一种获得完整植物叶脉的方法

技术领域

本发明属于植物生理生态学研究技术领域，具体涉及一种获得完整植物叶脉的方法。

背景技术

植物叶脉特征较为稳定，常作为重要分类性状应用于分类学领域。同时，植物叶脉具有运输水分、养分、矿物质以及支撑和保护叶片等生理生态功能。作为重要功能性状，由各级叶脉组成的叶脉网络特征能够反映植物的生态适应能力及生态适应对策。其中的末端叶脉和游离导管是决定叶片水分供需平衡的关键结构性状，对植物生长、水分运输、气体交换、光合作用等生理功能有重要影响。近年来，叶脉网络结构、功能（尤其是末端叶脉网络结构特性）及其生态学意义已成为植物生理生态学研究热点。

成功开展这方面研究的先决条件是获取清晰完整的叶脉网络，但由于受到叶片质地、表皮毛被等因素的影响，获取理想叶脉网络还很困难。目前，人们常根据叶片的质地、毛被等特点采用不同的叶片处理方法，大体上可以分为以下几类：（1）离析法，水煮软化或在水中发酵，化学药液如氢氧化钠溶液等离析，然后再用毛刷刷去表皮和叶肉；（2）化学透明法，化学药液如氢氧化钾溶液等浸泡离析或FAA固定液固定处理后，双氧水等漂白，再用梯度酒精溶液脱水处理；（3）混合法，化学药液浸泡离析或FAA固定液固定处理后，在二甲苯和丙酮混合液中用毛刷刷去表皮毛和叶肉。以上方法均存在一定缺陷，第一类方法会对末端叶脉、尤其是叶片盲脉和游离导管造成损坏；第二类方法无法有效清除表皮毛，梯度脱水处理程序繁琐，难以大量处理叶片样本；第三类方法在有毒药剂中去除表皮毛，在操作过程中挥发的有毒气体会对人体产生危害。此外，目前的方法还存在以下两方面的问题：其一，上述方法适宜处理质地较为厚硬的叶片或腊叶标本叶片。不适宜叶片薄、质地柔软、表皮毛被发达的叶片，在离析、去毛的过程中，末端叶脉会遭到破坏，难以获得完整叶脉；其二，上述方法往往是针对质地、表皮特性不同植物叶片分别设计的，而生态学研究往往涉及许多植物物种，且需要群体大量取样、不同发育时期动态取样。针对不同叶片类型采用不同处理方法，极为不便。同时，也因为方法的不统一，使得研究结果的可信度大大降低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种获得完整植物叶脉的方法，叶片的末端叶脉和游离导管可完整保留，适用于各种质地和毛被类型的叶片，不仅可以处理新鲜叶片，也可处理腊叶标本叶片，处理后得到的叶脉可做成切片永久保存。

本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种获得完整植物叶脉的方法，包括以下步骤：

步骤一：按体积比96:4~94:6取无水乙醇和冰醋酸配制成固定保存液A；

步骤二：将采集的植物叶片用清水洗净，先用煮沸的水浸泡0~10 min，再放入质量浓度为4~6%的氢氧化钠溶液中离析，离析时间为3~7天，待叶片的叶肉大量析出后，转入蒸馏水中清洗；

步骤三：去除叶片的被毛，再放入蒸馏水中清洗；

步骤四：将步骤三中蒸馏水清洗后的叶片小心转移至质量浓度为2~4%的次氯酸钠溶液中，浸渍时间为25~35 min，待叶片完全变白，转移至蒸馏水中清洗；

步骤五：将固定保存液A和蒸馏水制备成质量浓度为31~35%的固定保存液A和质量浓度为64~70%的固定保存液A，将步骤四处理后的叶片先放入质量浓度为31~35%的固定保存液A中处理10~30 min，再放入质量浓度为64~70%的固定保存液A中处理10~30min，最后放入固定保存液A中处理10~14h；

步骤六：将步骤五处理后的叶片放入质量浓度为0.5~1.5%的番红酒精染色剂中染色25~35 min；

步骤七：将步骤六中染色好的叶片放入无水乙醇和二甲苯混合液中5~10 min，然后将叶片转移至二甲苯中5~15 min，待叶片透明，叶脉完全展露出来，即可做切片；

步骤八：将切片自然晾干6~8天，放入切片盒中保存。

进一步的，步骤二中的叶片可以是新鲜叶片，也可以是腊叶标本叶片。

进一步的，步骤二中不同种类叶片的处理方法为：质地较厚硬的叶片，先用煮沸的水浸泡1~2 min，然后放入质量浓度为4~6%氢氧化钠溶液中离析；腊叶标本叶片，先用煮沸的水浸泡5~10 min，再放入质量浓度为4~6%氢氧化钠溶液中离析；质地薄软的草本植物叶片，直接放入质量浓度为4~6% 氢氧化钠溶液中离析。

