一种具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂及其制备方法和制药应用

技术领域

本发明生物医药技术领域，涉及靶向mTOR的纳米催化剂及其制备方法和作为缓解NASH进展药物的应用，具体涉及一种具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂及其制备方法和制药应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤疾病，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌。目前NAFLD呈全球流行趋势，是日益增长的肝硬化和肝癌的原因之一，已成为全球公认的第一大慢性肝病。据文献报道，NAFLD全球患病率为25.24％，且患病率逐年增加。心血管疾病、恶性肿瘤和肝硬化失代偿是引起NAFLD患者死亡的常见原因。尽管存在迫切的医疗需求，但迄今为止尚未有药物获批用于NASH的治疗，NASH药物研发迫在眉睫。

现阶段NASH被广泛接受的病理解释是多重打击假说，肝细胞的第一次打击是由于高脂肪饮食导致的，高脂肪膳食直接提供大量游离脂肪酸(FFA)到肝脏，新陈代谢碳水化合物导致由乙酰辅酶A合成多余的游离脂肪酸。同时机体消耗过多的葡萄糖也可通过激活碳水化合物反应生成游离脂肪酸，促进肝脂肪的生成。肝内脂质代谢异常，脂质的大量堆积启动了肝细胞内过氧化应激、内质网应激等多个环节并且激活了肝细胞内的炎症级联反应。血浆中升高的游离脂肪酸流入肝脏，异位脂肪堆积促进肝细胞因子分泌增加，糖异生增加，从而抑制胰岛素信号传导，减少糖原的产生。由脂肪增多而导致的胰岛素抵抗则形成了肝脏NASH发生机制中的第二次打击。肝脏在经历二次打击后出现了微循环的障碍，不断增加的血浆游离脂肪酸进一步引起组织脂质代谢紊乱，随着病情的发展，肝细胞损伤促进脂肪性肝炎、肝细胞的氧化坏死、肝细胞应激凋亡、线粒体功能障碍以及内质网应激，最终激活肝星状细胞(HSC)，胶原沉积而导致肝纤维化、肝细胞缺血和坏死、肝小叶的重建进而导致肝硬化，这些被称为NASH的第三次打击。目前研发企业在选取靶点时基本是从代谢、炎症、纤维化三个方面入手，其中代谢类靶点又可细分为脂类、葡萄糖、胆酸类三个靶点，炎症靶点包括氧化应激、炎症和免疫系统多方面的靶点。虽然NASH药物可供选择的靶点多，针对NASH的治疗新型化合物，已经有多个进入到II/III期临床阶段；其中奥贝胆酸(Obeticholicacid)已经进入到III期临床阶段，但该药高剂量组仅对23％的患者肝纤维化具有改善作用，仅较安慰剂组提高了10％，且副作用明显，如瘙痒反应较为严重，部分患者还出现严重的心血管事件。此外，当前在降低肝脏脂质损伤方面，并没有特别有效的药物。已有的辅助药物如改善胰岛素抵抗的药物、调节脂质代谢、减少肝脏脂质沉积药物、抗氧化、抗炎药物等对肝脏脂质损伤的治疗效果较弱且特异性不高。mTOR与NASH的发生发展有关。研究表明，肝脏中脂肪酸积累导致的脂毒性激活mTORC1，从而促进肝脏脂肪变性。mTORC1促进代谢重编程会加速肥胖相关肝癌的发生发展。此外，通过选择性抑制小鼠中的mTORC1信号传导，促进肝脏中TFE3的激活而不影响其他mTORC1靶标，可延缓NAFLD和NASH的发生发展。mTOR的激活依赖于其2446位丝氨酸位点的磷酸化修饰。

然而目前针对mTOR现有的抑制剂存在细胞毒性、全身代谢紊乱等副作用。因此，副作用小、靶向性高的mTOR抑制剂亟待解决。纳米材料凭借其独特的物理化学性质在医学造影、细胞内待测物质的检测、药物的靶向投递等方面发挥着巨大作用。肝脏截留大多数纳米颗粒的生理特点是纳米生物材料靶向肝脏的天然优势。铈基纳米酶具有天然的磷酸二酯酶活性，可对多种蛋白发挥去磷酸化作用。然而，目前尚缺乏铈基纳米酶与mTOR及NASH的相关报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂及其制备方法和制药应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂的制备方法，包括：在搅拌条件下，将硝酸铈铵水溶液加入植酸水溶液中，充分搅拌均匀，抽滤、清洗，分离得到CePA材料，将CePA材料用缓冲液配制浓度为40～60mg/mL，制得具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂。

