一种mRNA及含有mRNA的药物

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种mRNA，即含有该mRNA的药物。

背景技术

自身免疫性疾病是机体对自身产生抗体和发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。当某次细菌或病毒感染机体后，机体产生异常的免疫应答，将自身的某些组织、抗原、器官进行免疫应答。如类风湿关节炎，是对滑膜表面的某些成分反应，形成滑膜炎，进一步形成关节炎。如红斑狼疮，可能会出现皮肤表面抗原裸露，或肺部、肾脏等多器官的自身免疫紊乱。这些异常免疫反应可能会给人体带来自身免疫病，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、多肌炎、皮肌炎等。

如果人体自身免疫紊乱没有得到纠正，病情长期不能够达到很好的控制和缓解，会严重影响寿命，尤其是合并内脏损伤，存在肺部、肾脏及消化道、肝脏等脏器损害的情况。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷，本申请的目的在于提供一种mRNA，该mRNA在体内利用自身的原料和翻译机制合成β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，实现β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1对体内蛋白糖链结构的修饰作用。

本申请提供如下技术方案。

1.一种信使核糖核酸(mRNA)，其特征在于，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

2、根据项1所述的mRNA，其特征在于，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1由原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1去掉至少部分跨膜区所得，

优选所述原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

3、根据项2所述的mRNA，其特征在于，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

4、根据项1所述的mRNA，其特征在于，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1由原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1去掉至少部分跨膜区所得，

优选地，所述原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

5、根据项4所述的mRNA，其特征在于，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

6、根据项1所述的mRNA，其特征在于，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的融合蛋白，

优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:16(融合蛋白的序列)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:17(融合蛋白的序列)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

7、根据项1所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA还包含5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)。

8、根据项7所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA中从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)；

9、根据项8所述的mRNA，其特征在于，所述5’端帽子结构包括Cap-0、Cap-1、Cap-2，或

所述5’UTR、3’UTR序列独立地来源于天然蛋白、人工合成蛋白中的至少一种；优选地，所述天然蛋白包括α-球蛋白、β-球蛋白、热休克蛋白HSP70中的任意一种。

10、根据项1所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA为未修饰或经修饰的；优选地，所述修饰包括：假尿苷三磷酸修饰或N1-甲基假尿苷三磷酸修饰。

11、一种含有mRNA的组合物，其特征在于，包括脂质纳米颗粒和项1-10任一项所述的mRNA。

12、根据项11所述的组合物，其特征在于，所述mRNA包括第一mRNA和第二mRNA，所述第一mRNA为开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1；

所述第二mRNA为开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

13、根据项12所述的组合物，其特征在于，所述第一mRNA与所述第二mRNA的质量比为(0.1-10)：1。

14、根据项11所述的组合物，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合；

优选地，所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物SM-102的结构：

15、一种蛋白，其特征在于，所述蛋白包含项1～10任意一项所述mRNA编码得到的氨基酸序列。

16、一种编码项1～10任一项所述mRNA的DNA分子。

17、一种含有项16所述DNA分子的重组质粒。

18、一种mRNA药物，其特征在于，所述mRNA药物包含项1～10任一项所述mRNA、项11～14任一项所述含有mRNA的组合物、项15所述蛋白、项16所述DNA分子或项17所述重组质粒。

19、一种根据项1～10任一项所述mRNA，或项15任一项所述蛋白，或项16所述DNA分子，或项17所述重组质粒在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

20、如项19所述的用途，其特征在于，所述疾病为自身免疫性疾病，优选地，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、IgG4相关胰腺炎、胆管炎、肾脏疾病、自身免疫性血液系统疾病、自身免疫性皮肤病区牛皮癣、白癜风或自身免疫性血管系统疾病。

在本申请提供的mRNA，通过脂质纳米颗粒(LNP)系统进行递送，所述mRNA在体内利用自身的原料和翻译机制合成β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，从而实现β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1对体内蛋白糖链结构的修饰作用。

附图说明

图1为本申请提供的mRNA的蛋白表达实验图。

图2为本申请提供的mRNA的体外酶活实验图。

图3为本申请提供的mRNA的体内酶活实验图。

图4为本申请提供的mRNA的蛋白表达实验图。

图5为本申请提供的mRNA的蛋白表达实验图。

图6为本申请Cap-0,Cap-1和Cap-2的结构式图。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

自身抗体的存在是自身免疫病的核心特征，也是一些疾病诊断分类和治疗的关键性指标。近些年越来越多的研究表明自身免疫性疾病中自身抗体常常具有糖基化修饰异常的共同特征，这些糖链结构的变化会影响抗体与Fc受体结合、抗体介导的细胞免疫作用以及补体激活等过程。抗体糖基化可被视为将抗体从保护性转变为自身反应性并最终导致自身免疫性疾病的调控“开关”。靶向抗体糖链修饰可能将致病性的自身抗体转化为具有抗炎活性的抗体，以达到治疗自身免疫病的效果，而糖基转移酶在这其中可能起到至关重要的作用。本申请基于目前已报道的自身免疫病相关抗体糖基化改变的具体特征，设计并合成高效表达的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的mRNA，通过脂质纳米颗粒(LNP)系统进行递送，mRNA在体内利用自身的原料和翻译机制合成蛋白，实现β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1这些糖基转移酶对体内蛋白糖链结构的修饰作用，有望对所有抗体糖基化改变的疾病产生干预作用，包括但不限于自身免疫病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和IgA肾病等。

