一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法

技术领域

本发明属于微生物或酶领域，具体的是涉及一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法。

背景技术

己糖激酶(hexokinase，HXK)催化葡萄糖磷酸化使其形成6-磷酸-葡萄糖，是机体内糖酵解途径中的首个限速酶，在生物体能量代谢过程中充当了极其重要的角色。因其不受内源性还原性物质干扰的特点主要被用于临床诊断试剂，己糖激酶法测定血糖含量是国际上推荐的葡萄糖测定方法。肿瘤组织缺氧的情况下，通过增加其表达量活性使肿瘤细胞获得足够的能源，从而为肿瘤细胞本身的生长和增值提供必需的物质基础。但因己糖激酶是酶制剂行业的小酶种，国内相关企业对其关注度不高。目前，国内对己糖激酶的研究主要集中在植物体代谢途径和人体肿瘤上。而国外相关专利中有用选嗜热酵母生产己糖激酶，但其发酵酶活力相对较低，使得己糖激酶生产成本偏高。为此我们从酿酒酵母中克隆了己糖激酶基因在毕赤酵母中进行分泌表达，以期获得性质优良的纯品酶粉，代替进口产品，并且期待用毕赤酵母表达体系提高己糖激酶的产量。

发明内容

本发明提供一种产己糖激酶的基因工程的制备方法，可得到高产量、纯度较高的的产己糖激酶的基因工程菌，以此基因工程菌为生产菌种制得的己糖激酶性质优良，酶活高，产量高。

本发明提供一种技术方案，一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤，S1获取目的基因，所述目的基因选自编码己糖激酶蛋白的基因HXKⅡ，所述目的基因从酿酒酵母菌中的DNA以PCR方式扩增获取；S2将所述目的基因连接到表达载体中，得到重组表达载体；S3所述重组表达载体转入宿主菌中进行培养，筛选阳性菌落，PCR验证所述目的基因成功连接到所述表达载体；S4从所述宿主菌中抽提所述重组表达载体，所述重组表达载体转化毕赤酵母菌得到基因工程菌。

在哺乳类动物的体内，一共有四种亚型的己糖激酶(HXKⅠ—HXKⅣ)，它们各自有一定的组织特异性。Ⅰ型在脑组织中表达特别高，Ⅱ型是胰岛素敏感型的，主要存在于脂肪及肌组织中。除上述几种组织外,Ⅰ、Ⅱ型在其他各种组织中亦有少量的表达。Ⅲ型在肝、肾和肠组织中有微量的表达。HXKⅣ仅在肝和胰中存在。实验证实在四种HXK的同工酶中，HXKⅡ与肿瘤相关性最大，很多肿瘤细胞系中都有HXKⅡRNA的诱发和过表达。己糖激酶的四种同工酶中，HXKⅡ分布范围最广，肿瘤相关性最大，本发明的目的基因选自HXKⅡ，所得基因工程菌用于制备己糖激酶能够更有效地用于肿瘤学的研究、肿瘤疾病指标检测以及对于血糖含量的测定。用毕赤酵母菌作为目的基因的载体，毕赤酵母菌是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单的有点，又具有真核生物表达的蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，蛋白翻译后加工、修饰能力强，毕赤酵母菌中还存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用，由毕赤酵母菌表达的己糖激酶翻译后经过加工、修饰后纯度高，活性强，更有利于生产和使用。

一种优选的技术方案，步骤S1中，所述PCR扩增中以F引物和R引物从所述酿酒酵母菌中的DNA获得所述目的基因，所述F引物为5’-tagaattcatggttca tttaggtccaaaaaaacca-3’，所述R引物为5’-gcggccgcttaagcaccgatgataccaacggactta-3’。