优选地，硝酸铈铵水溶液是将10～15g六水合硝酸铈铵溶于200mL纯水中制得。

进一步优选地，六水合硝酸铈铵与植酸的质量比为10～15:8。

优选地，控制硝酸铈铵水溶液加入的流速为5～8mL/min。

优选地，采用PBS缓冲液将CePA材料分散至浓度为40～60mg/mL。

本发明还公开了采用上述的制备方法制得的具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂，该具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂为靶向mTOR的纳米催化剂，粒径为30～50nm。

本发明还公开了上述的具有多孔纳米结构的mTOR抑制剂在制备治疗/预防非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。

优选地，所述的药物为通过抑制mTOR分子的磷酸化水平发挥抗炎及调节脂代谢的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过水相合成获得了靶向mTOR的纳米催化剂即多孔植酸铈纳米颗粒，植酸与铈离子配位形成的植酸铈纳米颗粒带有大量的Ce

本发明制备的靶向mTOR的纳米催化剂即CePA可靶向伴有脂代谢紊乱和炎症的肝脏组织、并进入肝细胞内，通过抑制mTOR分子的磷酸化水平，发挥抗炎及调节脂代谢的作用，降低肝组织内炎症水平和脂质沉积，并缓解肝脏组织的纤维化程度。因此，CePA可同时通过发挥代谢重编程和免疫微环境重塑两方面的作用，起到抑制NASH进展的目的。由此可推断，该产品对mTOR信号的抑制作用同样可应用于由mTOR过度激活引起的其他病理学改变及异常的治疗过程。

附图说明

图1为本发明制备的CePA的TEM图；

图2为CePA的X射线光电子光谱图；

图3为比表面积分析图；

图4为CePA在消化液中结构稳定的电镜图；

图5为小鼠经不同处理后，体内主要脏器的HE染色结果图；

图6为CePA与mTOR蛋白结合的空间构象图；

图7为CePA显著降低肝细胞内mTOR的磷酸化水平的免疫印迹结果图；

图8为CePA处理显著降低了mTOR与其上游信号Akt以及mTOR相关调控蛋白的相互作用的CoIP结果；

图9为CePA抑制脂肪酸在肝细胞内积累的油红染色图；

图10为CePA抑制脂肪酸合成相关基因表达；其中，a为srebp1；b为acc；c为fasn；

图11为CePA抑制促炎因子的产生，并促进抗炎因子的产生；其中，a为IL-1；b为IL-6；c为IL-10；d为TGF-β；

图12为观察CePA对经炎症刺激因子处理后的巨噬细胞分化及吞噬能力的影响；

图13为使用mTOR抑制剂后进一步验证CePA是通过mTOR通路来影响肝细胞脂肪酸合成及巨噬细胞炎症因子释放的基因表达图；其中，a为srebp1；b为acc；c为fasn；d为acly；e为iNOS；f为IL-6；g为IL-10；h为TGF-β；

图14为喂养含CePA高脂饲料的小鼠及单纯高脂老鼠的蛋白组及转录组检测PCA图；其中a为蛋白组检测的PCA结果图；b为转录组检测的PCA结果图；

图15为组学数据结果图；其中a为CePA抑制脂合成代谢水平和炎性应答水平；b为CePA降低mTOR信号水平的GSEA分析；c为CePA降低mTOR信号水平的热图；

图16为喂养含CePA高脂饲料的小鼠相比高脂饮食鼠肝功有所改善；其中，a为ALT水平；b为AST水平；

图17为喂养含CePA高脂饲料的小鼠相比高脂饮食鼠脂质水平和血糖水平有所改善；其中，a为CHO水平；b为血糖水平；

图18为喂养含CePA高脂饲料的小鼠肝脏脂肪变性及炎症状况明显改善的HE染色图及统计图；其中，a为HE染色结果图；b为NAS评分统计图；c为肝组织气球样变统计图；d为炎症病灶统计图；e为脂肪变性统计图；