基于此，本申请提供一种mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。

β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1是7种β1,4-半乳糖基转移酶中的一种，通常存在于反式高尔基复合体中，可将半乳糖转移至寡糖。B4GALT1是独特的，因为它可作为膜结合形式或者分泌形式表达。分泌型只存在于哺乳期乳腺组织中，该酶和α-乳白蛋白形成一个异源二聚体，进而催化乳糖的合成。膜结合型存在于高尔基体中时，该酶添加半乳糖至N-乙酰葡糖胺残基，其存在于细胞表面时，在多种细胞与细胞、细胞与基质的相互作用过程中，该酶通过结合到对立细胞或细胞外基质的特定寡糖配体上，作为一个识别分子发挥作用。这两种酶形式产生于交替的转录起始位点和翻译后加工。B4GALT1缺失会导致2D型糖基化的先天失常。

α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1是一种II型跨膜酶，Weinstein等人(1987)观察到唾液酸转移酶的膜结合形式转化为可溶性形式，他们的结果表明，膜结合域不是酶活性所必需的，并且通过从大鼠肝脏纯化的ST6GALI蛋白的可溶性形式的氨基末端测序，推测出ST6GAL1的裂解位点在氨基酸残基63(Asn)和64(Ser)之间。后来，Kitazume-Kawaguchi等人(1999)根据COS细胞中表达的ST6GAL I的可溶性分泌形式的氨基末端测序表明，在氨基酸残基40(Lys)和41(Glu)存在一个裂解位点，并且在Kitazume-Kawaguchi及同事随后的研究工作中发现，ST6GAL1是由β-分泌酶BACE1处理的。Woodard-Grice等人(2008)报道在ST6GAL1的管腔区域氨基酸残基EFQ41-43处存在一个β-分泌酶(BACE1)的裂解位点，这导致ST6GAL1的分泌。

信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在、非天然存在或经修饰的氨基酸聚合物)的任何RNA，并且可经翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的蛋白质。本领域技术人员将了解，除非另有注明，否则本申请中所陈述的核苷酸序列可在代表性DNA序列中列举“T”，但在所述序列代表RNA(例如mRNA)时，“T”将由“U”取代。因此，由本文中的特定序列识别号公开并识别的任何DNA也公开与所述DNA互补的相应RNA(例如mRNA)序列，其中所述DNA序列的每个“T”被“U”取代。

开放阅读框(ORF)是以起始密码子(例如甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束的连续DNA或RNA区段。ORF通常编码蛋白质。

“同一性”是指如通过对序列进行比较所确定，两个或更多个多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性也指如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数所确定的序列间的序列相关性程度。同一性测量两个或更多个序列中较小序列之间的相同匹配的百分比，其中空位比对(如果存在)通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)寻址。相关抗原或核酸的同一性可通过已知方法容易地计算。“同一性百分比(％)”在应用于多肽或多核酸序列时被定义为在比对序列并引入空位(必要时)以达到最大同一性百分比后，候选氨基酸或核苷酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核苷酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)同一的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解，同一性取决于对同一性百分比的计算，但其值可因在计算中所引入的空位和罚分而有所不同。

在本申请中，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1由原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1去掉至少部分跨膜区所得，所述原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列。

具体地，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1由原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1去掉整个跨膜区所得。

具体地，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1由原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1去掉部分跨膜区所得，且去掉的部分是具有表达跨膜区的功能，剩下的跨膜区不影响蛋白分泌。

在一个具体实施方式中，所述原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述原始的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1含有核苷酸序列SEQ ID NO:9。

在本申请中，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列；

在一个具体实施方式中，所述截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1含有核苷酸序列SEQ ID NO:10。

在本申请中，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1由原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1去掉至少部分跨膜区所得，所述原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含SEQID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

具体地，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1由原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1去掉整个跨膜区所得。

具体地，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1由原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1去掉部分跨膜区所得，且去掉的部分是具有表达跨膜区的功能，剩下的部分不影响蛋白分泌。

在一个具体实施方式中，所述原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含与SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述原始的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1含有核苷酸序列SEQ ID NO:11。

在本申请中，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述截短后的α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1含有核苷酸序列SEQ ID NO:12。

在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1。

在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，且截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1的核苷酸序列与所述截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1核苷酸序列通过自剪切肽或者iRES序列连接。(通过所述mRNA可以翻译出两个蛋白)。

在一个具体实施方式中，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的融合蛋白。

具体地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:16(融合蛋白的序列)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；进一步地，所述融合蛋白含有核苷酸序列SEQ ID NO:18。

具体地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:17(融合蛋白的序列)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

具体地，所述融合蛋白含有核苷酸序列SEQ ID NO:19。

在本申请中，所述mRNA还包含5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。

具体地，在所述mRNA中从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。

在一个具体实施方式中，所述mRNA还包括KOZAK，且所述mRNA从5’端到3’端依次包括5’端帽子结构、5’非编码区(5’UTR)、KOZAK、开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺嘌呤尾(PolyA)。

KOZAK是位于真核生物mRNA 5'端帽子结构后面的一段核苷酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’端帽子结构的mRNA翻译起始。对应于原核生物的SD序列。

多聚腺嘌呤尾(PolyA)：是大多数真核生物mRNA 3’末端的尾巴，有助于调节mRNA的稳定性，运输和翻译。

5’UTR和3’UTR两者通常都从基因组DNA转录，并且是成熟前mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征(例如5’端帽子结构和多聚腺嘌呤尾(PolyA)通常是在mRNA加工期间添加至经转录(成熟前)的mRNA。

