检测Choanephora cucurbitarum的靶标、LAMP引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及检测Choanephora cucurbitarum的靶标、LAMP引物组合物及其应用。

背景技术

瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)是一种重要的植物病原菌，属于接合菌门真菌，能侵染多种植物，如瓜类、秋葵、薄壳山核桃和油菜等，世界广布，寄主范围广泛，引起植株湿腐、果腐、花腐、芽枯、叶斑等多种症状，在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。Choanephora cucurbitarum主要以菌丝体随病残体或产生接合孢子留在土壤中越冬，翌年春天侵染植物，发病后病部长出大量孢子，借风雨或昆虫传播。该菌腐生性强，只能从伤口侵入生活力衰弱的花、叶或果实。棚室栽培的植物，在高温高湿，生活力衰弱或低温、高湿条件，日照不足、雨后积水、有伤口的情况易发病。

目前，针对Choanephora cucurbitarum的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据Choanephora cucurbitarum的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将Choanephora cucurbitarum与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。普通PCR技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。LAMP技术作为一种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前国内外尚未见利用LAMP技术检测Choanephora cucurbitarum的相关报道。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一，目前LAMP检测设计的引物的来源主要是转录间间隔区(ITS)，但是没有足够多的位点来区分相似种，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中Choanephora cucurbitarum的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测Choanephora cucurbitarum的问题，而提供了一种快速检测Choanephora cucurbitarum的LAMP检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。本发明以RNApolymeraseIIlargestsubunit(RPB1)基因为检测的靶标序列，设计了Choanephora cucurbitarum的特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了Choanephora cucurbitarum的LAMP快速检测方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现：

特异性检测靶标RPB1在检测Choanephora cucurbitarum中的应用，所述特异性检测靶标RPB1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

检测Choanephora cucurbitarum的LAMP引物组合物，该引物组合物由以下引物组成:如SEQ ID No.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID No.3所示的反向内引物BIP，如SEQ IDNo.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID No.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID No.6所示的反向环引物LB。

本发明所述的引物组合物在制备Choanephora cucurbitarum的LAMP检测试剂盒中的应用。

一种检测Choanephora cucurbitarum的LAMP试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。

所述的检测Choanephora cucurbitarum的LAMP试剂盒，还包含以下组分：10×ThermoPolBuffer，MgS0

本发明所述的引物组合物或试剂盒在检测Choanephora cucurbitarum的应用。

一种Choanephora cucurbitarum的LAMP检测方法，其特征在于提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，加入所述LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在Choanephora cucurbitarum，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在Choanephora cucurbitarum。

作为本发明的一种优选，所述的LAMP反应体系：2.5μL10×ThermoPol Buffer，8mmol·L

作为本发明的一种优选，所述LAMP反应的程序为：63℃反应扩增60min。

本发明的检测Choanephora cucurbitarum的方法，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP反应；Hydroxylnaphthol blue(HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg

本发明与现有技术相比,其优点和积极效果表现在:

本发明发现了新的靶标基因用于Choanephora cucurbitarum的LAMP检测，基于该基因，尤其是该基因上的特异靶区域，本发明设计了LAMP引物组合物用于Choanephoracucurbitarum的检测，具有特异性强、准确度高、灵敏度好的优点。

(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散,这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过观察溶液颜色的变化，判断是否有目标菌株的存在，提高其在田间的应用价值。

(2)恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在BstDNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)准确性高：由于传统Choanephora cucurbitarum检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而Choanephora cucurbitarum的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明根据Choanephora cucurbitarum的RPB1基因(Genbank登录号：MT500038)的序列，该序列在Choanephora cucurbitarum中的基因组进化区和保守区轮流间隔。利用Blast软件将Choanephora cucurbitarum的基因组序列与其它真菌的基因组序列进行比较，选取了Choanephora cucurbitarum特有的一端序列并设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域(表1)，其特异性比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行Choanephora cucurbitarum检测。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

(4)灵敏度高：本发明建立的Choanephora cucurbitarum的LAMP检测方法，灵敏度非常高，可以达到100pgDNA，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速地检测出Choanephora cucurbitarum。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为Choanephora cucurbitarumRPB1基因核酸序列及引物位置。

图2为检测Choanephora cucurbitarumLAMP引物的特异性验证：

使用本发明设计的引物对不同Choanephora cucurbitarum菌株及其他菌物菌株的DNA样本进行LAMP扩增检测，在63℃水浴恒温扩增60min后观察反应溶液的颜色变化，结果显示：不同Choanephora cucurbitarum菌株均呈天蓝色阳性反应，其他参试菌物菌株的反应管中溶液均成紫色阴性反应(图2)。

图3LAMP检测Choanephora cucurbitarum的灵敏度：

LAMP扩增不同浓度基因组DNA；26μL的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg、lpg、100fg、l0fgDNA的扩增结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，并非只有这些实例。

实施例1：利用LAMP检测Choanephora cucurbitarum

1、用于检测Choanephora cucurbitarum的LAMP引物组合物：如SEQ ID N0.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID N0.3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID N0.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID No.6所示的反向环引物LB(图1)。

2、检测方法：提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，加入包括上述引物在内的反应溶液进行LAMP反应，LAMP反应体系为：2.5μL10×ThermoPol Buffer，8mmol·L

3、为了验证LAMP方法的特异性，以6株不同Choanephora cucurbitarum菌株和其他24种真菌菌株作为供试材料(表2)，LAMP检测结果显示：只有以Choanephoracucurbitarum为模板的反应管溶液呈现天蓝色阳性反应，其他参试真菌菌株和阴性对照均成紫色阴性反应(图2)。

表1

表2

实施例2：Choanephora cucurbitarum LAMP检测的灵敏度

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的Choanephora cucurbitarum的DNA用分光光度计测定浓度，按照10倍梯度进行稀释，使其质量浓度依次为10ng·μL

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。