提取

(1)从人体内抽取10ml的外周血，加入10ml的TRIzol(使核蛋白体解离，释放出RNA)，混匀冰上裂解5min。

(2)加入2ml氯仿，盖紧盖子置于涡旋震荡仪上剧烈震荡15s，冰上静置5～10min(出现分层现象即可离心)。

(3)将离心机提前预冷到4℃然后12000rpm离心15min，离心结束后，离心管内的溶液会分成3相，由上至下依次是：RNA相、DNA相及有机相。

(4)将上层的RNA相转移至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇(4℃预冷)，上下颠倒混合后，冰上静置5min，12000rpm离心10min后弃上清。

(5)加入1ml用RNase Free的ddH

(6)加入15～30μL RNase Free的ddH

2.反转录cDNA

按照SuperScript

(1)按照以下体系配置RNA Primer，并进行预退火

(2)65℃，孵育5min，冰上1min；

(3)cDNA Synthesis Mix，体系如下：

(4)将cDNA Synthesis Mix加到每个RNA Primer体系中，混匀，离心收集；

(5)PCR程序如下：

(6)将反应产物置于冰上一段时间，短暂离心，得到YH样本的cDNA溶液。

3.第一PCR

所涉及的引物序列来自已发表文献(Generation of Human scFv AntibodyLibraries:PCR Amplification and Assembly of Light-and Heavy-Chain CodingSequences)。具体用到的引物名称见表1。

表1引物序列名称

用无核酸酶的水将以上表格中引物的使用浓度均配制为10μm，然后在按照下面表格中顺序将引物进行配对，再根据Kodaq 2×PCR Master Mix的说明书依次加入相应试剂配制PCR反应体系。

表2人类ScFv抗体文库引物配对方案(重链)

表3人类ScFv抗体文库引物配对方案(轻链)

(1)PCR体系：

(2)PCR扩增条件：

(3)PCR产物—沉淀

分别合并重链和轻链的PCR产物，再加1/10体积的3M乙酸钠和2.5倍体积的95％乙醇，充分混匀，冰上静置15min，14,000×g，4℃离心10min，弃上清。用75％的乙醇洗涤一次，用50μl ddH

(4)根据Gel Extraction Kit(OMAGA)试剂盒提供的方法对上述DNA溶液进行胶回收。

4.第二PCR

(1)PCR-like：

以第一PCR胶回收得到的VH、VL做模板，配置以下体系，进行PCR-like：

VH PCR Product 5μl(10ng/μl)

VL PCR Product 5μl(10ng/μl)

Kodaq 2×Master Mix 10μl

PCR-like反应程序如下：

(2)将上述PCR-like产物稀释100倍(20/2000)作为模板，RSC-F(sense)和RSC-B(reverse)为引物，按照Kodaq 2×PCR Master Mix的说明书依次加入相应试剂配制以下PCR反应体系：

(3)PCR扩增条件：

(4)根据大量DNA产物纯化试剂盒(天根)提供的方法纯化PCR产物。

5.酶切

(1)SOE-PCR产物酶切：

根据Sfi1(NEB)的说明书配置酶切体系，对SOE-PCR产物进行酶切。

酶切体系如下：

50℃，过夜酶切

(2)质粒载体酶切

根据Sfi1(NEB)的说明书配置酶切体系，对4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN载体进行酶切。

酶切体系如下：

50℃，过夜酶切

(3)酶切产物琼脂糖凝胶电泳后将目的条带切下来，然后根据Gel ExtractionKit(OMAGA)提供的方法进行胶回收。

(4)酶连：将YH样本的酶切产物和4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN载体的酶切产物参考T4连接酶(ABclonal)说明书，配置以下连接体系，16℃过夜连接获得YH-pcDNA5-FRT-MSLN连接产物。

6.连接产物转化

(1)连接产物转化——化转

按照DH5α感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)的说明书对T4连接产物进行转化。

(2)连接产物转化——纯化连接产物

为确保连接效率先对YH-pcDNA5-FRT-MSLN连接产物进行纯化，按照超薄DNA产物纯化试剂盒(天根)提供的方法进行DNA纯化。

(3)连接产物转化——电转

按照DH10B-Plus感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)的说明书对T4连接纯化产物进行转化。