所述5’UTR、3’UTR序列独立地来源于天然蛋白、人工合成蛋白中的至少一种；优选地，所述天然蛋白包括α-球蛋白、β-球蛋白、热休克蛋白HSP70中的任意一种。

在本申请中，所述5’端帽子结构包括Cap-0、Cap-1、Cap-2或其他任何结构的帽子结构中的任意一种。

所述Cap-0,Cap-1和Cap-2的结构式如图6所示。

在本申请中，所述KOZAK包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

在本申请中，所述5’非编码区(5’UTR)包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。

在本申请中，所述3’非编码区(3’UTR)包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

在本申请中，所述多聚腺嘌呤尾(PolyA)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。

在本申请中，所述mRNA为未修饰或经修饰的；优选地，所述修饰包括：5-甲基胞苷三磷酸、假尿苷三磷酸修饰或N1-甲基假尿苷三磷酸修饰。

在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本申请公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如存在于所转录RNA中的那些残基(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本申请公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如dA、dG、dC或dT)。

在一些实施方案中，本申请公开的组合物包含具有编码β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的开放阅读框的RNA，其中核酸包含可为标准(未经修饰)或如本领域中所已知经修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可为经修饰的天然存在的核苷酸和核苷或经修饰的非天然存在的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域中所公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分处的那些修饰。

在一些实施方案中，本申请公开的经修饰的天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可尤其见于广泛认可的MODOMICS数据库中。

在一些实施方案中，本申请公开的经修饰的非天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的非天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可尤其见于如下已公开的美国申请第PCT/US2012/058519号；第PCT/US2013/075177号；第PCT/US2014/058897号；第PCT/US2014/058891号；第PCT/US2014/070413号；第PCT/US2015/36773号；第PCT/US2015/36759号；第PCT/US2015/36771号；或第PCT/IB2017/051367号，所有所述申请均通过引用并入本文。

因此，本申请公开的核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。

在一些实施方案中，本申请公开的核酸(例如DNA和RNA，例如mRNA)包含各种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。

在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的RNA(例如经修饰的mRNA)分别在所述细胞或生物体中表现出降低的降解。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的RNA(例如经修饰的mRNA)可分别在所述细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如降低的先天性反应)。

在一些实施方案中，核酸(例如RNA，例如mRNA)包含非天然修饰的核苷酸，其是在核酸的合成期间或合成后引入，以实现所需功能或性质。所述修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可利用化学合成或利用聚合酶在链末端或链中的任何其他位置处引入。核酸中的任何区域都可经化学修饰。

本申请公开提供了核酸(例如RNA，例如mRNA)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)的组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何可用方法(例如化学、酶促或重组地)来合成，以包括一个或多个经修饰或非天然的核苷。核酸可包含一个或多个连接的核苷区域。此类区域可具有可变的主链键联。所述键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，并且还涵盖在核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间(例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中)形成氢键。这种非标准碱基配对的一个实例是在经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入到本公开的核酸中。

在一些实施方案中，mRNA统一经修饰(例如完全修饰、贯穿整个序列中修饰)以获得特定修饰。例如，核酸可统一经1-甲基-假尿苷修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基均用1-甲基-假尿苷代替。类似地，可针对序列中所存在的任何类型的核苷残基对核酸进行统一修饰，其是通过用经修饰的残基(例如上文所陈述的那些残基)进行代替来实施。

本申请公开的核酸可沿着整个分子长度部分或完全地修饰。例如，在本公开的核酸中或在其预定序列区域中(例如在包括或不包括多聚(A)尾的mRNA中)，一个或多个或全部或给定类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一者或多者或全部)可统一经修饰。

在一些实施方案中，本申请公开的核酸中(或其序列区域中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。

核酸可含有约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。任何剩余的百分比是由存在未经修饰的A、G、U或C引起。

mRNA可含有最少1％且最多100％的经修饰核苷酸，或任何中间百分比，例如至少5％的经修饰核苷酸、至少10％的经修饰核苷酸、至少25％的经修饰核苷酸、至少50％的经修饰核苷酸、至少80％的经修饰核苷酸或至少90％的经修饰核苷酸。例如，核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。

在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)代替。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替，或者可由多种具有不同结构(例如2、3、4或更多种独特结构)的化合物代替。

在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)代替。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替。

本申请提供一种含有mRNA的组合物，包括脂质纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

mRNA不稳定，自身携带负电荷，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得mRNA分子难以穿过细胞膜进入细胞内，所以需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达。脂质纳米颗粒(lipidnanoparticle，LNP)因递送效率高和安全性好，成为目前最热门的递送技术。因此，将mRNA包裹在脂质纳米颗粒内制备成组合物。

具体地，所述mRNA包括第一mRNA和第二mRNA，所述第一mRNA为开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1；所述第二mRNA为开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

在一个具体实施方式中，所述mRNA为第三mRNA，所述第三mRNA为开放阅读框(ORF)可以同时编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，即通过所述第三mRNA可以编码得到两个蛋白，其分别为截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

在一个具体实施方式中，所述mRNA为第四mRNA，所述第四mRNA为开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的融合蛋白。

在一个具体实施方式中，含有mRNA的组合物，包括脂质纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1，即所述组合物包括脂质纳米颗粒和第一mRNA。

在一个具体实施方式中，含有mRNA的组合物，包括脂质纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，即所述组合物包括脂质纳米颗粒和第二mRNA。

在一个具体实施方式中，含有mRNA的组合物，包括脂质纳米颗粒和两种mRNA，一种所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，另一种所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1，即所述组合物包括脂质纳米颗粒、第一mRNA以及第二mRNA，优选地，所述第一mRNA与所述第二mRNA的质量比为(0.1-10)：1，例如可以为：0.1:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。