一种优选的技术方案，所述PCR扩增过程的工作步骤及工作环境如下，98℃预变性5分钟；30个PCR循环：98℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟。一种优选的技术方案，所述PCR的反应体系为50μL，所述反应体系中的组分为：KOD OnePCRMaster Mix 25μL，所述酿酒酵母菌DNA 1μL，F引物1.5μL，R引物1.5μL，H

一种优选的技术方案，一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法，所述方法包括如下步骤，限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切消化纯化后的所述目的基因和质粒pPIC9K，使用T4DNA连接酶于15℃连接得到所述重组表达载体；所述重组表达载体转化宿主菌Top10；所述宿主菌Top10涂布在含有卡那霉素的LB琼脂平板上筛选培养，以所述F引物和所述R引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，获得含有所述目的基因的所述重组表达载体。通过PCR技术获得目的基因片段，通过双酶切和DNA连接酶将目的基因连接到质粒中成重组表达载体，再将表达载体转化进入宿主菌中，本方案选择宿主菌Top10，通过含有卡那霉素的培养基将转化的宿主菌Top10筛选出来。优选地，所述重组表达载体使用双酶切进行验证为阳性，进一步验证质粒中是否包含目的基因，从而提高宿主菌Top10中目的基因的阳性比例，防止后续步骤中阳性质粒较少影响后续操作步骤，进而影响基因工程菌的制备。

所述宿主菌Top10在LB培养基中活化培养，所述活化培养条件为37℃，200rpm，18-20h；取所述活化培养后的宿主菌Top10离心，离心条件为4200rpm，5℃，20min，弃上清，得菌体沉淀，所述菌体沉淀用10％甘油洗涤重悬，重复3次；第三次离心后取上清重悬菌体，制得所述宿主菌Top10感受态细胞；取所述宿主菌Top10感受态细胞与所述重组表达载体冰水预冷10min后移入电击杯中，进行电击转化，所述电击条件为2.5kv，6ms；电击后，转移所述电击杯中所述菌体至SOC培养基中培养。通过活化，多次甘油洗涤重悬制得宿主菌Top10感受态细胞，提高重组表达载体转化宿主菌Top10的概率，选择2.5kv，6ms的电击条件促进宿主菌Top10的转化，从而提高阳性占比，提高结果的准确性和可现性。

一种优选的技术方案，一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤，所述毕赤酵母菌于500mLYPD培养基中培养至OD600＝1.5-1.8；5℃，1500g离心8min收集沉淀；依次用500mL预冷的无菌水洗两次细胞后重悬；5℃，1500g离心8min后再用50mL冰预冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇，得所述毕赤酵母菌感受态细胞；使用质粒提取试剂抽提转化的所述宿主菌Top10得所述重组表达载体，所述重组表达载体经Sac1线性化处理；100μL所述毕赤酵母菌与5-10μg经过Sac1线性化处理的所述重组表达载体混合，转入冰预冷的电转杯；电击所述毕赤酵母菌感受态细胞与所述重组表达载体的混合物，所述电击条件为2.0kv，8ms；加入1mL冰预冷的1mol/L山梨醇混匀放置5min。通过本方案中的操作将毕赤酵母菌细胞感受态化，另外对重组表达载体进行Sac1线性化处理，促进质粒和毕赤酵母菌感受态细胞的转化效率，防止质粒随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因失活，提高转化成功率。

一种优选的技术方案，一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法，所述方法包括以下步骤，取电击后的所述毕赤酵母菌100-200μL涂布于固体MD培养基待菌落出现；取所述菌落用无菌水稀释后涂布到含遗传霉素YPD平板上筛选多拷贝子，28℃培养3-5天后挑取多拷贝子单克隆。本方案中，通过遗传霉素筛选出含有重组表达载体的阳性毕赤酵母菌即所述基因工程菌，筛选出的毕赤酵母菌进行培养即可进行己糖激酶的制备。

一种优选的技术方案，所述表达载体选自pPIC9，pPIC9K，pPIC3K，pHW O10中的一种；所述毕赤酵母菌选自GS115或KM71。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

