一种特异性识别AD7C-NTP的核酸适配体及单分子免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种特异性识别AD7C-NTP的核酸适配体及单分子免疫检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

阿尔茨海默症相关神经丝蛋白(AD-associated neuronalthread protein，AD7C-NTP)是一种安全、有效的生物标记物，在AD诊断有着重要意义，具有广阔的应用前景。AD7C-NTP隶属于神经丝蛋白家族，是一种相对分子质量为41 000的跨膜磷蛋白。AD7C-NTP自神经元胞体中表达后，广泛存在于神经细胞发生的轴突中，并大量出现在AD患者脑中的NFTs里，呈分泌性上调表达。研究表明，AD7C-NTP在神经元中的沉积在神经元变性早期即可出现，并且发生在NFTs形成之前，在早期AD患者的脑组织抽提物、脑脊液、尿液中均可以检测到AD7C-NTP。同时AD7C-NTP含量水平随病程延长和痴呆严重程度呈正相关逐渐增高，这可能是由于AD患者脑组织NTP免疫活性及信使RNA表达增强，导致神经元细胞凋亡增多，继而使死亡细胞释放大量的AD7C-NTP。神经元胞体和神经突触的丢失、神经元结构蛋白功能受损等病理过程，可以使AD7C-NTP表达升高。而现有的AD7C-NTP检测方法，灵敏度不高(酶联免疫技术，免疫层析技术，检测下限mg/ml)，特异性不好(双抗体夹心测抗原，配对的特异性抗体不容易获取)，给AD7C-NTP试剂的实际应用与推广带来门槛阻碍。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供的阿尔茨海默症相关神经丝蛋白适配体序列具有理想的亲和力、良好的特异性，基于其构建的检测方法能够更灵敏地检测分离出样本中存在的阿尔茨海默症相关神经丝蛋白。

本发明的第一个目的是提供一种特异性识别阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述核酸适配体的5′端或3′端修饰有功能基团或分子。

进一步地，所述功能基团或分子选自同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基、巯基、氨基中的至少一种。

本发明的第二个目的是提供上述核酸适配体在制备阿尔茨海默症相关神经丝蛋白检测产品中的应用，包括但不限于试剂盒、试纸等。

本发明的第三个目的是提供上述核酸适配体在制备阿尔茨海默症检测产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种用于检测阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的产品，该产品中包括上述核酸适配体。

进一步地，所述用于检测阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的产品中还包括：标记有阿尔茨海默病相关神经丝蛋白抗体的磁性分离介质、核酸适配体、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶底物，其中，核酸适配体可与半乳糖苷酶共价连接。

进一步地，所述核酸适配体经生物素修饰，所述半乳糖苷酶经链霉亲和素修饰。

本发明建立的单分子免疫检测方法，检测原理为：将特异性的捕获抗体包被于免疫磁珠上，样本中蛋白质抗原与抗体发生免疫反应，被捕获在磁珠上；加入生物素化的特异性适配体APT，与磁珠上的抗原结合，形成磁珠-抗体-抗原-APT-生物素；加入标记有链霉亲和素的β-半乳糖苷酶，与磁珠上的生物素结合，形成复合物：磁珠-抗体-抗原-生物素-链霉亲和素的β-半乳糖苷酶。将磁珠复合物转导于SiMoA微孔盘上的每个微孔内，并重悬在试卤灵-β-半乳糖苷的底物中，有β-半乳糖苷酶的磁珠微球产生荧光，检测器检测荧光信号强度。计数有荧光的孔数即可得到蛋白质抗原的数量通过与标准曲线对比即可得到样品中蛋白质抗原的含量。如果样品中没有蛋白抗原，磁珠上就不会结合有B-半乳糖苷酶，也就没有荧光产生。

进一步地，所述用于检测阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的产品中还包括阿尔茨海默病相关神经丝蛋白标准液。

进一步地，检测阿尔茨海默症相关神经丝蛋白包括以下步骤：

S1、将已知浓度的阿尔茨海默症相关神经丝蛋白溶液与标记有阿尔茨海默病相关神经丝蛋白抗体的磁性分离介质共孵育，反应结束后洗涤去除未结合物质；

S2、将S1的反应产物与生物素修饰的核酸适配体共孵育，反应结束后洗涤，去除非特异性结合；

S3、将S2的反应产物与链霉亲和素修饰的半乳糖苷酶继续孵育，反应结束后洗涤，去除未结合物质；

S4、向S3的反应产物中加入半乳糖苷酶底物进行反应，反应结束后检测荧光强度；

S5、建立阿尔茨海默症相关神经丝蛋白浓度与荧光强度的关系曲线；

S6、将已知浓度的阿尔茨海默症相关神经丝蛋白溶液替换为待检测样本重复步骤S1～S4，将荧光强度代入S5得到的关系曲线中，计算出待检测样本中阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的含量。

进一步地，所述半乳糖苷酶底物包括试卤灵-β-半乳糖苷。

本发明的有益效果：

1)与抗体相比，适配体具有可在体外筛选、筛选周期短、合成方便、易标记各种功能基团和报告分子、性质稳定可长期保存使用等优势；本发明的适配体是阿尔茨海默症相关神经丝蛋白的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