在一个具体实施方式中，含有mRNA的组合物，包括脂质纳米颗粒和mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1和截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1的融合蛋白，即所述组合物包括脂质纳米颗粒和第三mRNA或第四mRNA。

所述含有mRNA的组合物，使用时，将上述一种组合物或两种组合物分别注射到受试者体内，所述mRNA在体内利用自身的原料和翻译机制合成β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，从而实现β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1对体内蛋白糖链结构的修饰作用。

具体地，将本申请公开的RNA(例如mRNA)配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。

具体地，所述脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。例如：可电离脂质(DLin-MC3-DMA)：胆固醇：辅助脂质(DSPC)：聚乙二醇50:38.5:10:1.5。

具体地，所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物SM-102的结构：

本申请还提供一种mRNA的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：构建包含有目的基因ORF的载体；

在所述载体上，所述CMV启动子、T7启动子、非编码区5’UTR、目的基因ORF、非编码区3’UTR、polyA尾巴以及紧邻其后的线性化位点依次排布。

步骤二：将构建完成的载体进行扩增；

步骤三：将扩增后得到的载体进行转录和纯化，从而得到mRNA；

步骤四：所述目的基因编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和/或截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1。

CMV启动子是人们从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)中发现的强启动子，被广泛应用于构建高效真核表达载体。

T7启动子是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个启动子是原核表达的首选。T7启动子专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。

非编码区5’UTR是指位于起始密码子(即由核糖体翻译的mRNA转录本的第一个密码子)正上游(即5′)的不编码多肽的mRNA区域。当产生RNA转录本时，5’UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。

非编码区3’UTR是指位于终止密码子(即mRNA转录本中发出终止翻译信号的密码子)正下游(即3′)的不编码多肽的mRNA区域。

Poly(A)是大多数真核生物mRNA3’末端的尾巴，有助于调节mRNA的稳定性，运输和翻译。

线性化位点是Xhol酶切位点，Xhol限制性内切酶识别载体中5'C^TCGAG 3'序列，以产生线性化的DNA作为体外转录的模板。

本申请提供一种蛋白，所述蛋白包含前述的mRNA编码得到的氨基酸序列。

本申请还提供一种前述mRNA的DNA分子。

本申请还提供一种前述DNA分子的重组质粒。

本申请还提供一种前述mRNA，或前述蛋白，或前述DNA分子，或前述重组质粒在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途。所述疾病为自身免疫性疾病。

自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、IgA肾病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、IgG4相关胰腺炎、胆管炎、肾脏疾病、自身免疫性血液系统疾病、自身免疫性皮肤病区牛皮癣、白癜风、自身免疫性血管系统疾病如自身免疫性血管炎等。自身免疫性疾病经过早期规范化治疗，可以使相关检查指标趋于平稳，减轻临床症状，延缓相关脏器损害，提高生活质量。

进一步地，自身免疫组分的病因的炎性病况，如关节炎(例如类风湿性关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括涉及骨损失的炎性病况和风湿性疾病，炎性疼痛，脊椎关节病(spondyioarhropathies)包括强直性脊椎炎，赖特综合征，反应性关节炎，银屑病关节炎，和enterophathics关节炎，超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)和变态反应。本申请所述的含有mRNA的组合物可应用的特定的自身免疫疾病包括自身免疫性血液学病症(包括例如溶血性贫血，再生障碍性贫血，纯红细胞性贫血和特发性血小板减少)，获得性血友病A，冷凝集素疾病，冷球蛋白血症，血栓性血小板减少性紫癜，干燥综合征，系统性红斑狼疮，炎性肌肉病症，多发性软骨炎，硬皮病，脉管炎如冷球蛋白血症，大血管血管炎，如巨细胞动脉炎，风湿性多肌痛，坏死性血管炎，包括抗嗜中性白细胞胞质抗体相关性脉管炎，Takayasu’s动脉炎，结节性多动脉炎，Henoch-Schonlein紫癜，和丘-斯综合征，IgM介导的神经病，血清阴性spondarthritis，斜视眼阵挛-肌阵挛综合征，韦格纳肉芽肿病，皮肌炎，抗嗜中性白细胞胞质自身抗体(ANCA)脉管炎，慢性活动性肝炎，重症肌无力，银屑病，Steven-Johnson综合征，寻常性天疱疮，落叶型天疱疮，特发性口炎性腹泻，内分泌性眼病，格雷夫斯病，结节病，多发性硬化，视神经脊髓炎，原发性胆汁性肝硬化，幼年型糖尿病(I型糖尿病)，眼色素层炎(前、中和后以及全葡萄膜炎)，干燥性角膜结膜炎和春季角结膜炎，肺间质纤维化，银屑病关节炎和肾小球肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)，急性肾炎狼疮，肿瘤，皮肤和角膜的炎性疾病，肌炎，骨植入物松动。

本申请还提供一种mRNA药物，所述mRNA药物可包括编码相同或不同物种的两种或更多种糖基转移酶的RNA或多种RNA。

在一些实施方案中，所述RNA可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种糖基转移酶。

在一些实施方案中，可将两种或更多种编码糖基转移酶的不同RNA(例如mRNA)配制在同一脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，可将两种或更多种编码糖基转移酶的不同RNA配制在单独脂质纳米颗粒中(每个RNA配制在单一脂质纳米颗粒中)。