(4)大量摇取菌液

将电转剩余菌液转移至200ml AMP抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm，过夜摇菌。

(5)质粒大提

按照EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)试剂盒说明书进行质粒大提。

实验结果

如图7所示，先通过普通PCR扩增YH样本的重链和轻链(约400bp)，再采用SOE-PCR连接YH样本重链和轻链(约800bp)，然后将YH样本重链和轻链合并的SOE-PCR产物和4D5 inpcDNA5-FRT-MSLN载体均进行酶切，最后通过T4连接酶将YH样本的重链和轻链与MSLN inpcDNA5载体连接，根据图中条带能够确认YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库构建成功。

实施例4

通过PCR技术扩增和组装鼠脾细胞中轻链和重链编码序列构建鼠ScFv抗体文库。

实验材料

1.动物：710小鼠、711小鼠、712小鼠、713小鼠；所有小鼠都进行S-RBD抗原免疫，使小鼠体内产生针对S-RBD抗原的天然抗体，来自北京维通利华实验动物技术有限公司，品系是BALA/c。

2.试剂盒：

TRIzol(Thermo 15596026)

SuperScript

Primer

Kodaq 2X PCR Master Mix(abm G497)

Bestaq

Gel Extraction Kit(OMAGA D2500-03)

琼脂糖(invitrogen 75510-019)

动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(庄盟生物ZP404)

大量DNA产物纯化试剂盒(天根DP205)

SfiⅠ(NEB#R0123L)

T4连接酶(NEB#M0202S)

DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司DL1001)

DH10B感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司DE1072)

超薄DNA产物纯化试剂盒(天根DP203)

EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN 12362)

3.仪器：

PCR仪(BIO-RAD T100)

电泳仪(BIO-RAD POWERPAC HC)

凝胶成像仪(BIO-RAD Universal HoodⅡ)

高速台式离心机(Gene 1730R)

离心机(eppendorf Minispin PLUS)

水浴锅(上海博讯HHS-11-2)

酶标仪(Thermo 1510)

金属浴

4.引物序列：

VL-for-k1 catggcggactacaaagacawtgttctcacccagtc(SEQ ID No.11)

VL-for-k2 catggcggactacaaagacatccagatgacacagwc(SEQ ID No.12)

VL-for-k3 catggcggactacaaagatrttgtgatgacccagwc(SEQ ID No.13)

VL-for-k4 catggcggactacaaagacattstgmtgacccagtc(SEQ ID No.14)

VL-for-k5 catggcggactacaaagatgttgtgvtgacccaaac(SEQ ID No.15)

VL-for-k6 catggcggactacaaagacacaactgtgacccagtc(SEQ ID No.16)

VL-for-k7 catggcggactacaaagayattktgctcactcagtc(SEQ ID No.17)

VL-for-k8 catggcggactacaaagatattgtgatracccaggm(SEQ ID No.18)

VL-for-k9 catggcggactacaaagacattgtaatgacccaatc(SEQ ID No.19)

VL-for-k10 catggcggactacaaagacattgtgatgwcacagtc(SEQ ID No.20)

VL-for-k11 catggcggactacaaagatrtccagatgamccagtc(SEQ ID No.21)

VL-for-k12 catggcggactacaaagatggagaaacaacacaggc(SEQ ID No.22)

VL-revK1 ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccgcgtttbatttccagcttgg(SEQ ID No.23)

VL-revK2 ggagccgccgccgccagaaccaccaccacagaaccaccaccaccgcgttttatttccaattttg(SEQ ID No.24)

VH-for-1 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggttcdsctgcaacagty(SEQ IDNo.25)

VH-for-2 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtgcaamtgmagsagtc(SEQ IDNo.26)

VH-for-3 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgavgtgmwgctggtggagtc(SEQ IDNo.27)