2)本发明创新地将AD7C-NTP适配体与单分子免疫检测(Single MoleculeCounting，SMC)技术相结合，首次实现了在单分子水平对蛋白进行计量，灵敏度高于ELISA1000倍，在神经退行性疾病、肿瘤、传染病等领域均具有理想检测价值。

附图说明

图1是本发明制备的基于单分子免疫检测的阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的检测试剂盒构建示意图。

图2是本发明制备的检测试剂盒的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的材料如下：

阿尔茨海默病相关神经丝蛋白单克隆抗体：购自上海杰一生物技术有限公司。

实施例1与阿尔茨海默病相关神经丝蛋白特异性结合的核酸适配体的筛选

1、ssDNA初始文库的构建

设计两端16bp固定序列，中间50bp随机序列的82bp寡核苷酸ssDNA文库：5′-ATACCAGCTTATTCAA-N50-AGATAGTAAGTGCAAT-3′，其中N代表碱基A、T、C、G中的任一个，N50代表随机片段长度为50个碱基。

上游引物：5′-ATACCAGCTTATTCAA-3′

下游引物：5′-ATTGCACTTACTATCT-3′

生物素修饰上游引物：biotin-C6-ATTGCACTTACTATCT

2、ssDNA初始文库的筛选

取一支1.5mL离心管，加入10ul 0.5mg/mL的甲苯磺酰基磁珠(TMB)，50ul 0.1mg/mL的AD7C-NTP蛋白溶液，用缓冲液补足至300ul,4℃孵育过夜。第二天，用1mL缓冲液清洗3次，每次均在磁力收集架上静置2min，弃去上清,最后用500ul的缓冲液重悬，得到TMB-AD7C-NTP复合物。

将前述TMB-AD7C-NTP复合物与1OD的ssDNA(100umol/l)混合，加入200uL PBS,4℃孵育2h。然后用200ul PBS清洗3次，每次均在磁力收集架上静置2min，弃去上清,最后用50ul PBS重悬，得到TMB-AD7C-NTP-ssDNA复合物。将含有复合物的离心管，放入95℃水浴15min，将结合在复合物上的ssDNA洗脱，同时使用磁力收集架清除TMB-AD7C-NTP复合物，可得到ssDNA溶液。

使用生物素修饰的上游引物与未生物素修饰的下游引物，对得到的ssDNA溶液进行PCR扩增：引物用量2.5ul；94℃预变性5min；95℃变性30s；52.3℃退火30s；72℃延伸30s；循环数为15。扩增结束后，电泳凝胶检测扩增产物。

3、ssDNA次始文库的制备

将上述的PCR扩增产物用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化，使用酶标仪测定dsDNA的浓度。根据磁珠推荐固载量(每5ul的链霉亲和素磁珠-SMB，配100ng的dsDNA)，在dsDNA中加入适量的SMB磁珠，在37℃摇床孵育1h,得到SMB-dsDNA复合物。

取200ul的100mmol/l的NaOH溶液加到SMB-dsDNA复合物中，室温下碱变性，摇床孵育15min，使未生物素化的ssDNA从复合物中洗脱下来。使用磁力收集架，取上清ssDNA，加入40ul的1mol/l的NaH

4、ssDNA次始文库的筛选

将得到的ssDNA次级文库，作为新的起始文库，重复上述实验步骤，一共进行10轮重复筛选实验。

当筛选进行到第3，6，9轮时，进行反筛选，即用未固定AD7C-NTP的TMB磁珠与筛选的ssDNA文库孵育2h，使用磁力分离器分离磁珠取上清，得到不与TMB磁珠结合的ssDNA(提高ssDNA文库的特异性，只特异性的与AD7C-NTP蛋白结合)。

反向筛选：取一支1.5mL离心管，加入10ul 0.5mg/mL的甲苯磺酰基磁珠(TMB)，用缓冲液补足至300ul，4℃孵育过夜。第二天，用1mL缓冲液清洗3次，每次均在磁力收集架上静置2min，弃去上清,最后用500ul的缓冲液重悬。加入ssDNA文库，4℃孵育2h，在磁力收集架上静置2min后，取上清，得到不与TMB磁珠结合的ssDNA。

5、PCR扩增

为了得到特异性强的目标条带，每轮筛选的AD7C-NTP用量、PCR反应条件等略有不同。其中，AD7C-NTP的用量：1-3轮5ug，4-7轮4.8ug，8-10轮4.6ug；PCR反应中引物用量：1-5轮2.5ul，6-7轮3.5ul，8-10轮5ul；PCR循环数：1-5轮15，6-7轮20，8-10轮22。

6、克隆与测序

第10轮筛选结束后，将得到的ssDNA用未生物素修饰的引物进行PCR扩增。扩增产物与克隆载体按比例混合，导入感受态细胞DH5a，37℃摇床中培养1h后，菌液离心，涂布平板。第二天选择生长状况良好的单个菌落，加入5mL的LB培养液培养12h。将上述含菌培养液送至上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序，得到目标APT的核酸序列。