本申请提供一种药物制剂，其为用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物中的自身免疫疾病的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。本文所提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。其可用于药物中以预防和/或治疗自身免疫疾病。

在一些实施方案中，可将含有如申请所阐述的RNA的药物制剂施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，并且RNA多核苷酸在体内翻译以产生各种糖基转移酶。

药物或组合物(例如包含RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如长度、核苷酸组成和/或经修饰核苷的程度)、药物的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供经诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的糖基转移酶的产生而变化。

在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同糖基转移酶相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。增加的糖基转移酶产生可通过以下来证明：细胞转染增加(经RNA转染的细胞百分比)、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加。

术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体的诊断性或治疗性用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者后或施用给受试者时不会引起不希望的生理学效应。药物组合物中的载体也必须在与活性成分相容并且可能够使其稳定的意义上为“可接受的”。可利用一种或多种增溶剂作为用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。其他适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于Remington'sPharmaceutical Sciences中。

在一些实施方案中，本申请公开的组合物(包含多核苷酸和其编码的糖基转移酶)可用于治疗或预防自身免疫疾病。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性地或治疗性地施用给健康个体，或在患病期间施用。

在一些实施方案中，向细胞、组织或受试者提供的RNA量可为有效用于免疫预防的量。

组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或第二活性成分。本申请的药剂或组合物的初始施用与施用其他预防性组合物之间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在示例性实施方案中，本申请的组合物的初始施用与其他预防性或治疗性化合物之间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。

本申请提供了药物组合物，其包括RNA和/或任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的复合物。

RNA可单独或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可包含其他组分，包括(但不限于)佐剂。

在一些实施方案中，免疫组合物不包括佐剂(其不含佐剂)。RNA可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。

在一些实施方案中，本申请的药物或组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或二者的组合。

在一些实施方案中，将本申请的组合物施用给人类、人类患者或受试者。

本文所阐述药物或药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后在必要时和/或需要时，将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元。

根据本申请公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、体型和/或疾患并且进一步取决于待施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％至30％之间、介于5％至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。

在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制RNA，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如靶向至特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码糖基转移酶在体内的翻译；和/或(6)改变所编码糖基转移酶在体内的释放曲线。除传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂以外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质粒、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、经RNA转染的细胞(例如用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和它们的组合。

在一些实施方案中，本申请的组合物用于提供针对自身免疫疾病的预防性保护。

在一些实施方案中，本申请的组合物用于治疗自身免疫疾病。

在一些实施方案中，本申请的组合物用于启动对受试者体内抗体糖链结构的修饰。受试者可为任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。通常，受试者是人类受试者。

在一些实施方案中，将本申请的药物以有效量施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，使编码糖基转移酶(β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1)的RNA在体内表达并翻译以产生糖基转移酶，其随后对受试者体内抗体糖链结构进行修饰。

在施用本申请公开的组合物(例如RNA药物)后，可实现针对自身免疫疾病的治疗。可将药物施用一次、两次、三次、四次或更多次，可根据需要相应地调整给药。

本申请还提供了在受试者中治疗自身免疫疾病的方法，其是通过向所述受试者施用具有编码糖基转移酶的开放阅读框的RNA来实施，其中所述RNA不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物共配制或共施用。mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物可通过产生治疗有效结果的任何途径来施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本申请公开提供了包括向有需要的受试者施用mRNA制剂或含有mRNA的药物组合物的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。通常以剂量单位形式配制RNA以便于施用和统一剂量。然而，应理解，RNA的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。

如本申请所提供的RNA的有效量可低至5μg，例如作为单一剂量或作为两个2.5μg剂量施用。

在一些实施方案中，有效量为5μg-300μg或25μg-300μg的总剂量。例如，有效量可为5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。

在一些实施方案中，有效量为5μg的总剂量。

在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量。

在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。

在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。

在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。

可将本申请所阐述的RNA配制成本申请所阐述的剂型，例如鼻内、气管内或可注射的(例如静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。

“治疗”在本文中定义为向受试者应用或施用本申请的mRNA，或施用包含本申请的所述mRNA的药物组合物，其中受试者具有自身免疫病、与自身免疫病相关的症状或发展出自身免疫病的素质，其中目的是预防、治愈、治疗、减轻、缓解、改变、恢复、缓和、改良或影响自身免疫病、与自身免疫病相关的任何症状或发展出自身免疫病的素质。

实施例

本申请在实施例中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1mRNA的制备(mRNA中的开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1)

A：构建包含有目的基因ORF的载体(目的质粒)

将CMV启动子(核苷酸序列SEQ ID NO:21)、T7启动子(核苷酸序列SEQ ID NO:20)、非编码区5’UTR(核苷酸序列SEQ ID NO:7)、目的基因ORF(目的基因中具有编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1的基因(核苷酸序列SEQ ID NO:10))、3’UTR(核苷酸序列SEQ IDNO:8)、polyA尾巴(核苷酸序列SEQ ID NO:5)以及紧邻其后的线性化位点嵌入质粒，形成目的质粒，并构建含有目的质粒的大肠杆菌(质粒为由擎科生物科技有限公司合成的商业化质粒，含有目的质粒的大肠杆菌由擎科生物科技有限公司构建)。

B：模板质粒的提取：

将穿刺菌(购买自擎科生物科技有限公司)、含有目的质粒的大肠杆菌加至含Kan+抗性的液体LB培养基中，37℃，250rpm/min培养12～15h后离心收集细胞，并利用商业化的质粒提取试剂盒提取扩增的质粒，从而得到模板质粒。

