一种S腺苷同型半胱氨酸偶联物及单克隆抗体制备及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，特别是涉及一种S腺苷同型半胱氨酸偶联物及其单克隆抗体的制备。

背景技术

总同型半胱氨酸浓度极度增高的情况见于高胱氨酸尿症，它是一种罕见的同型半胱氨酸代谢酶遗传性缺陷。高胱氨酸尿症的症状表现为智力障碍、早期动脉粥样硬化及动静脉血栓。除此之外，一些非重度遗传缺陷也会引起总同型半胱氨酸水平的中度增高。

研究发现同型半胱氨酸是心血管疾病(CVD)风险评估中的重要标志物，现已证明存在已知冠状动脉疾病(CAD)情况下，同型半胱氨酸是CAD相关死亡的独立标志物。表明了同型半胱氨酸水平升高与全部病因死亡率以及心血管疾病死亡率升高具有独立相关性。

Hcy的测定技术已有多种主要有氨基酸色谱分析技术[例如高效液相质谱法(HPLC)]、荧光分光光度分析技术、化学发光技术等均可直接或间接测定标本中Hcy水平。但是这些技术的共同缺点是耗时操作复杂等。目前已将酶联免疫吸附试验(ELISA)技术常规用于Hcy测定但国内类似技术较欠缺。由于建立Hcy的ELISA测定技术中的关键是制备S腺苷同型半胱氨酸(SAH)-BSA偶联物和SAH单克隆抗体(SAH mAb)故本发明对制备S腺苷同型半胱氨酸(SAH)-BSA偶联物和SAH单克隆抗体(SAH mAb)进行表述。

为此我们提出一种S腺苷同型半胱氨酸偶联物及其单克隆抗体的制备。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供如下技术方案：一种S腺苷同型半胱氨酸偶联物，包括S腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原和人源化重组质粒，所述S腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原中S腺苷同型半胱氨酸小分子通过生物偶联试剂与载体偶联获得，偶联多个的SAH小分子，引起较高的免疫后鼠尾效价,免疫载体优选钥孔血蓝蛋白,根据抗体筛选要求，反筛抗体使用的载体应与免疫载体不交叉，反筛载体优选鸡卵清蛋白。

作为本发明的一种优选技术方案，所述人源化重组质粒的构建，包括以下步骤：

S1：重组抗体基因的获得；所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，制备重组的人源化SAH6抗体重链序列VH-hFc-SAH6；

S2：合成基因片段的两端设计EcoR I与NHE I酶切位点，以pFUSE为载体，获得携带有重组基因的质粒pFUSE-VH-hFc-SAH6；合成基因片段的两端设计EcoR I与AvrⅡ酶切位点，以pFUSE为载体，获得携带有重组基因的质粒pFUSE-VL-SAH6；

S3：以pFUSE-VL-SAH6和pFUSE-VH-hFc-SAH6重组载体共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体；所述重组系统质粒在共转染宿主细胞后表达抗体；所述pFUSE载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为CaMV，信号肽选自外源蛋白的信号肽IL2或Igkappa。

一种单克隆抗体的制备，其特征在于：包括如下步骤：

步骤a：

S腺苷同型半胱氨酸的活化：将S腺苷同型半胱氨酸小分子至于容器中，并依次加入二甲亚砜、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：

抗原的偶联和纯化：将鸡卵清蛋白、牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白溶解于3.0mL0.01M pH＝7.4的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的S腺苷同型半胱氨酸滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，得到偶联的S腺苷同型半胱氨酸抗原，将得到的偶联的S腺苷同型半胱氨酸抗原进行透析纯化，得到S腺苷同型半胱氨酸免疫抗原和反筛抗原。

步骤c：

采用步骤b得到的S腺苷同型半胱氨酸免疫抗原免疫动物，鼠尾血清经过检测ELISA和小分子竞争ELISA，确定需要融合的小鼠编号，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过SAH反筛抗原多轮筛选，得到一株S腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体SAH6-FX

作为本发明的一种优选技术方案所述抗S腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体的序列，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的碱基序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO:2。

作为本发明的一种优选技术方案，所述人源化重组质粒的序列包含重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。

与现有技术相比，本发明能达到的有益效果是：

1、该偶联物方法可以增加载体蛋白载有S腺苷同型半胱氨酸小分子的数量，同时更好的展示S腺苷同型半胱氨酸的抗原表位，能显著增强偶联物的免疫原性，产生与目标小分子特异性结合的抗体。

附图说明

图1为本发明鼠尾血清小分子竞争ELISA

图2为本发明测序细胞株抗体序列

图3为本发明构建重组表达载体质粒

图4为本发明表达抗体SDS-PAGE图

图5为本发明ELISA实验检测结果

图6为发明S腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原结构式；

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例:

如图1-图5所示，

实施例1：S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原-免疫抗原的制备

2.1分别称取SAH(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)5mg，EDC(赛默飞世尔科技有限公司)19.2mg，NHS(北京伊诺凯科技有限公司)5.63mg依次溶解于1.25mLDMSO(国药集团化学试剂有限公司)溶液中，避光、室温搅拌反应30min；

2.2将20mg KLH(赛默飞世尔科技有限公司)溶解于3.0mLPBS中；

2.3将“步骤1溶液”缓慢加入“步骤2溶液中”，室温搅拌反应3h，反应完毕，将反应液装入透析膜中，0-4℃PBS PH＝7.4透析3天，每12h更换一次透析液，透析完成的液体分装，-20℃保存。

3.实验例2：S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原-反筛抗原的制备

3.1分别称取SAH 5mg，EDC 19.2mg，NHS 5.63mg依次溶解于1.25mLDMSO溶液中，避光、室温搅拌反应30min；

3.2将10mg OVA溶解于3.0mLPBS中；

3.3将“步骤1溶液”缓慢加入“步骤2溶液”中，室温搅拌反应3h，反应完毕，将反应液装入透析膜中，0-4℃PBS PH＝7.4透析3天，每12h更换一次透析液，透析完成的液体分装，-20℃保存。

实施例3:杂交瘤细胞株构建

用0.2M的pH为8.5的磷酸缓冲液将S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原稀释至1.0mg/mL，取6-8周龄雌性BaLb/c小鼠，首次免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原，共200μL/只。14天后进行第二次加强免疫，方法为取50μg S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原用弗氏不完全佐剂乳化，共200μL/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在7天后，方法与第二次加强免疫相同。一周后取小鼠尾血清ELISA检测抗体效价。

实施例4:免疫小鼠鼠尾血清效价检测--小分子竞争ELISA

抗体结合活性鉴定：用1.0μg/孔包被S腺苷同型半胱氨酸反筛抗原的ELISA板，分别以稀释倍数为1×10

实施例5:单克隆抗体制备及纯化

取6-8周龄的健康BaLb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，500μL/只，5天后腹腔注射单克隆细胞(约1.2×10

实施例6:确定抗体的有效检测游离小分子浓度范围

用1.0μg/孔包被S腺苷同型半胱氨酸反筛抗原的ELISA板，使用封闭液(含0.2％Tween-20，5％BSA)封闭1h，纯化得到的抗体使用抗体稀释液稀释至2.0μg/mL，游离S腺苷同型半胱氨酸小分子使用抗体稀释液稀释至13.40μg/mL、8.60μg/mL、4.30μg/mL、2.15μg/mL、1.08μg/mL、0.54μg/mL、0.27μg/mL、0.13μg/mL、0μg/mL，第一行每孔加入50μL 2.0μg/mL抗体和50μL抗体稀释液，第二行每孔加入50μL 2.0μg/mL抗体和50μL上述稀释好的游离S腺苷同型半胱氨酸小分子稀释液，37℃孵育30min。用PBST洗涤板5次，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1：10000)作为第二抗体，37℃孵育20min。洗涤同上，每孔加入100μL的显色液，37℃显色5min，加入50μL的2moL/L H

实施例7:公开抗体核苷酸序列--等待抗体测序核苷酸序列

运用实施例6的方法，可以筛选出灵敏度高特异性好的一株单克隆细胞，我们将这株单克隆细胞送到生物公司(苏州安升达生物科技有限公司)进行细胞测序，得到相应的抗体氨基酸序列。其中重链可变区VH碱基组成SEQ ID NO:1，轻链VL碱基组成SEQ ID NO:2

实施例8:人源化重组质粒的获得

具体按照以下方法进行：

(1)、重组抗体基因的获得

以实施例8中得到的SAH6抗体的重链可变区基因VH与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，人源抗体的Fc基因序列参考人IgG1 Fc基因序列，构建重组的人源化SAH6抗体的重链序列VH-hFc-SAH6。

合成基因片段(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)的两端设计EcoRI与NHEI酶切位点，以pFUSE为载体，获得携带有重组基因的质粒pFUSE-VH-hFc-SAH6(重链)；合成基因片段(SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7)的两端设计EcoR I与AvrⅡ酶切位点，以pFUSE为载体，获得携带有重组基因的质粒pFUSE-VL-SAH6。

合成基因片段均由安徽通用生物科技有限公司合成。

具体的操作步骤如下：

1-1、将含有重链序列VH-hFc-SAH6与轻链序列VL-SAH6的原核质粒pUC57-VH-hFc-SAH6和pUC57-VL-SAH6质粒，使用合成基因片段(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)对原核质粒pUC57-VH-hFc-SAH6进行PCR，合成基因片段(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)对原核质粒pUC57-VL-SAH6进行PCR。

