一种不破坏组织结构的微塑料检测方法

技术领域

本发明涉及微塑料检测技术领域，尤其涉及IPC G01N21领域，进一步的，涉及一种不破坏组织结构的微塑料检测方法。

背景技术

塑料在我们日常生活中随处可见，给我们的生活带来了方便，但是由于普通塑料无法生物降解，只能碎裂成小的塑料碎片，于是不可避免的产生了微塑料。微塑料是指直径小于5毫米的塑料碎片，具有多种形态，但是由于体积小，肉眼常难以分辨。微塑料可以通过饮食、饮水、呼吸等途径进入到生物体中，并在组织和器官中积累，会导致生物体健康受到危害，因此，能够准确定性并同时定位微塑料颗粒在生物体组织中的位置的检测方法对于了解微塑料浸润的具体精确位置、微塑料的转移过程以及微塑料对组织产生的特异性结构变化，为后续微塑料对生物体，尤其是人体健康风险的评估具有重要的意义。

现有技术中对于微塑料的检测方法主要包括显微镜观察、红外光谱分析、尼罗红荧光染料标记、拉曼光谱和质谱分析，例如中国专利CN 201711178353公开了一种生物体中微塑料的检测方法，包括：S110，消解：将生物体样品用浓度为50～70％的硝酸在室温下浸泡6～18小时，加热到60～95℃并维持1～4小时，得到消解的生物体样品；S120，脱脂：将步骤S110中得到的消解的生物体样品趁热用60～95℃的表面活性剂溶液冲洗和抽滤，得到脱脂的微塑料；S130，将步骤S120中得到的脱脂的微塑料用60～95℃的水冲洗和抽滤，得到清洗的微塑料。但是该技术方案需要采用强酸对组织结构进行破坏而获得微塑料，然后再对微塑料进行分析检测；由此可见，该技术方案只能对微塑料进行定性分析，而不能对微塑料在组织中的位置进行分析，但是对于微塑料在组织内的生物学研究，完整的组织结构的观察是至关重要的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种不破坏组织结构的微塑料检测方法，实现在不破坏组织结构的情况下，检测组织中是否存在微塑料以及对微塑料进行具体定位。

技术方案如下：一种不破坏组织结构的微塑料检测方法，至少依次包括以下步骤：S1、组织样本冻存；S2、冰冻包埋；S3、制备冰冻切片；S4、染色；S5、荧光显微镜观察；S6、对荧光位置进行拉曼光谱分析。

在一些优选的实施方式中，所述组织样本为小鼠肝癌组织。

优选的，所述组织样本冻存方式为液氮冷冻。

在一些优选的实施方式中，所述冰冻包埋步骤依次为：(1)对组织样本进行浸泡处理；(2)将组织样本在温度为-80℃下采用OCT包埋剂(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)进行包埋。

本发明人发现，当采用液氮冷冻的组织样本并且在温度为-80℃下采用OCT包埋剂进行包埋，不仅可以使得组织样本达到快速冷冻的效果，而且可以减少冰晶的形成，避免后续在切片时出现结构的损伤，保证后续的染色效果。

优选的，所述组织样本进行浸泡处理依次至少包括两次浸泡处理。

优选的，所述组织样本进行浸泡处理依次包括三次浸泡处理。

优选的，第一次浸泡处理为：将组织样本置于15～25g/L蔗糖与OCT包埋剂(1：1体积比例)混合液中，在20～30℃下浸泡1.5～2.5h。

优选的，第一次浸泡处理为：将组织样本置于20g/L蔗糖与OCT包埋剂(1：1体积比例)混合液中，在25℃下浸泡2h。

优选的，第二次浸泡处理为：将组织样本置于OCT包埋剂中，在20～30℃下浸泡3～5h。

优选的，第二次浸泡处理为：将组织样本置于OCT包埋剂中，在25℃下浸泡4h。

优选的，第三次浸泡处理为：将组织样本置于新的OCT包埋剂中，在20～30℃下浸泡5～7h。

优选的，第三次浸泡处理为：将组织样本置于新的OCT包埋剂中，在25℃下浸泡6h。

本发明人在实验过程中发现，在对组织样本采用OCT包埋剂包埋之前，对组织样本进行三次浸泡处理；尤其是当第二次浸泡处理和第三次浸泡处理均采用OCT包埋剂进行浸泡，可以极大的减少冰冻切片冰晶的形成，在后续进行染色时，可以避免出现收缩、变形等改变组织正常显微结构的问题。