7、ELISA法表征结合能力

按核酸测序结果，合成带有生物素修饰的APT序列，并用双蒸水配制成0.1，0.2，0.4，0.8，1.5，2.5，3.5，5.0umol/L的溶液备用。

用100ul 5ug/ml的AD7C-NTP蛋白溶液包被96孔酶标板，4℃过夜孵育。将板孔中的液体全部倒出，拍干，然后每孔加入300ul封闭液(含0.1％BSA，0.05％吐温20的PBS溶液)，4℃封闭1h，液体全部倒出，拍干备用。

取AD7C-NTP包被板，每孔加入100ul相应浓度的APT溶液，37℃孵育1h后，PBST清洗液清洗3次，拍干。

向每孔中加入100ul的链霉生物素标记的HRP酶，37℃孵育1h后，PBST清洗液清洗3次，拍干。加入100ul的TMB显色液，避光反应5min后，加入50ul的H

用ELISA法测定不同浓度的APT与0.5ug AD7C-NTP蛋白结合时的吸光度。以APT浓度为横坐标，OD值为纵坐标，进行非线性拟合，可得到0.5ug AD7C-NTP结合APT的量随APT浓度变化的关系，依据公式Y＝Bmax X/(Kd+X)，求算复合物的解离常数，Y为OD值，X为APT浓度；Bmax为AD7C-NTP的最大吸附量；Kd为APT-AD7C-NTP复合物的解离常数。解离常数的大小，可以反映二者结合能力的强弱，且解离常数越小，结合能力越强。

ELISA法测定的APT与AD7C-NTP结合的解离常数在10

表1序列

同时准备包被有TMB磁珠、CEA蛋白、AFP蛋白和完全没包被物的酶标板，包被，孵育，封闭同上，备用。取包被板，按上述ELISA检测的步骤，测定APT反应的OD值。结果表明，适配体APT与TMB磁珠、CEA蛋白、AFP蛋白、空白板几乎不反应，OD值均小于0.05，说明获得的适配体APT的特异性较好。

实施例2

基于单分子免疫检测的阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的检测试剂盒，包含有：标记有阿尔茨海默病相关神经丝蛋白单克隆抗体的免疫磁珠；生物素化的特异性识别阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的适配体APT(选用实施例1中Apt2)；链霉亲和素的-半乳糖苷酶复合物(SBG)溶液、试卤灵-β-半乳糖苷底物、阿尔茨海默病相关神经丝蛋白标准液，检测示意图见图1。具体过程如下：

1、阿尔茨海默病相关神经丝蛋白单克隆抗体和免疫磁珠的标记

A、配置MES反应缓冲液：计算2-(N-吗啡啉)乙磺酸的量，并称取；用Tris碱液溶液调节ph至6.5，加水定量；

B、抗体的准备：用超滤管离心超滤抗体，加入MES反应缓冲液重悬，使标记抗体的浓度为1mg/ml；

C、免疫磁珠的准备：将磁珠放置在磁力收集架上静置2min，弃去上清,用MES反应缓冲液重悬磁珠，磁珠微球浓度为1％w/v；

D、磁珠活化：按每ml磁珠微球加20mgEDC的比例，缓慢加入EDC，37℃摇床孵育20分钟；

E、抗体结合：取1份标记抗体，缓慢加入10倍体积的活化微球溶液中，37℃摇床孵育2小时；

F、封闭微球:按每ml磁珠微球加2.5ul乙醇胺，缓慢加入，37℃摇床孵育20分钟；

G、清洗、重悬备用：将上述反应后的磁珠放置在磁力收集架上，静置5分钟，用缓冲液重悬，备用；

2、生物素化的特异性识别阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的适配体APT

根据核酸测序结果，合成生物素化的特异性识别阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的适配体APT，并用双蒸水配制成1.5umol/L；

3、链霉亲和素的-半乳糖苷酶复合物(SBG)溶液，工作浓度为50-400pmol/L，含0.5％BSA，2mmol/L MgCl2，10mmol/L的PBS，pH＝7.4-8；

4、底物溶液：试卤灵-β-半乳糖苷(RGP)；

5、阿尔茨海默病相关神经丝蛋白标准液：用缓冲液将标准品配制成500，400，300，200，100，50，10ng/mL；

6、反应条件：标记有阿尔茨海默病相关神经丝蛋白单克隆抗体的免疫磁珠50ul，样品或标准品50ul，反应5分钟后清洗3次；生物素化的特异性识别阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的适配体APT 50ul，反应4分钟后清洗3次；链霉亲和素的-半乳糖苷酶复合物溶液50ul，反应3分钟后清洗3次。加入底物溶液60ul，反应2分钟后，读取荧光数值。

检测结果见图2，可见本发明的检测试剂盒检测范围广(0-500ng/mL)，线性良好，方程为Y＝0.0279+0.0048X，r＝0.9978；灵敏度为0.27μg/L。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。