进一步的，步骤三中叶片的被毛去除方法为：将用蒸馏水清洗后的叶片转移到无水乙醇中，叶片若不平整，先用玻璃片压平，8~12 min后在无水乙醇中用毛刷轻轻的朝一个方向刷。

进一步的，步骤七中的混合溶液中，无水乙醇的体积份数为40~60%，二甲苯的体积份数为40~60%。

本发明的有益效果主要表现在以下几个方面：本发明提供了一种获得完整植物叶脉的方法，该方法简单易行，且获得的叶脉网络清晰完整，包括末端盲脉和游离态导管。适用于各种质地和毛被类型的叶片，既可以用于新鲜叶片，也可用于腊叶标本叶片，处理后得到的叶脉网络可做成切片永久保存，本发明采用统一的处理方法，大大方便了生理生态学群体研究和不同发育时期动态研究，提高了研究结果的可信度。

具体实施方式

结合实施例对本发明加以详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例

一种获得完整植物叶脉的方法，包括以下步骤：

步骤一：按体积比96:4~94:6取无水乙醇和冰醋酸配制成固定保存液A；

步骤二：本发明的叶片适用于各种质地和毛被类型的叶片，既可以用于新鲜叶片，也可用于腊叶标本叶片，将采集的植物叶片用清水洗净，质地较厚硬的叶片如南天竹、栎类、女贞等植物叶片，先用煮沸的水浸泡1~2 min，然后放入质量浓度为5%氢氧化钠溶液中离析；腊叶标本叶片，先用煮沸的水浸泡5~10 min，再放入质量浓度为5%氢氧化钠溶液中离析；质地薄软的草本植物叶片如小花山桃草、圆叶牵牛、飞蓬等植物叶片，直接放入质量浓度为5% 氢氧化钠溶液中离析。离析时间为3~7天，叶片质地越厚硬需要处理的时间越长，每天观察，溶液变浑浊时及时换新氢氧化钠溶液，待叶片的叶肉大量析出后，转入蒸馏水中清洗；

步骤三：被毛多的叶片如小花山桃草、飞蓬等植物叶片，将用蒸馏水清洗后的叶片转移到无水乙醇中，叶片若不平整，先用玻璃片压平，10 min后在无水乙醇中用毛刷轻轻的朝一个方向刷，能很好地去除毛被，再放入蒸馏水中清洗；

步骤四：将步骤三中蒸馏水清洗后的叶片小心转移至质量浓度为3%的次氯酸钠溶液中，浸渍时间为30min，待叶片完全变白，转移至蒸馏水中清洗；

步骤五：将固定保存液A和蒸馏水制备成质量浓度为33%的固定保存液A和质量浓度为67%的固定保存液A，将步骤四处理后的叶片先放入质量浓度为33%的固定保存液A中处理10~30 min，再放入质量浓度为67%的固定保存液A中处理10~30min，最后放入固定保存液A中处理12h；若来不及进行下一步，叶片可密封保存于A溶液中，可保存4周以上；

步骤六：将步骤五处理后的叶片放入质量浓度为1%的番红酒精染色剂中染色30min；

步骤七：将步骤六中染色好的叶片放入无水乙醇和二甲苯混合液中5~10 min，在混合溶液中无水乙醇的体积份数为50%，二甲苯的体积份数为50%，然后将叶片转移至二甲苯中5~15 min，待叶片透明，叶脉完全展露出来，即可做切片；

步骤八：小的叶片可以直接用中性树胶封片，较大叶片可以按上中下顺序截成几部分，做成切片，将切片自然晾干7天，放入切片盒中保存。

实施案例1:

步骤一、固定保存液配制：用无水乙醇和冰醋酸配制体积份数为95:5的固定保存液A；

步骤二、将采集的植物叶片用清水洗净，质地较厚硬的叶片如南天竹、栎类、女贞等植物叶片，先用煮沸的水浸泡1~2 min，然后放入5% 氢氧化钠溶液中离析，离析处理时间为3~7 d，叶片质地越厚硬需要处理的时间越长，每天观察，溶液变浑浊时及时换新氢氧化钠溶液。待叶片的叶肉大量析出后，转入蒸馏水中清洗；

步骤三、将蒸馏水清洗后的叶片小心转移至3% 次氯酸钠溶液中，30 min左右，待叶片完全变白，转移至蒸馏水清洗；

步骤四、将固定保存液A和蒸馏水制备成浓度33%的溶液A和浓度67%的溶液A，将上述叶片先放入浓度33%的溶液A中处理10-30 min，然后再放入浓度67%的溶液A中处理10~30min，最后放入A溶液中处理12h。若来不及进行下一步，叶片可密封保存于A溶液中，可保存4周以上；

