食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法及其应用

技术领域

本发明涉及及非人灵长类实验动物疾病模型技术领域，具体涉及一种食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法及其应用。

背景技术

高脂血症是指脂肪代谢或转运异常所致的血浆中1种或多种脂质高于正常的疾病，其临床发病率高，常分为高胆固醇(TC)血症、高甘油三脂(TG)血症和混合型高脂血症(即同时表现高TG和高TC血症)。其中，高甘油三酯血症是一种异族性甘油三酯蛋白合成或降解障碍。它是临床实践中最常见的脂质异常之一，尤其是在代谢综合征或2型糖尿病的病人中。甘油三酯高的后果是容易造成“血稠”，即血液中脂质含量过高导致的血液黏稠，在血管壁上沉积，渐渐形成小斑块，即动脉粥样硬化，进而形成局部缺血或血栓。甘油三酯高的后果无论发生在哪个部位，对人体损伤都很严重。如果在心脏，可引起冠心病、心梗；在大脑，可发生脑卒中、中风；发生在眼底，会导致视力下降、失明；如在肾脏，可引起肾衰；发生在下肢，则出现肢体血流不畅导致坏死。根据病因，可将高甘油三酯血症分为两种类型，即原发性与继发性。原发性高甘油三酯血症包括家族性高甘油三酯血症、家族性混合型血脂异常、家族性异常β-脂蛋白血症等。继发性高甘油三酯血症的病因主要包括酒精滥用、肥胖和糖尿病控制失败、某些疾病状态、激素和药物等。目前，高脂血症及其并发症几乎占了全球死亡率的50％，每年造成的经济损失高达1000亿美元。其发病率高、分布广，且呈年轻化趋势。随着我国人口老龄化进程的加快以及饮食结构的改变，血脂异常总体患病率呈快速上升趋势。据报道，2012年中国成人血脂异常患病率40.40％，比较2002年的患病率水平出现大幅度增加，其中高胆固醇血症患病率4.9％，高甘油三酯血症的患病率13.1％，低高密度脂蛋白胆固醇血症的患病率33.9％。呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态，这对我国血脂异常防治工作提出更为严峻的挑战。

目前，已建立的高血脂症模型大致可分为饮食诱导、自发及基因修饰等模型，该模型的建立对于高脂血症发病机制及相关药物的筛选研究具有重要意义。大鼠是目前研究高脂血症最常用的动物，能较好地反映多种实验因素对脂质吸收、分解及合成等代谢环节的影响，同时具有成本低、易于饲养、取血量大等优点，因而被作为高脂血症动物模型广泛用于降脂药物的研究。但大鼠的高脂血症与人类高脂血症的发病机制差异较大，如大鼠内源性TC合成量与人类差异较大，大鼠体内TC转运依赖HDL-C，人类体内TC转运则依赖低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，且大鼠体内TC血浆清除率明显高于人类。另外，大鼠对摄入的高TC食物不敏感，而且还可以通过减少自身肝脏合成TC、并诱导胆固醇7A羟化酶(CYP7A1)表达上调，增加胆汁酸生成等途径而使血浆脂蛋白保持稳定。小鼠容易获得，操作方便，但其血脂代谢与人类差别很大，血浆HDL-C浓度相对较高，LDL-C、VLDL浓度较低，同时缺乏胆固醇转运蛋白。另外，某些种属小鼠(如：C57BL/6J)饮食诱导建模后，TC水平显著升高，而TG增高不明显。家兔作为草食性动物，其血浆脂蛋白谱与人相似，有CETP、肝ApoB100和肠ApoB48的表达，对外源性胆固醇吸收率较高，血中脂质清除率较低。高脂饮食时，血浆TC，LDL-C、VLDL/TC显著升高、HDL-C降低，易形成高脂血症和AS病变。同时，家兔成模速度快，重复性好，成本低，是最早用于高脂血症和AS研究的动物，但家兔血清中LDL在总TC中占比较高，与人差异较大。。