1-2、将纯化后的PCR产物分别经EcoRI与NHEI双酶切和EcoR I与AvrⅡ双酶切，酶切完成后在反应体系中加入1μL DpnI，于37℃反应30min，消化掉模板DNA；

其中使用的酶切体系为：

2μg载体DNA或者PCR产物

3.5μL 10×buffer

1μL EcoRI(Takara)

1μL NHEI(Takara)

补足去离子水

Σ35μL 37℃ 2h

1-3、酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，切取目的片段，经PCR产物试剂盒(FastPure GEL DNA DC301-01 Vazyme)提取回收VL-SAH6片段、VH-hFc-SAH6片段与pFUSE载体片段；

2-4、进行连接反应；

连接反应体系为：约0.1pmoL VL-SAH6片段或VH-hFc-SAH6片段，约0.01pmoLpFUSE载体DNA片段，1μL T4 DNA Ligase缓冲液(NEB)，1μL T4 DNA Ligase(NEB)，加去离子水补足到10μL体系，16℃连接过夜。取3μL反应产物转化至100μL感受态细胞DH5a(Vazyme)中；

2-5、筛选获得重组质粒；

挑取阳性克隆，经37℃培养12h后，用质粒小提试剂盒(Qigen)提取质粒，分别得到重组质粒pFUSE-VL-SAH6(轻链)和pFUSE-VH-hFc-SAH6(重链)，并对提取的质粒送到上海生工，进行测序鉴定。

实施例9:利用重组质粒转染表达CHO细胞获得人源化重组SAH6抗体

将测序正确的阳性克隆大量摇菌，按照(天根DP117)说明书中提质粒，共转染至状态良好的CHO细胞中，20μg的pFUSE-VL-SAH6(轻链)与30μg的pFUSE-VH-hFc-SAH6(重链)质粒通过转染试剂共转染到30mL的1×10

SAH抗体成功表达，非还原条件下，二硫键未被破坏，抗体的轻重链不能打开，加入DTT可打开二硫键成线性结构，抗体重链大小55KDa，轻链大小26KDa。在图中，1：蛋白质标志物；2：未加DTT还原剂的抗SAH6抗体；3：加DTT还原剂的SAH6抗体。

实施例10:运用抗原偶联物检测重组抗体的检测范围

同型半胱氨酸项目的检测限≤0.13μg/mL，本实验使用1个空白对照和8个不同浓度的S腺苷同型半胱氨酸小分子稀释液，13.40μg/mL、8.60μg/mL、4.30μg/mL、2.15μg/mL、1.08μg/mL、0.54μg/mL、0.27μg/mL、0.13μg/mL，第一行每孔加入50μL 2.0μg/mL抗体和50μL抗体稀释液，第二行每孔加入50μL 2.0μg/mL抗体和50μL上述稀释好的游离S腺苷同型半胱氨酸小分子稀释液，37℃孵育30min。用PBST洗涤板5次，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1：10000)作为第二抗体，37℃孵育20min。洗涤同上，每孔加入100μL的显色液，37℃显色5min，加入50μL的2moL/LH

通过SAH竞争ELISA确定重组抗体检测范围为0.13μg-6.7μg/mL，四参数Logistic曲线拟合R2＝0.997，实验结果说明重组SAH重组抗体可以用于S腺苷同型半胱氨酸的定量检测。

一种单克隆抗体的应用

包括以下步骤：将S腺苷同型半胱氨酸小分子与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，得到一第一中间体。

将载体蛋白加入到所述第一中间体中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的S腺苷同型半胱氨酸抗原进行透析纯化，从而得到所述S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。

用0.2M的pH为8.5的磷酸缓冲液将S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原稀释至1.0mg/mL，取6-8周龄雌性BaLb/c小鼠，首次免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原，共200μL/只。14天后进行第二次加强免疫，方法为取50μg S腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原用弗氏不完全佐剂乳化，共200μL/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在7天后，方法与第二次加强免疫相同。一周后取小鼠尾血清ELISA检测抗体效价。

本发明提供抗体结合活性鉴定：用1.0μg/孔包被S腺苷同型半胱氨酸反筛抗原的ELISA板，分别以稀释倍数为1×10

选择鼠尾血清小分子竞争ELISA反应强烈的小鼠进行其脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过SAH反筛抗原多轮筛选，得到S腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体，通过ELSIA实验筛选出灵敏度和特异性比较高的细胞株。

将优化后单克隆抗体细胞株经测序后，得到相关序列并构建重组表达质粒，表达抗体性能稳定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。