C：模板质粒的线性化：

模板质粒的线性化酶切位点选择紧邻PolyA尾的XhoI或XbaI，线性化程度通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测，线性化的质粒DNA通过PCR产物回收试剂盒回收，DNA浓度和质量通过NanoDrop超微量核酸仪测定OD260/OD230和OD260/OD280的值。

D：mRNA的体外转录合成：

体外合成RNA(invitro transcription,IVT)是以含有T7启动子或SP6启动子序列(核苷酸序列SEQ ID NO:22)的DNA(线性化质粒或PCR产物)为模板，在T7或SP6 RNA聚合酶的作用下，以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，并通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。

mRNA的加帽工艺可采用共转录加帽或转录后加帽，加尾工艺可采用模板转录加尾或转录后酶法加尾。在本方案中，我们加帽和加尾方法优选共转录加帽和模板加尾。在共转录加帽中，将帽类似物直接添加到IVT中，它们通过具有松弛底物特异性的RNA聚合酶在5'-末端掺入直接产生相应的5'-加帽的mRNA。由于帽类似物缺乏游离的5'-三磷酸，因此在IVT期间不会发生帽类似物的内部掺入。在实施中，5’帽结构为m7GpppN，即为cap1，其来源于Trilinker公司的

具体转录反应按照下面表格的各成分配比设置，步骤依次为：(1)加入RNase freewater和NTPs；(2)加入

表1 mRNA体外转录反应各成分配比表

实施例2

实施例2的mRNA与实施例1的mRNA的区别在于，mRNA中的开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，操作步骤同实施例1，但是其中目的基因ORF(目的基因中具有编码α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1的核苷酸序列SEQ ID NO:12)。

实施例3

实施例3的mRNA与实施例1的mRNA的区别在于，mRNA中的5’UTR的核苷酸序列替换为SEQ ID NO:13，操作步骤同实施例1。

实施例4

实施例4的mRNA与实施例1的mRNA的区别在于mRNA中的开放阅读框(ORF)编码截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1，即开放阅读框(ORF)编码截短后的B4ST6融合蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO:18)。操作步骤同实施例1。

具体步骤如下：

A：构建包含有目的基因ORF的载体(目的质粒)

将CMV启动子、T7启动子、非编码区5’UTR、目的基因ORF(目的基因中具有编码截短后β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1的基因，以及随后的linker序列GGGSGGGSGGGS和截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1基因序列)、3’UTR、polyA尾巴以及紧邻其后的线性化位点嵌入质粒，形成目的质粒，并构建含有目的质粒的大肠杆菌(质粒为由擎科生物科技有限公司合成的商业化质粒，含有目的质粒的大肠杆菌由擎科生物科技有限公司构建)。

实施例5

实施例5的mRNA与实施例4的mRNA的区别在于，本实施例的mRNA中的开放阅读框(ORF)编码截短后α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL11和截短后的β1,4-半乳糖转移酶B4GALT1的序列顺序相反，即在本实施例中，开放阅读框(ORF)编码截短后的ST6B4融合蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO:19)。操作步骤同实施例4。

对比例1

对比例1的mRNA与实施例2的mRNA的区别在于，mRNA中的开放阅读框(ORF)编码全长α2,6-唾液酸转移酶ST6GAL1(核苷酸序列SEQ IDNO:11)。操作步骤同实施例1。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，mRNA中的开放阅读框(ORF)编码全长唾液酸酶NEU1(氨基酸序列SEQ ID NO:14，核苷酸序列SEQ ID NO:23)。操作步骤同实施例1。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，mRNA中的开放阅读框(ORF)编码截短的唾液酸酶NEU1(氨基酸序列SEQ ID NO:15，核苷酸序列SEQ IDNO:24)。截短的唾液酸酶NEU1的氨基酸序列删去NEU1的自身N端47个氨基酸的序列，更换tPA信号肽序列。操作步骤同实施例1。

实施例6含有mRNA的组合物(LNP-mRNA)

A、LNP包裹

1)将可电离脂质(DLin-MC3-DMA)、胆固醇、辅助脂质(DSPC)、聚乙二醇按照50:38.5:10:1.5的比例溶于无水乙醇中，总浓度为10mg/ml，构成有机相。

2)将实施例1制备的B4GALT1 mRNA和实施例2制备的ST6GAL1mRNA以摩尔比1：1混合。

3)将混合好的mRNA以0.15mg/ml的总浓度溶于柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH 4)中，构成水相。

4)将有机相与水相按1：3的比例，以12ml/min的速度使用微流控设备(迈安纳快速纳米制备系统)混匀得到LNP-mRNA混合液。

5)将LNP-mRNA混合液使用无菌PBS(10mM，pH 7.2)稀释，并转移至预灭菌的

6)收集超滤后的样品过滤，短期-4℃保存；长期保存则置换成冻存液-80℃保存。

B、LNP的粒径和均一度测定

LNP的粒径和均一度测定采用动态光散射仪(DLS)测定。具体操作为，在无菌PBS中以1:100的比例再次稀释浓缩样品，使用HORIBA-SZ100设备在25°和90°的分散角下进行，重复三次，得到LNP的粒径分布和PDI值(Polymerdispersityindex，聚合物分散性指数)。

C、包封率测定

mRNA的包封率采用Quant-iT

包封率(％)＝(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量

测定方法：

1)在TE(Tris-EDTA)缓冲液中制备不同浓度(即1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0ng/mL)的rRNA标准溶液。

2)待测LNP-mRNA溶于TEbuffer制成约250ng/mLmRNA的样品。类似的样品也在补充有Triton-X100表面活性剂(0.5％)的TE缓冲液中制备。