高脂血症动物模型研究的兔、大鼠、小鼠等实验动物模型相对成熟。然而，生物制品类药物有其自身特点，其中种属特异性是该类药物研发时需要着重考量的因素，非人灵长类实验动物(NHP)具有NHP在基因、生理、生化指标和解剖学等方面都比其他动物更接近人类；发病机制及伴随的风险因子也与人类疾病高度相似；NHP有较长的生命周期；能为药物的发现提供十分重要的临床前信息，特别是对于生物制品类药物，灵长类动物具有明显种属的优势；从NHP实验获得的数据确保了将来临床应用的更高的效率和可靠性，使NHP成为临床前研究的“黄金标准”等优点。例如2017年美国FDA批准的首个生物制品类降脂药Praluent(PCSK9抑制剂)在临床前毒理学研究中大量使用灵长类动物，其主要原因为该类药物和灵长类动物之间存在交叉反应，而与啮齿类动物不存在交叉反应，即Praluent给药后可在灵长类动物体内发生药理学和/或毒理学效应，而不会与啮齿类动物的组织产生反应，丧失其药理学和毒理学的作用基础。目前已报道的非人灵长类高血脂模型均为高脂饲料诱导方式。然而，高脂饲料油腻且适口性差，啮齿类动物食用高脂饲料尚可进行，但也会由于饲料硬度不足导致动物不喜食，且高脂饲料在长期试验中保存条件高，否则容易发霉变质。更为重要的是，高脂饲料诱导非人灵长类高血脂模型均不能表现出TG上升这一现象。

总之，与啮齿类动物相比，非人灵长类模型在高甘油三酯血症的新药研发过程中具有更重要的价值。

发明内容

目前用于建立高血脂症模型的主要方法是通过长期单纯高脂肪饮食喂养。然而此类方法得到的动物模型不符合高甘油三酯血症的真实发病机制、没有模拟高甘油三酯血症的慢性发病过程；更糟糕的是，由于高脂饲料油腻且适口性差，啮齿类动物食用高脂饲料尚可进行但也会由于饲料硬度不足导致动物不喜食，且高脂饲料在长期试验中保存条件高，否则容易发霉变质，并且模型动物均不能表现出TG上升症状。因此，本发明的目的是提供一种食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法，该方法通过喂食温和饲料，得到了更加接近人类状态的高甘油三酯血症模型。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选择年龄为12-21岁雄性食蟹猴；

(2)每日喂养四次，第一次喂养含糖饲料，第二次喂养辅食，第三次喂养青料，第四次喂养含糖饲料；

(3)按照步骤(2)的方式喂养一年后，检测相应的指标，筛选出空腹状态血清甘油三酯水平＞1.14mmol/L的食蟹猴；

其中，所述喂养辅食为红糖块和饼干交替投喂，每三天交替一次；

所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖混合得到。

优选地，所述含糖饲料中红砂糖的含量为10-15重量％。

优选地，所述常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉。

优选地，所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水；

优选地，所述饼干的成分包含麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料。

优选地，所述第一次喂养含糖饲料的投喂重量为120克；

优选地，所述第一次喂养含糖饲料的时间为7：30-8：00。

优选地，在辅食喂养中，投喂红糖块时的投喂重量为30克，投喂饼干时的投喂重量为25克；

优选地，所述第二次喂养辅食的时间为12：00-12：30。

优选地，所述第三次喂养青料的投喂重量为100克；

优选地，所述第三次喂养青料的时间为14：00-14：30。

优选地，所述第四次喂养含糖饲料的投喂重量为120克；

优选地，所述第四次喂养含糖饲料的时间为17：00-17：30。

本发明第二方面提供上述食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法在高甘油三酯血症治疗中的应用。