图19为喂养含CePA高脂饲料的小鼠脂质累积情况明显改善的肝组织油红染色图；其中，a为油红染色图；b为油红染色统计结果图；

图20为肝组织脂肪酸合成相关分子表达结果图，喂养含CePA高脂饲料的小鼠脂肪酸合成相关分子表达减少；其中，a为srebp1；b为acc；c为fasn；

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明制备了一类由铈离子与植酸分子构成的具有多孔纳米结构的药物植酸铈(CePA)。

将12.4g六水合硝酸铈铵溶于200mL纯水中，随后将硝酸铈铵水溶液在搅拌状态下滴加到植酸水溶液中(含有8g植酸)，控制硝酸铈铵水溶液的流速为5mL/min。硝酸铈铵水溶液滴加结束后再继续搅拌12h，之后用抽滤装置清洗分离获得的CePA材料，最后用PBS缓冲液分散CePA浓度至50mg/mL，4℃储存待用。

肝脏中的异常脂肪堆积或沉积(肝脂肪变性)、肝脏炎症和肝损伤或肝组织损伤(肝纤维化)是NASH的特征。在NASH的发生发展过程中，肝脏组织产生大量炎症因子等物质释放至微环境中，驯化免疫微环境和代谢微环境，加速NASH进展。CePA具有炎症驱化的特点，可以通过外周血到达由脂质异常堆积引起的具有炎症的肝脏组织，通过抗炎和调节脂代谢的双重作用，降低肝脏炎症和脂质沉积水平，缓解肝组织纤维化程度，最终减缓NASH进展。因此，CePA可通过同时靶向代谢重编程和免疫微环境重塑两方面的作用，抑制NASH的发生发展。

一、实验方法

1、CePA的合成

将12.4g六水合硝酸铈铵溶于200mL纯水中，随后将硝酸铈铵水溶液在搅拌状态下滴加到植酸水溶液中(含有8g植酸)，控制硝酸铈铵水溶液的流速为5mL/min。硝酸铈铵水溶液滴加结束后再继续搅拌12h，之后用抽滤装置清洗分离获得的CePA材料，最后用PBS缓冲液分散CePA浓度至50mg/mL，4℃储存待用。

2、表征及生物安全性验证

通过TEM获得的植酸铈纳米颗粒的形貌，材料尺寸30-50nm(参见图1)。材料的XRD验证了植酸铈颗粒的形成(参见图2)。通过植酸铈材料的比表面积分析可以发现获得的植酸铈材料具有大量的孔洞，利于后续的生物应用(参见图3)。

3、CePA稳定性及生物安全性检测

将500μL的植酸铈悬液(5mg/mL)分别均匀分散至2.5ml的模拟胃液、模拟肠液及PBS中，置于37℃的培养箱中，分别于3、6、9及12h，将溶液于4℃，1200rpm，离心5min，弃上清。按照1:20的比例将固定液(戊二醛)缓慢从管壁渗入离心好的CePA沉淀中，4℃冰箱内浸泡固定24h。随后通过TEM获得植酸铈纳米颗粒经不同溶液和不同时间点处理后的形貌。CePA稳定性测试结果显示，植酸铈材料在模拟胃液及小肠液中是以络合物形式稳定存在的(参见图4)。进行体内实验评估CePA延缓NASH发生发展的作用。副作用评估表明，CePA不改变不同组织的形态(参见图5)。

二、CePA通过与mTOR互作抑制其磷酸化激活

有越来越多的证据显示mTOR不仅与炎症相关，还参与调节脂质代谢。为了研究NASH的发病机制和潜在的治疗药物，本发明合成了植酸铈纳米颗粒(CePA)。根据CePA的分子晶格结构和与mTOR相互作用的分子对接计算可知，CePA和mTOR之间可发生直接相互作用，并且影响到了mTOR 2446位丝氨酸的空间位阻(参见图6)。进一步实验证实，CePA处理后，肝细胞中mTOR2446位丝氨酸磷酸化水平显著降低(参见图7)。2446位丝氨酸的磷酸化修饰对mTOR信号激活至关重要，该位点修饰依赖于其与Akt激酶的直接结合和催化。CoIP结果表明，CePA处理显著降低了mTOR与Akt的相互作用，进而抑制其磷酸化修饰(参见图8)。

