一种从海洋微藻中制备腹泻性贝类毒素标准物质的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种从海洋甲藻中分离制备高纯度腹泻性贝类毒素的方法。

背景技术

腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish toxins，DSTs)是一类由大田软海绵酸(Okadaic acid，OA)、鳍藻毒素(Dinophysistoxins，DTXs)及其衍生物组成的海洋藻毒素，其化学结构式如图1所示，难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、三氯甲烷等有机试剂。该类毒素常富集于贝类等生物组织中，威胁贝类水产品食用安全，可引起消费者出现腹泻性中毒，并诱导肿瘤的发育，潜在威胁人体健康和海洋生态安全。

无论是海洋毒素的新药开发，还是有毒赤潮的监测方法研究，均需要藻毒素标准品，特别是监管部门贝类产品卫生质量的常规检测也需要海洋毒素标准品进行定性与定量分析。随着越来越多的海洋毒素不断被发现，相应的毒素标准品研制工作明显滞后。因此，海洋藻毒素标准品具有巨大的市场需求。目前藻毒素标准品价格昂贵，浓度低，只能满足日常监测的毒素定量需求，难以满足藻毒素毒理学研究和快速检测方法开发的需求。由于OA和DTXs化学结构较为复杂，无法通过化学合成的途径进行生产，主要还是从产毒藻或染毒贝类组织中分离制备其标准物质。因此，建立开发一种从产毒微藻获取OA和DTX1毒素标准物质的制备工艺具有重要意义。

发明内容

本发明针对当前国内腹泻性贝毒标准品严重缺乏的现状，提供一种从大体积产毒藻培养体系中分离纯化获得高纯度大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素-1(DTX1)的方法，以弥补现有技术的不足。

本发明所提供的方法，包括如下的步骤

1)向含有腹泻性贝类毒素的利玛原甲藻(Prorocentrum lima)培养体系中加入碱液并静置以破碎藻细胞，随后将溶液的pH值调至2.0-5.0，加入二氯甲烷进行萃取，收集下层有机相获得毒素粗提液；

所述的碱液，作为实施例的具体记载，为NaOH溶液；

作为优选，所述的二氯甲烷加入比例为7％(v/v)；

作为优选，所述的溶液的pH值调至3.0；

2)将液液萃取收集的毒素粗提液经浓缩后，用甲醇复溶并加入到已活化的葡聚糖凝胶层析柱中，以甲醇溶液洗脱，分段收集洗脱液；根据液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分离组分中毒素组成的结果确定毒素的洗脱体积，选取含有OA和DTX1毒素的组分进行合并、浓缩，待半制备液相色谱进一步纯化；

3)采用半制备液相色谱进一步分离纯化OA和DTX1组分，经 LC-MS/MS检测分析，合并毒素组分，并用固相萃取柱进一步纯化；

所述的色谱柱采用C18半制备柱，流动相A为含有0.1％甲酸的超纯水，流动相B为100％甲醇溶液，采用流动相A和B为2:8的比例进行等度洗脱；

4)将半制备液相色谱分离纯化获得的OA和DTX1毒素样品加入到已活化的固相萃取柱(SPE)中，以10-20％甲醇进行淋洗去除样品中的基质，然后用甲醇溶液进行洗脱，即得到OA和DTX1标准样品。

本发明直接利用NaOH溶液破碎藻细胞，从而使细胞内OA和DTX1 毒素的酯化态形式水解为游离态毒素，然后采用液液萃取的方法收集培养液中的毒素；本发明方法有效减少了藻细胞的收集、破碎、水解等操作过程，耗时较短、回收率高；同时利用葡聚糖凝胶色谱和半制备液相色谱技术进行分离纯化，流程简单、纯化效果好，制备得到的OA和DTX1 标准物质纯度均在99％以上。

附图说明

图1腹泻性贝类毒素OA和DTX1的化学结构；

图2本发明从利玛原甲藻中制备OA和DTX1毒素标准物质的技术流程图；

图3不同pH条件下OA和DTX1毒素的液液萃取回收率的比较；

图4二氯甲烷用量对利玛原甲藻萃取回收率的影响，不同字母表示各组间存在显著性差异(p<0.05)。

图5不同比例的流动相条件下高效液相色谱紫外(HPLC-UV)检测纯化前样品的色谱图；

图6本发明分离纯化各阶段样品的全扫描质谱图(m/z 200-1500)；

图7本发明半制备液相色谱纯化获得的OA(A)和DTX1(B)毒素的高分辨二级质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。但是，本发明的保护范围并不只限于实施例所覆盖的范围。