优选地，将所述方法构建的食蟹猴高甘油三酯血症模型用于发现高甘油三酯血症的治疗药物。

本发明中，采取温和的喂养方式建立高甘油三酯血症食蟹猴模型，可用于新药研发过程中的药效评估。目前报道的方法主要通过长期单纯高脂肪饮食喂养得到高甘油三酯血症模型，但高脂饲料油腻且适口性差，且高脂饲料在长期试验中容易发霉变质，并且高脂饲料诱导非人灵长类高血脂模型均不能表现出TG上升这一现象，不符合人类高甘油三酯血症的发病机制。与此相比，本发明所建立的食蟹猴高甘油三酯血症模型的主要优点是：

1.本发明使用的饲料中，脂肪添加量低且不含胆固醇，避免了高脂喂养的严重缺陷。

2.本发明建立的模型是食蟹猴模型。食蟹猴的遗传背景和生理结构与人类具有高度同源性，能自发发展成高血症，且症状与人类的症状高度相似。

3.本发明采用温和的含糖饲料、红糖块和饼干饲养替代替传统的高脂饲养，避免了高脂饲料油腻且适口性差、在长期试验中容易发霉变质、且容易引起动物腹泻和脱肛的缺陷。

4.本发明建立的非人灵长类模型出现血清甘油三酯(TG)水平上升的现象，这是传统高脂饮食诱导模型中没有的现象。

附图说明

图1是测试例1中实施例1得到的食蟹猴模型和对比例1中喂养后的食蟹猴的总胆固醇水平、甘油三酯水平、高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白a水平、载脂蛋白AⅠ水平比较结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供一种食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选择年龄为12-21岁雄性食蟹猴；

(2)每日喂养四次，第一次喂养含糖饲料，第二次喂养辅食，第三次喂养青料，第四次喂养含糖饲料；

(3)按照步骤(2)的方式喂养一年后，检测相应的指标，筛选出空腹状态血清甘油三酯水平＞1.14mmol/L的食蟹猴；

其中，所述喂养辅食为红糖块和饼干交替投喂，每三天交替一次；

所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖混合得到。

在优选的实施方式中，所述含糖饲料中红砂糖的含量为10-15重量％。具体的，所述含糖饲料中红砂糖的含量可以为10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％或15重量％。

优选地，所述常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉。

进一步优选地，所述含糖饲料的营养成分如表1所示。

在本发明中，营养成分表中的NRV％值计算方法及格式参考GB28050-2011。

表1

在优选的实施方式中，所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水。

在优选的实施方式中，所述红糖块的营养成分如表2所示。

表2

在优选的实施方式中，所述饼干的成分包含麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料。

在优选的实施方式中，所述饼干的营养成分如表3所示。

表3

在优选的实施方式中，所述第一次喂养含糖饲料的投喂重量为120克。

在优选的实施方式中，所述第一次喂养含糖饲料的时间为7：30-8：00。

在优选的实施方式中，在辅食喂养中，投喂红糖块时的投喂重量为30克，投喂饼干时的投喂重量为25克。

在优选的实施方式中，所述第二次喂养辅食的时间为12：00-12：30。

在优选的实施方式中，所述第三次喂养青料的投喂重量为100克；

在优选的实施方式中，所述第三次喂养青料的时间为14：00-14：30。

在优选的实施方式中，所述第四次喂养含糖饲料的投喂重量为120克；

在优选的实施方式中，所述第四次喂养含糖饲料的时间为17：00-17：30。

本发明第二方面提供上述食蟹猴高甘油三酯血症模型的建立方法在高甘油三酯血症治疗中的应用。

优选地，将所述方法构建的食蟹猴高甘油三酯血症模型用于发现高甘油三酯血症的治疗药物。

在本发明所述的方法中，采用长期温和喂养的方式建立食蟹猴高甘油三酯血症模型。温和喂养的特点包括：饲料中的糖和脂肪含量较低，且不含果糖和胆固醇。在保证能够通过温和喂养成功得到食蟹猴高甘油三酯血症模型的前提下，还能够避免传统的和高脂(尤其是高胆固醇)喂养方式带来的隐患。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