在一些优选的实施方式中，所述冰冻切片的厚度为7～10μm。

优选的，所述冰冻切片的厚度为8μm。

优选的，在制备冰冻切片步骤中还包括烤片。

优选的，所述烤片条件为：烘烤温度为60～70℃；烘烤时间为50～70min。

在一些优选的实施方式中，在制备冰冻切片之后染色之前还包括S310、脱脂。

优选的，所述脱脂步骤为：将冰冻切片于丙酮中进行脱脂处理。

优选的，所述脱脂处理温度为4℃；脱脂时间为30～40h。

优选的，所述脱脂处理温度为4℃；脱脂时间为36h。

优选的，所述脱脂步骤还包括：采用0.01M PBS溶液冲洗冰冻切片1～3次，每次3～5min。

优选的，所述脱脂步骤还包括：采用0.01M PBS溶液冲洗冰冻切片3次，每次5min。

本发明人在实验过程中进一步探究发现，为了达到良好的染色效果，当采用本申请的染色剂时，无法区分冰冻切片的荧光点是微塑料还是脂质；为了解决上述问题，本发明人发现当将冰冻切片于丙酮中进行脱脂处理，尤其是当脱脂处理温度为4℃；脱脂时间为36h时，不仅可以实现良好的脱脂效果，实现微塑料的定位观察，而且还可以提高后续染色的均匀性。

在一些优选的实施方式中，所述染色步骤为：在冰冻切片上滴加染色剂，染色一段时间后用蒸馏水洗去多余染色剂。

优选的，所述染色剂为尼罗红溶液；优选的，所述尼罗红溶液的制备方法为：尼罗红粉末用0.01M PBS溶液稀释500倍。

优选的，所述染色时间为3～7min。

优选的，所述染色时间为5min。

本发明人进一步探究发现，当染色剂为尼罗红溶液时，可以对组织样本进行染色，从而可以更好的观察组织样本中微塑料的位置；而当尼罗红溶液采用0.01M PBS缓冲液进行稀释时，染色效果更好，本发明人猜测可能是因为采用PBS缓冲液稀释的尼罗红与组织样本的吸附能力提高，更容易着色，染色效果更好。

进一步的，本发明人发现，当采用该浓度的尼罗红溶液对组织样本进行染色时，需严格控制染色时间，染色时间过短，染色不均匀，观察不到荧光点；染色时间过长，也会造成染色效果差，造成荧光强度降低。

优选的，所述尼罗红溶液可以现配现用，也可以配制好在-20℃下存储，使用时解冻即可。

优选的，所述荧光显微镜型号为BX63。

优选的，所述荧光显微镜在470nm波长下观察。

有益效果：

1、本发明当采用液氮冷冻的组织样本并且在温度为-80℃下采用OCT包埋剂进行包埋，不仅可以使得组织样本达到快速冷冻的效果，而且可以减少冰晶的形成，避免后续在切片时出现结构的损伤，保证后续的染色效果。

2、本发明人在对组织样本采用OCT包埋剂包埋之前，对组织样本进行三次浸泡处理；尤其是当第二次浸泡处理和第三次浸泡处理均采用OCT包埋剂进行浸泡，可以极大的减少冰冻切片冰晶的形成，在后续进行染色时，可以避免出现收缩、变形等改变组织正常显微结构的问题。

3、本发明当将冰冻切片于丙酮中进行脱脂处理，尤其是当脱脂处理温度为4℃；脱脂时间为36h时，不仅可以实现良好的脱脂效果，实现微塑料的定位观察，而且还可以提高后续染色的均匀性。

4、本发明当染色剂为尼罗红溶液时，可以对组织样本进行染色，从而可以更好的观察组织样本中微塑料的位置；而当尼罗红溶液采用0.01M PBS缓冲液进行稀释时，染色效果更好。

5、本发明控制染色时间为3～7min，尤其是当染色时间为5min时，染色效果最佳。

附图说明

图1为实施例1未染色的冰冻切片在普通显微镜下的照片。

图2为实施例1染色的冰冻切片在荧光显微镜下的照片。

图3为对图2荧光位置进行拉曼光谱分析的谱图。

图4为实施例2染色的冰冻切片在荧光显微镜下的照片。

图5为实施例3染色的冰冻切片在荧光显微镜下的照片

具体实施方式

实施例1

实施例1提供了一种如图1～3所示的不破坏组织结构的微塑料检测方法，依次包括以下步骤：S1、组织样本冻存；S2、冰冻包埋；S3、制备冰冻切片；S310、脱脂；S4、染色；S5、荧光显微镜观察；S6、对荧光位置进行拉曼光谱分析。

