一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及牡丹籽粕的综合利用技术，具体涉及一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法。

背景技术

牡丹籽油是由牡丹籽提取的富含不饱和脂肪酸的植物油，其营养成分主要包括油酸、α-亚麻酸、亚油酸、角鲨烯、维生素E等。因其营养丰富而独特，被称为“世界上最好的油，”是植物油中的珍品。牡丹籽粕是油用牡丹籽通过压榨法或CO

β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，广泛存在于各种植物油、果蔬、植物种子中，尤其在植物油中含量相对较高，其化学结构如附图1所示，属于四环三萜类化合物。此外，我国保健食品中较常见的40余种中草药，如杜仲、天冬、地黄、玄参等均有较高含量的植物甾醇，总量高达2.0 g/kg，其中β-谷甾醇是其主要的植物甾醇单体，占50%以上。目前，β-谷甾醇单体主要通过化学、物理方法提纯得到，具有较强的生理活性、极高的营养价值，广泛应用于医药、保健品、化妆品等领域。研究发现，β-谷甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、中枢神经系统等方面表现出良好的药理作用。随着对其生理活性研究的不断深入，β-谷甾醇的分离纯化及其潜在的药理活性研究成为热点。

现阶段，β-谷甾醇主要从植物油精炼的脱臭馏出物中提取混合植物甾醇，进而分离纯化，获得纯品。牡丹籽粕作为生产牡丹籽油后的加工副产物，在实际生产中，往往作为动物饲料或植物肥料等粗放的加以利用。目前，关于从牡丹籽粕中分离纯化β-谷甾醇的相关研究鲜有报道。因此，本发明提供一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，无论从社会经济价值、药用价值还是科研价值来看，都具有重要的意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，所述方法通过对各项操作步骤和参数进行调整和优化，从油用牡丹籽粕中有效提取到活性化合物β-谷甾醇，且步骤简单，提取产量高、纯度好。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：

（1）取牡丹籽经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃，干燥处理2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入丙酮进行超声萃取至少三次，收集合并的丙酮萃取液，减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏；

（2）采用甲醇溶解牡丹籽粕粗提物的浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用200～300目的正相硅胶；流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位；将合并后部位在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇。

优选地，步骤（1）中，所述牡丹籽采用油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”。

优选地，步骤（1）中，每100g籽粕，经干燥、粉碎后，加入150mL丙酮进行超声萃取，萃取三次，合并萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏。

有益效果：本发明综合β-谷甾醇和油用牡丹籽粕的性质，采用常规的薄层层析方法，通过对各项操作步骤和工艺参数进行调整和优化，从牡丹油用牡丹籽粕中有效提取到活性化合物β-谷甾醇，大大增加了油用牡丹的综合利用价值。采用本发明方法提取活性化合物β-谷甾醇，提取率为1.2%，经过气相质谱联用（GC-MS）分析鉴定，其纯度在90%以上。本发明方法简单，易于产业化，且成本低廉，为牡丹籽粕的废物深加工和高值化开发利用提供技术支撑。

附图说明

图1 活性化合物β-谷甾醇的化学结构式；

图2 本方法制取β-谷甾醇的流程图；

图3 标准品β-谷甾醇的薄层层析的结果；

图4 牡丹籽粕粗提物通过薄层层析的结果；其中，A为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析板在紫外356nm下的显色情况； B为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析板在碘蒸汽中的显色情况；

图5 牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的总离子流图；

图6 牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的质谱图。

具体实施方式

一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：

1、油用牡丹籽粕的前处理。

取油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”的牡丹籽，经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕100g，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃，干燥处理2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入150mL丙酮进行超声萃取三次后，收集合并的丙酮萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏5.6g。

2、β-谷甾醇的分离纯化。

取少量的甲醇多次溶解牡丹籽粕的粗体物浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用，正相硅胶的规格为200～300目；流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速为为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位，薄层板选用的规格为青岛海洋化工GF254；将合并后部位在在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇1.2g。如图3薄层层析板点板粗提物的结果。

3、β-谷甾醇的分析检测。

取少量冷冻干燥后获得的提纯化合物β-谷甾醇，溶于色谱级的正己烷中，置于气相质谱（GC-MS）进行成分分析和鉴定。仪器型号为安捷伦7890B-5977B：色谱条件:HP-5MS色谱柱(30mx0.25mmx0.25μm，美国安捷伦公司)，初始柱温120℃，以12℃/min程序升温至300℃，保持20min。进样口温度300℃，载气为高纯氦气(99.999%)，柱流量100mL/min，不分流，设置进样量为1.0uL。

质谱条件:电离方式为电子轰击离子源(El离子源)，电子能量70eV，质量扫描范围35~500u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度300℃，扫描方式为Scan，标准质谱图库NIST17。使用本发明的方法获得活性化合物β-谷甾醇，经过GC-MS分析鉴定，其纯度在90%以上。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：β-谷甾醇粗体物的获得

取油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”的牡丹籽，经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕100g，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃。考察干燥处理时间与水分的关系。设置干燥时间分别为1h、2h、3h、4h、5h。通过水分测定仪测定分析，考察不同干燥时间处理与牡丹籽粕的水分含量关系，结果如下表1所示。综合能耗成本和处理效率，最终确定干燥时间为2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入150mL丙酮，进行超声萃取三次后，收集合并的丙酮萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏5.6g。

表1. 不同干燥时间处理与牡丹籽粕的水分含量情况。

实施例2：β-谷甾醇的分离纯化

取少量的甲醇多次溶解牡丹籽粕的粗体物浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用，正相硅胶的规格为200～300目；配制不同比例组分的洗脱溶剂作为流动相进行实验，各种洗脱溶剂对β-谷甾醇的分离结果如表 2 所示，拖尾严重的现象说明此种流动相分离效果欠佳，Rf值在 0.30~0.60 之间比较合适。最终确定最佳的流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速固定为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位，薄层板选用的规格为青岛海洋化工GF254；将合并后部位在在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇1.2g。如图3为标准品β-谷甾醇的薄层层析的结果；如图4为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析的结果。

表2. 不同洗脱溶剂和比例作为流动相对β-谷甾醇分离的影响。

注：+表示拖尾且斑点可分辨；-表示不拖尾且斑点圆整清晰。

实施例3：β-谷甾醇纯度的验证

取少量冷冻干燥后获得的提纯化合物β-谷甾醇，溶于色谱级的正己烷中，置于气相质谱（GC-MS）进行成分分析和鉴定。仪器型号为安捷伦7890B-5977B：色谱条件:HP-5MS色谱柱(30mx0.25mmx0.25μm，美国安捷伦公司)，初始柱温120℃，以12℃/min程序升温至300℃，保持20min。进样口温度300℃，载气为高纯氦气(99.999%)，柱流量100mL/min，不分流，设置进样量为1.0uL。质谱条件:电离方式为电子轰击离子源(El离子源)，电子能量70eV，质量扫描范围35~500u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度300℃，扫描方式为Scan，标准质谱图库NIST17。使用本发明的方法获得活性化合物β-谷甾醇，经过GC-MS分析鉴定，其纯度在90%以上。如图5为牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的总离子流图；图6为牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的质谱图。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。