实施例1：产毒藻中毒素的提取

向处于稳定生长期的利玛原甲藻培养液中加入10％(v/v)2.5mol/L 的NaOH静置24h，以破碎藻细胞，同时水解酯化态毒素。结果显示， NaOH处理过后OA的总量增加4.5倍，DTX1的总量增加2.2倍，且 OA和DTX1毒素基本完全释放到培养液中。

以2.5mol L

实施例2：腹泻性贝毒的进一步分离纯化

(1)葡聚糖凝胶层析柱纯化

称取15g葡聚糖凝胶填料(Sephadex LH-20)，采用色谱纯甲醇浸泡过夜，使填料充分溶胀并活化，同时去除掉部分脂溶性的杂质。浸泡过后，采用湿法装柱的方式装填层析柱，最终装填规格为16mm×700 mm。

将从利玛原甲藻细胞提取收集的OA和DTX1粗提液浓缩，氮吹干燥后复溶于3～5mL甲醇中。柱层析采用的流动相为甲醇溶液，流速设置为1～3mL min

(2)半制备液相色谱纯化

采用半制备液相色谱仪(HITACHI)对葡聚糖凝胶层析柱纯化后的样品进一步纯化，以分离OA和DTX1毒素。色谱柱采用Waters X-Bridge C18 OBD半制备柱(250×10mm,5μm)，流动相A为含有0.1％甲酸的超纯水，流动相B为100％甲醇溶液，采用等度洗脱(80％ B)的方式进行洗脱，流速4.0mL min

(3)固相萃取纯化

具体操作如下：采用Waters Oasis-HLB SPE柱(200mg，6cc)进行纯化，首先，依次用5mL甲醇和5mL 20％的甲醇水溶液(v/v)活化和平衡SPE柱(约1mL min

从利玛原甲藻中制备OA和DTX1毒素标准物质的技术流程如图2 所示。

实施例3：工艺优化研究

(1)毒素提取工艺：利用NaOH同时进行破碎藻细胞和酯化态毒素的水解，并以二氯甲烷对培养液中游离态的OA和DTX1毒素进行萃取，并对萃取的pH条件(图3)及萃取剂的用量(图4)进行优化。结果显示，将利玛原甲藻培养体系的pH调至3.0，二氯甲烷加入比例为7％(v/v)时，萃取效果最好。

(2)制备纯化工艺：本发明比较了不同流动相比例下毒素样品的分离情况，LC-UV色谱图如图5所示。随着有机相比例的增加，毒素的出峰时间大大缩短，同时峰宽变窄，经优化，制备时采用等度洗脱(80％甲醇)，OA和DTX1分离和纯化效果较好，可在15min内完成一次制备。

实施例4：纯化结果分析

为比较各阶段样品中杂质含量，分析各步骤对杂质的去除效果，采用LC-MS Q1全扫描模式在m/z 200-1500范围内采集各阶段样品的全扫描质谱图(图6)。结果显示，经葡聚糖凝胶柱层析纯化，样品的杂质响应降低了近5倍，且杂质峰显著变少，但层析柱纯化并不能分离OA和 DTX1毒素；经半制备液相色谱纯化，毒素已完全分离，同时样品中杂质基本完全去除，经LC-UV对毒素产物在200-400nm波长范围内的纯度分析，测得OA纯度为99.66％，DTX1纯度为99.97％；采用固相萃取 (SPE)柱纯化的目的在于去除样品中水相，同时将毒素进一步浓缩，以甲醇洗脱固相萃取填料中的毒素，最终使毒素保存在中性环境中。

将半制备纯化所得OA和DTX1毒素进行LC-HR/MS分析。采用 X-Bridge

表1半制备液相色谱纯化所得OA和DTX1产物的[M-H]-和碎片离子的测量质量与精确质量表

结果表明，样品二级质谱图中的碎片离子(m/z 563、255、113等) 均与OA和DTX1毒素的特征碎片离子一致，且样品碎片离子的测量质量与特征碎片离子的精确质量误差均在±1ppm以内。可以确定，制备所得产物为OA和DTX1。