通过从HXKⅡ选取目的基因，所表达的己糖激酶能够更有效地用于肿瘤学的研究、肿瘤疾病指标检测以及对于血糖含量的测定。

使用毕赤酵母菌作为目的基因的载体，表达的蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，毕赤酵母菌中还存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用，由毕赤酵母菌表达己糖激酶，所得己糖激酶纯度高、活性强，更有利于生产和使用。

pPIC9K质粒卡那霉素筛选，菌落PCR方法鉴定阳性，宿主菌Top10感受态细胞电击转化，毕赤酵母菌感受态细胞电击转化，组表达载体进行Sac1线性化处理，遗传霉素筛选阳性菌体等技术手段，提高了目的基因在基因工程菌中的表达概率。本发明技术方案中，目的基因经过质粒、宿主菌、毕赤酵母菌，过程中有多次扩增，在基因工程菌的制备过程中，若出现目的基因在质粒、宿主菌、毕赤酵母菌中不显或者概率较低的情况，经过扩增就会被放大，从而导致制备基因工程菌的失败或者困难重重，通过选择毕赤酵母菌作为载体，并且在本发明技术方案中重重筛选等技术手段，使得毕赤酵母菌中携带有重组表达载体，阳性表达率高，保障能够稳定获得基因工程菌，也保障了己糖激酶能够通过基因工程菌稳定表达。

该菌株表达的己糖激酶酶活性大，可以降低生产成本，为己糖激酶的大规模生产奠定了良好的基础。

附图说明

图1是重组表达载体的结构示意图；

图2是诱导己糖激酶表达培养基SDS-PAGE蛋白电泳结果。

具体实施方式

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

实施例1，一种产己糖激酶的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤，

S1获取目的基因，所述目的基因选自编码己糖激酶蛋白的基因HXKⅡ，所述目的基因从酿酒酵母菌中的DNA以PCR方式扩增获取。PCR扩增中以F引物和R引物从所述酿酒酵母菌中的DNA获得所述目的基因，所述F引物为5’-tagaattcatggttcatttaggtccaaaaaaacca-3’，所述R引物为5’-gcggccgcttaagcaccgatga taccaacggactta-3’。PCR扩增过程的工作步骤及工作环境如下，98℃预变性5分钟；30个PCR循环：98℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟。一种优选的技术方案，所述PCR的反应体系为50μL，所述反应体系中的组分为：KOD One PCRMaster Mix 25μL，所述酿酒酵母菌DNA 1μL，F引物1.5μL，R引物1.5μL，H

S2将所述目的基因连接到表达载体中，得到重组表达载体。限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切消化纯化后的所述目的基因和质粒pPIC9K，使用T4DNA连接酶于15℃连接得到所述重组表达载体，如图1所示；所述重组表达载体转化宿主菌Top10；所述宿主菌Top10涂布在含有卡那霉素的LB琼脂平板上筛选培养，以所述F引物和所述R引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，获得含有所述目的基因的所述重组表达载体。本实施例中提供以所述F引物和所述R引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子的方案，首先需要宿主菌Top10中提取出DNA；将提取得到的DNA作为模板，使用F引物和R引物进行PCR扩增，放大目的基因片段；将PCR反应产物经过凝胶电泳分离，并在紫外线下观察条带形成情况。如果存在目的基因，则会出现与预期大小相符合的条带；通过比较PCR产物与已知大小标准的DNA片段进行比较，可确定PCR产物中是否含有目标基因序列。