VH-for-4 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggttaytctgaaagagtc(SEQ IDNo.28)

VH-for-5 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgakgtgcagcttcagsagtc(SEQ IDNo.29)

VH-for-6 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccagatccagttsgygcagtc(SEQ IDNo.30)

VH-for-7 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccagrtccaactgcagcagyc(SEQ IDNo.31)

VH-for-8 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgmagctasttgagwc(SEQ IDNo.32)

VH-for-9 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaagtgaagmttgaggagtc(SEQ IDNo.33)

VH-for-10 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgatgtgaacctggaagtgtc(SEQ IDNo.34)

VH-for-11 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccagatkcagcttmaggagtc(SEQ IDNo.35)

VH-for-12 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggcttatctgcagcagtc(SEQ IDNo.36)

VH-for-13 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggttcacctacaacagtc(SEQ IDNo.37)

VH-for-14 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtgcagcttgtagagac(SEQ IDNo.38)

VH-for-15 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgargtgmagctgktggagac(SEQ IDNo.39)

VH-rev1 cggagtcaggcccccgaggccgaggagacggtgacmgtgg(SEQ ID No.40)

VH-rev2 cggagtcaggcccccgaggccgcagagacagtgaccagag(SEQ ID No.41)

VH-rev3 cggagtcaggcccccgaggccgaggagactgtgagastgg(SEQ ID No.42)

Outer-for ctacagcaggcccaggcggccatggcggactacaaa(SEQ ID No.43)

Outer-rev cggagtcaggcccccgag(SEQ ID No.44)。

实验方法

1.RNA提取

(1)处死小鼠，从其体内取出脾脏，放进培养皿，加2ml TRIzol(使核蛋白体解离，释放出RNA)进行研磨，裂解组织和细胞，将裂解物转移至干净的1.5ml EP管中；

(2)加入0.4ml的氯仿，盖紧盖子置于涡旋震荡仪上剧烈震荡15s，冰上静置5～10min(出现分层现象)；

(3)将离心机提前预冷到4℃然后12000rpm离心15min，离心结束后，离心管内的溶液会分成3相，由上至下依次是：RNA相、DNA相及有机相。

(4)将上层的RNA相转移至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇(4℃预冷)，上下颠倒混合后，冰上静置5min，12000rpm离心10min后弃上清。

(5)加入1ml用RNase Free的ddH2O配制的75％乙醇(4℃预冷)，上下颠倒混匀后12000rpm 4℃离心5min弃上清。将1.5ml EP管在无尘纸上倒置10～15min，去除残留乙醇。

(6)加入15～30μL RNase Free的ddH

2.第一PCR

本实验所涉及的引物序列来自已发表文献(Construction of scFv Fragmentsfrom Hybridoma or Spleen Cells by PCR Assembly.Antibody Engineering,(2010)pp.21-44)。

用无核酸酶的水将实验材料中引物的使用浓度均配制为10μm，然后在按照下面表格中顺序将引物进行配对，再根据Bestag 2×PCRMaster Mix的说明书依次加入相应试剂配制PCR反应体系。

表4鼠ScFv抗体文库引物配对方案(重链)

表5鼠ScFv抗体文库引物配对方案(轻链)

(1)PCR体系：

(2)PCR扩增条件：

(3)分别合并重链和轻链的PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，切下400bp左右的目的条带，根据Gel Extraction Kit(OMAGA)试剂盒提供的方法进行胶回收。

3.第二PCR

(1)PCR-like：

以First PCR胶回收得到的mVH、mVL做模板，配置以下体系，进行PCR-like

mVH PCR产物 5μl(10ng/μl)；

mVLPCR产物 5μl(10ng/μl)；

Kodaq 2×MasterMix 10μl。

PCR-like反应程序：

(2)将上述PCR-like产物稀释100倍(20/2000)作为模板，Outer-for和Outer-rev为引物，按照Kodaq 2×PCR Master Mix的说明书依次加入相应试剂配制如下PCR反应体系：