3)将100μL每个样品(包括标准溶液和LNP-mRNA样品)加入96孔板的微孔中。

4)添加100μL 1:200稀释的Ribogreen试剂。

5)在黑暗和室温下培养5分钟后，使用Cytation 3(Biotek，Winooski，VT，USA)记录荧光强度，分别在485和528nm处应用激发和发射。从分散在TE和TE/Triton-X100中的LNP-mRNA样品中获得的荧光理论上分别归因于游离(未包封)和总mRNA。

6)使用标准溶液绘制的标准曲线用于将荧光强度转换为浓度，根据公式计算封装效率，利用标准曲线计算包封率。

结果如表2。

表2

实施例7蛋白表达实验

通过蛋白表达实验验证实施例1-实施例5以及对比例1-对比例3制备的mRNA能否在细胞层面进行翻译表达，以及能否分泌到细胞外。

通过脂质体法将外源mRNA(实施例1-实施例5以及对比例1-对比例3制备的mRNA)导入293T细胞，24h、48h后收集细胞及上清，通过westernblot检测细胞内蛋白表达以及蛋白的分泌情况。

A：细胞培养

将10cm培养皿中的293T细胞进行消化，离心后用1mL DMEM培养基重悬，取一个六孔板进行种板，根据细胞的生长快慢，确定细胞的接种密度；每个孔内添加2mL含10％血清和1％双抗的DMEM培养基。37℃CO

试剂

Lipofectamine 2000转染试剂、

Opti-MEM Medium、

1X TBST溶液、

5％BSA溶液(2.5gBSA溶解到50mLTBST中)、

HRP标记的Anti-His抗体(以1:10000比例稀释到5％BSA溶液中)、HRP标记的Anti-Flag抗体(以1:10000比例稀释到5％BSA溶液中)、

Anti-GAPDH(以1:10000比例稀释到5％BSA溶液中)，Goat anti Mouse IgG抗体(以1:10000比例稀释到5％BSA溶液中)。

B：转染

1)准备转染液，以六孔板一个孔的量为例：

A液：用125μl Opti-MEM稀释3μl lipo2000。

B液：用125μl Opti-MEM稀释2.5μg mRNA。

2)将B液全部加入至A液中，轻轻混匀，室温静置10min。

3)将转染混合液均匀滴加到孔中轻轻混匀，放37℃CO

C：WesternBlot

1)电泳上样样品准备

吸取六孔板中上清，离心，取一部分上清液加入5x loading buffer，95-100℃金属浴10min。

培养的细胞经PBS漂洗后，吸净PBS，每孔加入150μl裂解液，在冰上用细胞刮板刮取细胞，将细胞及裂解液温和地转移至离心管中，95-100℃金属浴10min。

2)上样电泳

蛋白上样10μl。

预制胶：金斯瑞ExpressPlus

3)转膜

PVDF膜，使用前用无水甲醇浸泡；在转膜装置上从负极到正极放置海绵垫片、胶、膜、海绵垫片。

转膜仪：eBlotL1快速湿转仪。

4)封闭

5％BSA溶液室温封闭2h；

封闭完成后用TBST清洗三次，每次5min。

5)一抗孵育

ST6GAL1用1:10000的HRP标记Anti-His孵育1h；

B4GALT1用1:10000的HRP标记Anti-Flag孵育1.5h；

B4ST6融合蛋白用1:10000的HRP标记Anti-His孵育1h；

ST6B4融合蛋白用1:10000的HRP标记Anti-Flag孵育1.5h；

NEU1用1:10000的HRP标记Anti-His孵育1h；

用TBST清洗三次，每次5min。

6)底物孵育

BIO-RAD ClarityWestern ECL Substrate，A液：B液＝1:1，现配现用。

7)结果分析和检测

凝胶成像系统检测。

8)抗体清除15min。

9)封闭。

10)内参蛋白(Anti-GAPDH)孵育1h，TBST清洗三次，每次5min。

11)羊抗鼠二抗孵育1h，TBST清洗三次，每次5min。

12)底物孵育，凝胶成像系统检测。

实验结果如图1、图4以及图5所示，由图1可知，实施例1制备的B4GALT1 mRNA以及实施例2制备的ST6GAL1 mRNA均比对比例1制备的ST6GAL1 mRNA和实施例3制备的更换5’UTR制备的B4GALT1 mRNA的分泌效果好，而且实施例1制备的B4GALT1 mRNA以及实施例2制备的ST6GAL1 mRNA均能在293T细胞中表达并分泌到细胞外。

如图4所示，实施例4制备的含有B4ST6融合蛋白基因的mRNA比实施例5制备的含有ST6B4融合蛋白基因的mRNA表达效果好，而且通过实施例4的mRNA制备的B4ST6融合蛋白能在293T细胞中表达并分泌到细胞外。

由图5可知，无论是否进行截短含有NEU1基因的mRNA均只在细胞内表达，无法分泌到细胞外。我们也未测到上清液中的唾液酸酶活性(数据未展示)，因此表明并非所有的酶都能通过该本申请中所述的截短方式实现蛋白分泌表达。

实施例8体外酶活实验

通过体外酶活实验检测细胞分泌出来的糖基转移酶的活性。

A：细胞培养

将10cm培养皿中的293T细胞进行消化，离心后用1mL DMEM培养基重悬，取一个六孔板进行种板，根据细胞的生长快慢，确定细胞的接种密度；每个孔内添加2mL含10％血清和1％双抗的DMEM培养基。37℃CO