S3所述重组表达载体转入宿主菌中进行培养，筛选阳性菌落，PCR验证所述目的基因成功连接到所述表达载体；所述宿主菌Top10在LB培养基中活化培养，所述活化培养条件为37℃，200rpm，19h；取所述活化培养后的宿主菌Top10离心，离心条件为4200rpm，5℃，20min，弃上清，得菌体沉淀，所述菌体沉淀用10％甘油洗涤重悬，重复3次；第三次离心后取上清重悬菌体，制得所述宿主菌Top10感受态细胞；取所述宿主菌Top10感受态细胞与所述重组表达载体冰水预冷10min后移入电击杯中，进行电击转化，所述电击条件为2.5kv，6ms；电击后，转移所述电击杯中所述菌体至SOC培养基中培养。本实施例中LB琼脂平板成分及含量为：Trypton l％，Yeast Extract 0.5％，NaCl l％，PH 7.0，Zeocin25ug/ml，2％琼脂粉。本实施例中SOC培养基成分及含量为：1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，25mol/LKCl，1mol/LMgCl

S4从所述宿主菌中抽提所述重组表达载体，所述重组表达载体转化毕赤酵母菌得到基因工程菌。所述毕赤酵母菌于500mLYPD培养基中培养至OD600＝1.6；5℃，1500g离心8min收集沉淀；依次用500mL预冷的无菌水洗两次细胞后重悬；5℃，1500g离心8min后再用50mL冰预冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇，得所述毕赤酵母菌感受态细胞；使用质粒提取试剂抽提转化的所述宿主菌Top10得所述重组表达载体，所述重组表达载体经Sac1线性化处理；100μL所述毕赤酵母菌与5-10μg经过Sac1线性化处理的所述重组表达载体混合，转入冰预冷的电转杯；电击所述毕赤酵母菌感受态细胞与所述重组表达载体的混合物，所述电击条件为2.0kv，8ms；加入1mL冰预冷的1mol/L山梨醇混匀放置5min。本实施例中YPD培养基的组分和含量为Yeast Extract PeptoneDextrose Medium，Trypton 2％，dextrose(gl ucose)2％，agar 2％，Zeocin 100μg/ml。

实施例2，本实施例与实施例1的区别之处在于S3中，所述宿主菌Top10在LB培养基中活化培养条件为37℃，200rpm，18h；S4中所述毕赤酵母菌于500mLYPD培养基中培养至OD600＝1.5。

实施例3，本实施例与实施例1的区别之处在于S3中，所述宿主菌Top10在LB培养基中活化培养条件为37℃，200rpm，20h；S4中所述毕赤酵母菌于500mLYPD培养基中培养至OD600＝1.8。

以实施例1中基因工程菌为生产菌株制备己糖激酶，步骤如下，

基因工程菌29℃、280rpm下活化培养，YPD培养基培养到OD600在1.5-1.8之间，以2％的接种量转入基本发酵培养基，于29℃、280rpm条件下培养；当OD600值为1.5-1.8时，将酵母细胞转入BMMY培养基中，每天添加1％甲醇诱导蛋白的产生。

培养基：YPD培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g；基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇5mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)。

通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为54kDa的蛋白条带如图2所示，同时在摇瓶中验证随时间产己糖激酶的能力，测量酶活性。

本发明中提供对比例1，河北农业大学报，第40卷第1期2017年1月，文章编号1000-1573(2017)01-0066-05，诊断试剂用己糖激酶的制备工艺研究，刘春卯。对比例1中大肠杆菌的HXK载体，通过对大肠杆菌载体菌株发酵工艺优化，对超声破壁获取粗酶及粗酶的纯化工艺优化获得己糖激酶，对比例1中设计实验进行由大肠杆菌载体菌株所制备的己糖激酶的酶活性测量，酶活力最高为139U/ml。以实施例1中基因工程菌为生产菌株制备的己糖激酶测得酶活力为178U/ml，远高于对比例1中的酶活力。实施例1中基因工程菌以毕赤酵母菌为载体，表达的蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，所得己糖激酶纯度高、活性强，实施例1中基因工程菌所制备的己糖激酶的酶活在本领域现有技术中为较高浓度的酶活性，为己糖激酶大规模的生产奠定了良好的基础。