三、CePA通过mTOR依赖的途径抑制脂合成代谢和炎症应答

进一步的体外实验评估了CePA对脂代谢和炎症应答的影响。肝细胞用PBS、植酸铈(CePA)、脂肪酸(FFA)、植酸铈+脂肪酸(CePA+FFA)分别培养。然后，检测植酸铈对肝细胞中脂质累积的改善作用。对肝细胞的油红染色结果显示，经植酸铈处理过的肝细胞中脂质明显减少(参见图9)，与脂肪酸合成相关分子的表达也有所减少，脂代谢情况明显有所改善(参见图10)。提取原代巨噬细胞用PBS、炎症刺激因子(LPS+IFN-γ)、CePA、CePA+炎症刺激因子分别培养，检测炎症相关分子表达情况与巨噬细胞分化及吞噬能力。结果表明，经植酸铈处理后，促炎因子与阳性对照组相比明显减少，抗炎因子表达明显增加(参见图11)；且巨噬细胞倾向于向M2抗炎型巨噬细胞分化(参见图12)。为了进一步证实CePA通过影响mTOR的磷酸化发挥调节作用，在肝细胞中添加亮氨酸以有效激活mTOR的磷酸化。结果表明，亮氨酸可以显著逆转CePA诱导的脂质代谢相关基因表达的下降；同时，亮氨酸可以增加CePA降低的促炎因子的表达，降低CePA引起的抗炎因子表达的增加(参见图13)。

四、CePA通过抑制mTOR信号缓解NASH进展

给C57BL/6小鼠喂食高脂饮食(HFD)16周以建立NASH模型，并喂食添加1％CePA的HFD以评价CePA的效果。取喂养含CePA高脂饲料的小鼠及单纯高脂老鼠的肝脏进行蛋白组及转录组检测。蛋白组及转录组的PCA图显示，两组样本组内差距较小，组间差距较大，提示样本具有良好的均一性(参见图14)。此外，CePA抑制脂合成代谢水平和炎性应答水平并降低mTOR信号水平(参见图15)；通过测定血清ALT、AST水平，结果显示含CePA的高脂饮食诱导的肝损伤程度明显低于HFD组(参见图16)。血清CHO水平测定及血糖检测结果显示含CePA的高脂饮食诱导的脂质含量和血糖含量显著低于HFD组(参见图17)。这些数据表明，CePA在饮食诱导的NASH小鼠模型中起着重要的调控作用。

NASH的特征是肝脂肪变性、肝细胞损伤(球囊性变性)、炎症和纤维化。我们主要通过组织学染色来观察CePA对NASH的保护作用。采用H&E染色法观察小鼠肝组织损伤情况。结果显示，HFD小鼠NAS评分值增加，并有不同程度的球囊变性、肝小叶间炎症浸润和脂肪变性，提示HFD可显著加重肝损伤，含CePA的HFD饲料可显著逆转上述现象(参见图17)。油红O染色结果显示，CePA能有效抑制HFD诱导的小鼠肝组织中脂滴的显著积累(参见图18)。然后，检测肝组织中与脂质合成相关的基因(srebpl、acc和fasn)的表达，结果显示CePA可以有效降低HFD诱导的脂质合成相关基因的表达升高(参见图19)。这些结果表明，CePA可调节肝脂肪变性，减少肝脂肪沉积，保护小鼠免受HFD诱导的肝损伤。NASH和肝特异性疾病的预后与肝纤维化的程度密切相关。约40％的NASH患者会出现纤维化进展。虽然肝纤维化不是NASH的临床诊断标准，但肝纤维化的程度可以预测NASH的预后，包括NASH患者的死亡率。因此，通过Massan和Sirius红染色检测HFD诱导的肝组织纤维化程度，发现CePA可以有效改善HFD诱导的肝组织纤维化(参见图20)。综上所述，本发明的研究结果表明，CePA可以通过调节肝组织中的脂滴聚集、脂肪沉积来保护HFD诱导的NASH。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。