步骤五、将上一个处理的叶片放入1% 番红酒精染色剂中染色30 min左右；

步骤六、将染色好的叶片放入体积份数为5:5的无水乙醇和二甲苯混合液中5~10min，转移至二甲苯中，5~15 min，待叶片透明，叶脉完全展露出来，即可做切片；

步骤七、小的叶片可以直接用中性树胶封片，较大叶片可以按上中下顺序截成几部分，做成切片，自然晾干一周时间，放入切片盒中永久保存。

实施案例2:

步骤一、固定保存液配制：按体积比95:5取无水乙醇和冰醋酸配制成固定保存液A；

步骤二、将采集的植物叶片用清水洗净。蜡叶标本叶片，先用煮沸的水浸泡5~10min，再放入5% 氢氧化钠溶液中离析，离析处理时间为3~7 d，叶片质地越厚硬需要处理的时间越长，每天观察，溶液变浑浊时及时换新氢氧化钠溶液。待叶片的叶肉大量析出后，转入蒸馏水中清洗；

步骤三、将蒸馏水清洗后的叶片小心转移至3% 次氯酸钠溶液中，30min左右，待叶片完全变白，转移至蒸馏水清洗：

步骤四、将固定保存液A和蒸馏水制备成浓度33%的溶液A和浓度67%的溶液A，将上述叶片先放入浓度33%的溶液A中处理10-30min，然后再放入浓度67%的溶液A中处理10~30min，最后放入A溶液中处理12h，若来不及进行下一步，叶片可密封保存于A溶液中，可保存4周以上；

步骤五、将步骤四处理的叶片放入1%的番红酒精染色剂中染色30min；

步骤六、将染色好的叶片放入体积份数为5:5的无水乙醇和二甲苯混合液中5~10min，转移至二甲苯中，5~15 min，待叶片透明，叶脉完全展露出来，即可做切片；

步骤七、小的叶片可以直接用中性树胶封片，较大叶片可以按上中下顺序截成几部分，做成切片，自然晾干一周时间，放入切片盒中永久保存。

实施案例3:

步骤一、固定保存液配制：无水乙醇和冰醋酸按体积比95:5的比例配制成固定保存液A；

步骤二、质地薄软的草本植物叶片如小花山桃草、圆叶牵牛、飞蓬等植物叶片，用清水洗净后直接放入5% 氢氧化钠溶液中离析，离析处理时间为3~7 d，叶片质地越厚硬需要处理的时间越长，每天观察，溶液变浑浊时及时换新氢氧化钠溶液。待叶片的叶肉大量析出后，转入蒸馏水中清洗；

步骤三、将用蒸馏水清洗后的叶片转移到无水乙醇中，叶片若不平整，先用玻璃片压平，10 min后在无水乙醇中用毛刷轻轻的朝一个方向刷，能很好的去除被毛，再放入蒸馏水中清洗；

步骤四、将蒸馏水清洗后的叶片小心转移至3% 次氯酸钠溶液中，30min左右，待叶片完全变白，转移至蒸馏水清洗；

步骤五、将固定保存液A和蒸馏水制备成浓度33%的溶液A和浓度67%的溶液A，将上述叶片先放入浓度33%的溶液A中处理10~30min，然后再放入浓度67%的溶液A中处理10~30min，最后放入A溶液中处理12h。若来不及进行下一步，叶片可密封保存于A溶液中，可保存4周以上；

步骤六、将步骤五处理的叶片放入1%的番红酒精染色剂中染色30min左右；

步骤七、将染色好的叶片放入体积份数为5:5的无水乙醇和二甲苯混合液中5~10min，转移至二甲苯中，5~15 min，待叶片透明，叶脉完全展露出来，即可做切片；

步骤八、小的叶片可以直接用中性树胶封片，较大叶片可以按上中下顺序截成几部分，做成切片，自然晾干一周时间，放入切片盒中永久保存。

将叶片先放入浓度33%的溶液A中处理10~30min，然后再放入浓度67%的溶液A中处理10~30min，最后放入A溶液中处理12h；其目的为进一步离析（叶肉离析），且可使叶脉富有弹性，方便取出完整叶片（否则易破损），叶脉也更容易染色。

本发明提供了一种获得完整植物叶脉的方法，该方法简单易行，且获得的叶脉网络清晰完整，包括末端盲脉和游离态导管。适用于各种质地和毛被类型的叶片，既可以用于新鲜叶片，也可用于腊叶标本叶片，处理后得到的叶脉网络可做成切片永久保存，本发明采用统一的处理方法，大大方便了生理生态学群体研究和不同发育时期动态研究，提高了研究结果的可信度。

本发明所列举的技术方案和实施方式并非是限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。还需要说明的是，在本文中的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。