(3)PCR扩增条件如下：

(4)SOE-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下800bp的目的条带，根据GelExtraction Kit(OMAGA)试剂盒提供的说明书进行胶回收。

4.酶切

(1)SOE-PCR产物酶切：

根据Sfi1(NEB)的说明书配置酶切体系，对SOE-PCR产物进行酶切。

酶切体系：

50℃，过夜酶切

(2)质粒载体酶切

根据Sfi1(NEB)的说明书配置酶切体系，对4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN载体进行酶切，酶切体系如下：

50℃，过夜酶切。

(5)酶切产物琼脂糖凝胶电泳后将目的条带切下来，然后根据Gel ExtractionKit(OMAGA)提供的方法进行胶回收。

(6)酶连：将S-RBD免疫小鼠样本重链和轻链合并的SOE-PCR产物和4D5 inpcDNA5-FRT-MSLN载体的酶切产物参考T4连接酶(NEB)说明书，配置连接体系，16℃过夜连接获得连接产物S-RBD-pcDNA5-FRT-MSLN。

连接体系如下：

6.连接产物转化

(1)连接产物转化——化转

按照DH5α感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)的说明书对T4连接产物进行转化。

(2)连接产物转化——纯化连接产物

为确保连接效率先对S-RBD-pcDNA5-FRT-MSLN连接产物进行纯化，按照超薄DNA产物纯化试剂盒进行纯化：

(3)连接产物转化——电转

按照DH10B-Plus感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)的说明书对T4连接纯化产物进行转化。

(4)大量摇取菌液：将电转剩余菌液转移至200mlAMP抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm，过夜摇菌。

(5)质粒大提

按照EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)试剂盒说明书进行质粒大提。

(6)将化转、电转的平板挑100个单克隆送测序。

实验结果

如图8所示，先通过普通PCR扩增S-RBD样本的重链和轻链(400bp)，再采用SOE-PCR连接S-RBD样本重链和轻链(800bp)，然后将S-RBD样本重链和轻链合并的SOE-PCR产物和4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN载体均进行酶切，最后通过T4连接酶将S-RBD样本的酶切产物与4D5 in pcDNA5-FRT-MSLN载体的酶切产物连接，根据图中的条带能够证明S-RBD-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库构建成功。

实施例5

基于K562-PB-FRT-39细胞构建人类ScFv抗体展示细胞文库。

实验材料

1.细胞：K562-PB-FRT-39细胞

2.质粒：YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒

3.培养基：

IMDM培养基、1640培养基

4.流式抗体：

Biotinylated 2019 n-Cov Spike S-His(KACTUS公司，货号COV-VM4SSB)，以下简称Biotinylated-Spike。

APC-Streptavidin(Biolegend公司，货号405207)

实验方法

1.取2×10

2.用2ml的1640培养基(无FBS、无双抗)重悬单克隆细胞，加入40μg的YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒和360μg的POG44质粒(YH-pcDNA5-FRT-MSLN：POG44＝1:9)，待细胞与质粒充分混匀后，将其转移到2个1000μl电击管中，设置电转参数为：950V、30ms。注意电击前后分别冰浴5min。冰浴结束后立即用100ml的IMDM完全培养基重悬电击后的细胞后加入到T175培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO

3.电转48h后，分别取2×10

4.根据电转后48h后K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞的流式分析结果，在72h参考上一步流式染色方法将剩余的K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞染色后利用索尼流式分选仪分选。

5.将分选后的K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞取1×10

6.新合成的第一链cDNA作为模板直接用于下游PCR扩增，以YH文库扩增过程中的RSC-F(sense)和RSC-B(reverse)作为引物，按照Kodaq 2×PCR Master Mix的说明书依次加入相应试剂配制PCR反应体系。

PCR扩增条件：

7.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收800bp左右的目的片段，送测序公司进行TA克隆，挑取20个有效克隆，对其序列进行分析。