(1)选择年龄为12-21岁雄性食蟹猴31只；其中，所述食蟹猴均来源于湖北天勤生物科技有限公司，采购程序符合中华人民共和国法律法规要求，经湖北省林业厅、广东省林业厅批准。实验猴均通过体格检查，各项指标符合当地检验检疫标准。

(2)(2)对步骤(1)中的食蟹猴每日喂养四次，7：30-8：00第一次喂养含糖饲料120克，12：00-12：30第二次喂养辅食红糖块30克或饼干25克，红糖块和饼干交替投喂每三天交替一次，14：00-14：30第三次喂养青料100克，17：00-17：30第四次喂养含糖饲料120克，投放饲料均能全部吃完，其中所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖组混合得到，其中含糖饲料中红砂糖的含量为15重量％，常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉，含糖饲料的营养成分如表4所示；所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水，红糖块的营养成分如表5所示；所述饼干的成分包含小麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料，饼干的营养成分如表6所示。

(3)按照步骤(2)的方式喂养1年后，检测相应的指标，筛选出空腹状态血清甘油三酯水平＞1.14mmol/L的食蟹猴，即为食蟹猴高甘油三酯血症模型。

表4

表5

表6

在本实施例中，31只食蟹猴的血清甘油三酯范围为0.14-3.05mmol/L，平均值为0.99mmol/L；有18只食蟹猴的血清甘油三酯大于1.14mmol/L，即高甘油三酯血症发生率为32.26％。

对比例1

(1)选择与实施例1中相同来源的12-21岁雄性食蟹猴30只。

(2)对步骤(1)中的食蟹猴每日喂养三次，7：30-8：00第一次喂养常规饲料120克，14：00-14：30第二次喂养成分与实施例1相同的青料，17：00-17：30第三次喂养常规饲料120克，投放饲料均能全部吃完，常规饲料的营养成分如表7所示。

(3)按照步骤(2)的方式喂养，喂养开始和结束的时间与实施例1相同。

表7

在本对比例中，采用与实施例1中相同的方法对食蟹猴的空腹状态血清甘油三酯水平进行检测。30只食蟹猴血清甘油三酯范围为0.06-1.1mmol/L，平均值为0.37mmol/L；有6只食蟹猴的血清甘油三酯大于1.14mmol/L，高甘油三酯血症发生率为3.33％。

测试例1

将实施例1得到的食蟹猴模型与对比例1中喂养后的食蟹猴的总胆固醇水平、甘油三酯水平、高密度脂蛋白胆固醇水平、脂蛋白a水平、载脂蛋白AⅠ水平进行比较。结果如图1所示，HCD表示实施例1中得到的食蟹猴模型(模型组)的测试结果，CON表示对照例1中喂养后的食蟹猴(对照组)的测试结果，其中，图1A为总胆固醇水平对比结果，图1B为甘油三酯水平对比结果，图1C为高密度脂蛋白胆固醇的对比结果，图1D为脂蛋白a水平对比结果，图1E为载脂蛋白AⅠ水平对比结果。ns表示P＞0.05，*P＜0.05，****P＜0.0001。

由图可知，实施例1模型食蟹猴的甘油三酯水平显著高于对照例1中食蟹猴的甘油三酯水平，高密度脂蛋白胆固醇水平均显著低于对照例1中食蟹猴的外周血高密度脂蛋白胆固醇水平；实施例1模型食蟹猴血液中的总胆固醇水平、脂蛋白a水平、载脂蛋白AⅠ糖水平与对照例1比无统计学差异。上述数据表明，采用本发明所述的温和的长期喂养方式，1年可得到类似人类高甘油三酯血症的食蟹猴模型。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。