所述组织样本为小鼠肝癌组织。

所述组织样本冻存方式为液氮冷冻。

所述冰冻包埋步骤依次为：(1)对组织样本进行浸泡处理；(2)将组织样本在温度为-80℃下采用OCT包埋剂进行包埋。

所述组织样本进行浸泡处理依次包括三次浸泡处理。

第一次浸泡处理为：将组织样本置于20g/L蔗糖与OCT包埋剂(1：1体积比例)混合液中，在25℃下浸泡2h。

第二次浸泡处理为：将组织样本置于OCT包埋剂中，在25℃下浸泡4h。

第三次浸泡处理为：将组织样本置于新的OCT包埋剂中，在25℃下浸泡6h。

所述冰冻切片的厚度为8μm。

在制备冰冻切片步骤中还包括烤片；所述烤片条件为：烘烤温度为65℃；烘烤时间为60min。

所述脱脂步骤为：将冰冻切片于丙酮中在4℃下进行脱脂处理36h，然后采用0.01MPBS溶液冲洗冰冻切片3次，每次5min。

所述染色步骤为：在冰冻切片上滴加尼罗红溶液，染色5min后用蒸馏水洗去多余染色剂。

所述尼罗红溶液的制备方法为：尼罗红粉末用0.01M PBS溶液稀释500倍。

所述荧光显微镜型号为BX63。

所述荧光显微镜在470nm波长下观察。

对荧光位置进行拉曼光谱分析结果为聚苯乙烯微塑料。

实施例2

实施例2提供了一种如图4所示的不破坏组织结构的微塑料检测方法，依次包括以下步骤：S1、组织样本冻存；S2、冰冻包埋；S3、制备冰冻切片；S310、脱脂；S4、染色；S5、荧光显微镜观察；S6、对荧光位置进行拉曼光谱分析。

所述组织样本为小鼠肝癌组织。

所述组织样本冻存方式为液氮冷冻。

所述冰冻包埋步骤依次为：(1)对组织样本进行浸泡处理；(2)将组织样本在温度为-80℃下采用OCT包埋剂进行包埋。

所述组织样本进行浸泡处理依次包括两次浸泡处理。

第一次浸泡处理为：将组织样本置于20g/L蔗糖与OCT包埋剂(1：1体积比例)混合液中，在25℃下浸泡2h。

第二次浸泡处理为：将组织样本置于OCT包埋剂中，在25℃下浸泡4h。

所述冰冻切片的厚度为8μm。

在制备冰冻切片步骤中还包括烤片；所述烤片条件为：烘烤温度为65℃；烘烤时间为60min。

所述脱脂步骤为：将冰冻切片于丙酮中在4℃下进行脱脂处理30h，然后采用0.01MPBS溶液冲洗冰冻切片3次，每次5min。

所述染色步骤为：在冰冻切片上滴加尼罗红溶液，染色5min后用蒸馏水洗去多余染色剂。

所述尼罗红溶液的制备方法为：尼罗红粉末用0.01M PBS溶液稀释500倍。

所述荧光显微镜型号为BX63。

所述荧光显微镜在470nm波长下观察。

实施例3

实施例3提供了一种如图5所示的不破坏组织结构的微塑料检测方法，依次包括以下步骤：S1、组织样本冻存；S2、冰冻包埋；S3、制备冰冻切片；S310、脱脂；S4、染色；S5、荧光显微镜观察；S6、对荧光位置进行拉曼光谱分析。

所述组织样本为小鼠肝癌组织。

所述组织样本冻存方式为液氮冷冻。

所述冰冻包埋步骤依次为：(1)对组织样本进行浸泡处理；(2)将组织样本在温度为-80℃下采用OCT包埋剂进行包埋。

所述组织样本进行浸泡处理依次包括三次浸泡处理。

第一次浸泡处理为：将组织样本置于20g/L蔗糖与OCT包埋剂(1：1体积比例)混合液中，在25℃下浸泡2h。

第二次浸泡处理为：将组织样本置于OCT包埋剂中，在25℃下浸泡4h。

第三次浸泡处理为：将组织样本置于新的OCT包埋剂中，在25℃下浸泡6h。

所述冰冻切片的厚度为8μm。

在制备冰冻切片步骤中还包括烤片；所述烤片条件为：烘烤温度为65℃；烘烤时间为60min。

所述脱脂步骤为：将冰冻切片于丙酮中在4℃下进行脱脂处理36h，然后采用0.01MPBS溶液冲洗冰冻切片3次，每次5min。

所述染色步骤为：在冰冻切片上滴加尼罗红溶液，染色10min后用蒸馏水洗去多余染色剂。

所述尼罗红溶液的制备方法为：尼罗红粉末用去离子水稀释500倍。

所述荧光显微镜型号为BX63。

所述荧光显微镜在470nm波长下观察。