实验结果

如图9所示，在K562-PB-FRT-39细胞转染YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒48h后的流式分析结果显示：K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞中MSLN蛋白的表达量为99.7％，S抗体的表达量为10.2％，表明K562-PB-FRT-39转染YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒的转染效率为99.7％，但是YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库质粒中成功表达S抗体的质粒占10.2％。如图10所示，K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞在电转72h进行流式分选时选择1％的双阳区域(MSLN蛋白阳性和S抗体阳性)筛选细胞。

如图11所示，在800bp左右有一条带，成功从K562-PB-FRT-39-YH-pcDNA5-FRT-MSLN抗体库细胞中得到ScFv的抗体序列，具体序列如下：

DNVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSFSLTISSMEAEDAATYYCQQWSRTPPTFGSGTKLEIKRGG。

对比例

PDGFR蛋白的跨膜区是业界常用的可以将蛋白融合表达于膜上的设计。现比较K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞和K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞的4D5抗体跨膜表达量。

实验材料

1.细胞：K562、K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN、K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR

2.培养基：IMDM完全培养基

3.Western Blot抗体：

ErbB2单克隆抗体19G9(Anti-4D5-FC)1:10000(具体方法参见公开专利：CN201910784230.4)

实验方法

1.取1×10

2.用120μl的1640培养基(无FBS、无双抗)重悬单克隆细胞，加入2μg的4D5-PDGFR抗体库质粒和18μg的POG44质粒(4D5-PDGFR：POG44＝1:9)，待细胞与质粒充分混匀后，将其转移到120μl电击管中，设置电转参数为：560V、30ms。注意电击前后分别冰浴5min。冰浴结束后立即用10ml的IMDM完全培养基重悬电击后的细胞后加入到T25培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO

3.电转48h后，将K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞进行传代，其传代细胞密度为3×10

4.制备蛋白样品：各取1×10

5.蛋白质上样：Marker、20μg K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR上清蛋白、20μg K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN上清蛋白、25ng4D5-FC蛋白。

6.SDS-PAGE凝胶电泳：采用恒压电泳，先100V电泳10min再调至180V电泳50min。

7.半干转印：先将PVDF膜用甲醇浸润30s，然后将PVDF膜和6张转印滤纸一起放入转印液中浸泡20min，然后按照从下至上的顺序依次放置：三层滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE凝胶、三层滤纸(注意PVDF膜和凝胶之间不可有气泡)，最后插上电极采用56mA恒流转印90min。

8.封闭：转印结束后，取出PVDF膜，标记一下膜的正反面，然后于TBST洗液中清洗一下，去除残留的转印液，最后用5％的脱脂牛奶封闭1h。

9.抗体孵育：用抗体稀释液将19G9-HRP抗体按照1:10000的稀释比例配置5ml，将PVDF膜浸润在19G9-HRP抗体溶液中，然后置于4℃摇床上过夜孵育。

10.洗膜：先将19G9-HRP回收到标记好的15ml离心管中，再将PVDF膜放入含TBST洗液的洗膜盒中，然后将TBST洗液置于摇床上摇15min，重复洗膜3次，间隔15min。

11.显影：将显影液的A液和B液按照1:1混匀后，使用化学发光成像分析仪显影，注意显影液需现配现用。

实验结果

如图12所示，用抗4D5蛋白的19G9-HRP抗体孵育转印结束后的PVDF膜发现，K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR上清蛋白和K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN上清蛋白均有4D5蛋白的表达，并且当蛋白上样量相同时K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN上清蛋白中4D5蛋白的含量明显高于K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR上清蛋白。结果表明：K562-PB-FRT-39-sifi-4D5-MSLN细胞表达4D5蛋白的效率明显优于K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞。

由上述实施例可知，本发明提供的基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒，利用间皮素融合蛋白即可膜上表达又可分泌表达的特性，实现待筛选蛋白在哺乳动物细胞的展示，能够大大提高待筛选蛋白的筛选效率；待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白表达效率更高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> 一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln

20 25 30

Pro Ser Arg Thr

35

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 289

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu

1 5 10 15

Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro

20 25 30

Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro

35 40 45

Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala

50 55 60

Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr

65 70 75 80

Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr

85 90 95

Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser

100 105 110

Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg

115 120 125

Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr

130 135 140

Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe

145 150 155 160

Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys

165 170 175

Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys

180 185 190

Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys

195 200 205

Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg

210 215 220

Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr

225 230 235 240

Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu

245 250 255

Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly

260 265 270

Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu

275 280 285

Ala

<210> 4

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atggccttgc caacggctcg acccctgttg gggtcctgtg ggacccccgc cctcggcagc 60

ctcctgttcc tgctcttcag cctcggatgg gtgcagccct cgaggaccgg 110

<210> 5

<211> 741

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60

atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tttattctgg agtcccttct 180

cgcttctctg gatctagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300

ggtaccaagg tggagatcaa acgcactggc tccactagcg gttccggcaa acctggcagc 360

ggagaaggca gcaccaaagg ggaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 420

ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct tcaacattaa agacacctat 480

atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct 540

acgaatggtt atactagata tgccgatagc gtcaagggcc gtttcactat aagcgcagac 600

acatccaaaa acacagccta cctgcagatg aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc 660

tattattgtt ctagatgggg aggggacggc ttctatgcta tggacgtgtg gggtcaagga 720

accctggtca ccgtctcctc g 741

<210> 6

<211> 870

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

acccagatgg accgcgtgaa cgccatcccc ttcacctacg agcagctgga cgtcctaaag 60

cataaactgg atgagctcta cccacaaggt taccccgagt ctgtgatcca gcacctgggc 120

tacctcttcc tcaagatgag ccctgaggac attcgcaagt ggaatgtgac gtccctggag 180

accctgaagg ctttgcttga agtcaacaaa gggcacgaaa tgagtcctca ggtggccacc 240

ctgatcgacc gctttgtgaa gggaaggggc cagctagaca aagacaccct agacaccctg 300

accgccttct accctgggta cctgtgctcc ctcagccccg aggagctgag ctccgtgccc 360

cccagcagca tctgggcggt caggccccag gacctggaca cgtgtgaccc aaggcagctg 420

gacgtcctct atcccaaggc ccgccttgct ttccagaaca tgaacgggtc cgaatacttc 480

gtgaagatcc agtccttcct gggtggggcc cccacggagg atttgaaggc gctcagtcag 540

cagaatgtga gcatggactt ggccacgttc atgaagctgc ggacggatgc ggtgctgccg 600

ttgactgtgg ctgaggtgca gaaacttctg ggaccccacg tggagggcct gaaggcggag 660

gagcggcacc gcccggtgcg ggactggatc ctacggcagc ggcaggacga cctggacacg 720

ctggggctgg ggctacaggg cggcatcccc aacggctacc tggtcctaga cctcagcatg 780

caagaggccc tctcggggac gccctgcctc ctaggacctg gacctgttct caccgtcctg 840

gcactgctcc tagcctccac cctggcctaa 870

<210> 7

<211> 6754

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

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<210> 8

<211> 9491

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

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catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120

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cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780

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aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 7680

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 7740

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 7800

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 7860

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 7920

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 7980

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 8040

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 8100

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 8160

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 8220

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 8280

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 8340

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 8400

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 8460

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 8520

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 8580

tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 8640

ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 8700

ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 8760

atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 8820

ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 8880

tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 8940

attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 9000

tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 9060

ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 9120

gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 9180

gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 9240

gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 9300

aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 9360

taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 9420

tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 9480

tgaatactca t 9491

<210> 9

<211> 699

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atggtgagca aaggcgaggc cgtgatcaag gagttcatga ggttcaaggt gcacatggag 60

ggcagcatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgaaggcag accctatgag 120

ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgaca aagggcggcc ctctgccctt cagctgggat 180

attctgtccc cccagttcat gtacggcagc agagccttca ccaagcaccc cgccgacatc 240

cccgactact ataagcagag cttccccgag ggctttaagt gggagagggt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgacccaa gacacatctc tggaggacgg cacactgatc 360

tacaaggtga agctgagggg caccaacttt cctcccgacg gccccgtgat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcttc caccgagaga ctgtaccccg aggacggcgt gctgaagggc 480

gacattaaga tggctctgag actgaaggac ggcggaagat acctcgccga cttcaagacc 540

acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagatg cccggcgcct acaacgtgga tagaaagctg 600

gacatcacat cccacaacga ggattacacc gtcgtggagc agtacgagag atccgagggc 660

agacactcca ccggcggcat ggatgaactg tacaagtga 699

<210> 10

<211> 714

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atggtgagca aaggcgagga gctgatcaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag 60

ggcaccgtcg acaaccacca cttcaagtgc acaagcgagg gcgagggcaa gccctacgaa 120

ggcacccaga ccatgagaat caaggtggtg gagggaggcc ctctgccttt cgctttcgac 180

attctggcca caagctttct gtacggcagc aagaccttca tcaaccacac acaaggcatc 240

cccgacttct ttaagcagtc cttccccgag ggcttcacat gggagagggt gaccacctat 300

gaggatggcg gcgtgctgac cgccacacaa gacacctctc tgcaagacgg ctgtctgatc 360

tacaacgtga agattagagg cgtgaacttc accagcaacg gacccgtgat gcagaagaag 420

acactgggct gggaggcctt caccgagaca ctgtaccccg ccgacggagg actggaagga 480

agaaatgaca tggccctcaa gctggtgggc ggcagccatc tgatcgccaa cgccaagacc 540

acctatagat ccaagaagcc cgccaagaat ctgaagatgc ccggcgtgta ctacgtggac 600

tatagactgg agagaatcaa ggaggccaac aacgagacct acgtggagca gcatgaggtg 660

gccgtggcca gatactgcga tctgccctcc aagctgggcc ataagctgaa ttga 714

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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catggcggac tacaaagaca wtgttctcac ccagtc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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catggcggac tacaaagaca tccagatgac acagwc 36

<210> 13

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

catggcggac tacaaagatr ttgtgatgac ccagwc 36

<210> 14

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

catggcggac tacaaagaca ttstgmtgac ccagtc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

catggcggac tacaaagatg ttgtgvtgac ccaaac 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

catggcggac tacaaagaca caactgtgac ccagtc 36

<210> 17

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

catggcggac tacaaagaya ttktgctcac tcagtc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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catggcggac tacaaagata ttgtgatrac ccaggm 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

catggcggac tacaaagaca ttgtaatgac ccaatc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

catggcggac tacaaagaca ttgtgatgwc acagtc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

catggcggac tacaaagatr tccagatgam ccagtc 36

<210> 22

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

catggcggac tacaaagatg gagaaacaac acaggc 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc agaaccacca ccaccgcgtt tbatttccag 60

cttgg 65

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ggagccgccg ccgccagaac caccaccaca gaaccaccac caccgcgttt tatttccaat 60

tttg 64

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggttcdsc tgcaacagty 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggtgcaam tgmagsagtc 50

<210> 27

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gavgtgmwgc tggtggagtc 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gavgtgmwgc tggtggagtc 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gakgtgcagc ttcagsagtc 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagatccagt tsgygcagtc 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagrtccaac tgcagcagyc 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggtgmagc tasttgagwc 50

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaagtgaagm ttgaggagtc 50

<210> 34

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gatgtgaacc tggaagtgtc 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagatkcagc ttmaggagtc 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggcttatc tgcagcagtc 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggttcacc tacaacagtc 50

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<213> Artificial Sequence

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ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggtgcagc ttgtagagac 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gargtgmagc tgktggagac 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggagtcagg cccccgaggc cgaggagacg gtgacmgtgg 40

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggagtcagg cccccgaggc cgcagagaca gtgaccagag 40

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggagtcagg cccccgaggc cgaggagact gtgagastgg 40

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ctacagcagg cccaggcggc catggcggac tacaaa 36

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggagtcagg cccccgag 18