B：糖基转移酶mRNA转染

1)换液，六孔板中培养基换成无血清培养基；

2)准备转染液，以六孔板一个孔的量为例：

A液：用125μl Opti-MEM稀释3μl lipo2000。

B液：用125μl Opti-MEM稀释2.5μg mRNA(实施例1以及实施例2制备的mRNA)。

3)将B液全部加入至A液中，轻轻混匀，室温静置10min。

4)将转染混合液均匀滴加到孔中轻轻混匀，放37℃CO

5)48h后，吸取上清液，离心，第一遍超滤(浓缩)，第二遍超滤(置换Buffer)；获得浓缩的含糖基转移酶的上清液。

C：产生去唾液酸化/去半乳糖基化的胎球蛋白

1)去唾液酸化：每100ug胎球蛋白与2μl sialidaseA在37℃过夜反应。

2)去半乳糖基化：去唾液酸化胎球蛋白与β-半乳糖苷酶(110u/mg)在37℃过夜反应。

3)对照组反应：

F1’：胎球蛋白与等体积PBS均匀混合

F2’：F1’与等体积PBS均匀混合

D：试剂准备

5x SialylationBuffer(750mMNaCl，100mM HEPES，PH7.4)、

5x Galactosylation Buffer(100mM HEPES，120mM NaCl，20mM MnCl2，pH7.2)、

CMP-SA：100mM、

UDP-Gal：100mM、

Carbo-free Blocking Solution、

生物素化的凝集素SNA(以1:4000稀释到PBS中)、

生物素化的凝集素ECL(以1:4000稀释到PBS中)、

HRP-streptavidin(以1:10000比例稀释到PBST中)、

E：实验方法

1)评估B4GALT1的半乳糖基转移酶活性：在37℃条件下，将去唾液酸化、无乳糖化的胎球蛋白与5mM UDP-Gal以及含B4GALT1酶的浓缩上清液在1x GalactosylationBuffer中孵育过夜。

2)评估ST6GAL1的唾液酸转移酶活性：去唾液酸化胎球蛋白在37℃下与5mM CMP-SA以及在1x SialylationBuffer中孵育过夜。

3)LectinBlot

以ST6GAL1酶活为例：

上样5μl；

转膜(用无水甲醇预先浸泡的PVDF膜)；

1x Carbo-free Blocking Solution室温封闭2h；

一抗孵育：生物素化凝集素SNA室温孵育1h；PBST清洗三次；

二抗孵育：HRP-streptavidin室温孵育1h；PBST清洗三次；

发光底物孵育；

凝胶成像系统检测。

F1为胎球蛋白+CMP-SA+sialylationbuffer+水。

F2为胎球蛋白+UDP-Gal+galactosylationbuffer+水。

ASF为sialidaseA处理的胎球蛋白(去唾液酸化)。

AGF为β-半乳糖苷酶处理的ASF(去半乳糖化)。

ASF+SST6-10：ASF与10μl ST6GAL1浓缩上清反应

AGF+B4-1：AGF与1μl B4GALT1浓缩上清反应

F1+SST6-1：胎球蛋白+CMP-SA+sialylationbuffer+水+1μl SST6

实验结果如图2所示，实施例1以及实施例2制备的B4GALT1 mRNA和ST6GAL1 mRNA通过体外酶活实验均能测到各自的糖基转移酶活性。

实施例9体内酶活实验

通过体内酶活实验检测LNP包裹的糖基转移酶mRNA(实施例6制备的mRNA组合物)注射进体内能否表达出有活性的糖基转移酶。

A：材料准备

动物：DBA/1小鼠

试剂：

mRNA-LNP：将实施例1制备的B4GALT1 mRNA和实施例2制备的ST6GALmRNA等量混合，包裹LNP、

5x SialylationBuffer(750mMNaCl，100mM HEPES，PH7.4)、

5x Galactosylation Buffer(100mM HEPES，120mM NaCl，20mM MnCl2，pH7.2)、

CMP-SA：100mM、

UDP-Gal：100mM、

Carbo-free Blocking Solution、

生物素化的凝集素SNA(以1:4000稀释到PBS中)、

生物素化的凝集素ECL(以1:4000稀释到PBS中)、

HRP-streptavidin(以1:10000比例稀释到PBST中)。

B：实验方法

1)将mRNA-LNP(约15μg)尾静脉注射到小鼠体内，24h、48h后采血，分离血清。

2)LectinBlot

以ST6GAL1体内酶活为例：

a：上样5μl去唾液酸化胎球蛋白(ASF)；

b：转膜(用无水甲醇预先浸泡的PVDF膜)；

c：1x Carbo-free Blocking Solution室温封闭2h，PBS清洗三次；

d：PVDF膜与血清以及100uM CMP-SA在1x SialylationBuffer中室温孵育过夜；PBST清洗三次；

e：一抗孵育：生物素化凝集素SNA室温孵育1h；PBST清洗三次；

f：二抗孵育：HRP-streptavidin室温孵育1h；PBST清洗三次；

g：发光底物孵育；

h：凝胶成像系统检测。

结果如图3所示，LNP包裹的糖基转移酶mRNA注射进体内能表达出有活性的糖基转移酶。血清中的两种糖基转移酶活性明显提高。

尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

SEQ ID NO:1：

MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:2：

GRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLV

GPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNV

GFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLV

FRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:3：

MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:4：

EFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:6：GCCACC

SEQ ID NO:16：

GRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPSGGGSGGGSGGGSEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:17：

EFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHCGGGSGGGSGGGSGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTP