银纳米粒子负载甘露糖偶联PDA-EPL修饰介孔氧化硅复合材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

结核病是一种具有强烈传染性的慢性消耗性疾病，目前世界上已近三分之一的人感染结合。目前，临床上治疗病的一线药物主要有利福平、异烟肼和吡嗪酰胺等。研究发现，多种抗结核药物长期同时使用已催生出耐药菌株，此外这些抗结核药物长期使用也会对人体产生毒副作用。因此，面对这一严峻的问题，迫切需要开发新的抗菌剂用于终止结核病，为临床质量提供新思路。

研究发现，纳米材料在解决上述抗结核治疗中存在的问题上是非常有潜力的。目前，抗菌材料主要有多肽、聚合物和金属纳米粒子等，银纳米粒子具有毒性低、比表面积大的特点受到了研究者们的关注。越来越多的研究使用细菌、真菌和植物等合成银纳米粒子，但合成的价格昂贵、形貌不可控，且易发生团聚，导致粒子分散度降低而削弱抗菌性能。

综上所述，研究出能够降低银纳米粒子的毒副作用，并且减少抗菌剂的脱靶，显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料及其制备方法和应用，不仅成本低、高生物相容性，并且能够缩短结合分枝杆菌的治疗周期，为解决子偶临床上杀灭结核菌甚至是耐药结核菌提供新思路。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的第一个目的在于提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备方法，包括如下步骤：

S1.获得介孔氧化硅(SBA-15)，再加入多巴胺，使得多巴胺自聚合在介孔氧化硅的表面，形成聚多巴胺(PDA)修饰介孔氧化硅；

S2.向S1的反应体系中加入银源，银源与聚多巴胺螯合生成银纳米粒子负载聚多巴胺修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA)；

S3.向S2的反应体系中加入多聚赖氨酸(EPL)，形成银纳米粒子负载聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA-EPL)；

S4.向S3的反应体系中加入甘露糖，与聚多巴胺-多聚赖氨酸发生偶联反应，形成银纳米粒子负载甘露糖偶联聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料(Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL)。

本发明介孔氧化硅，其可以市售采购得到或采用现有技术中的常规方法制备得到，比如可以选用简单的水热法合成SBA-15。步骤S2中，聚多巴胺上的酚羟基螯合银源的银离子生成纳米银，得到银纳米粒子负载聚多巴胺修饰介孔氧化硅；S3步骤中多聚赖氨酸的加入，步骤4中甘露糖的加入，利用了甘露糖与聚多巴胺和赖氨酸的席夫碱反应，合成了银纳米粒子负载甘露糖偶联聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料。

海洋贻贝足部分泌的粘液分子富含的左旋多巴和赖氨酸可粘附在几乎所有有机和无机界面上。值得一提的是，多聚赖氨酸已于2004年经FDA批准作为食品防腐剂使用，食用后可作为必需氨基酸被人体吸收利用。多巴胺在弱碱性环境下可发生自聚合，粘附在介孔氧化硅表面形成薄膜聚多巴胺，PDA的酚羟基由于具有较强的还原性，还可作为还原剂在成膜表面原位还原银离子，形成稳定分散的球形银纳米粒子。多聚赖氨酸(EPL)分子骨架中富含-NH

具体的，S1步骤中，加入多巴胺后，采用超声的方法，使得多巴胺自聚合在介孔氧化硅的表面。

具体的，所述多巴胺和所述银源的投料摩尔比为1:(0.5-1)；

具体的，所述介孔氧化硅与所述多巴胺的投料质量比为1:(0.3-0.6)。

具体的，S3步骤中，反应温度为20-60℃，反应时间为6-12h；溶液的pH范围为6-8。

具体的，所述银纳米粒子负载聚多巴胺修饰介孔氧化硅与所述多聚赖氨酸的投料质量比为1:(0.2-0.6)。

具体的，所述银源为硝酸银、氟化银、氰化银、氯酸银、高氯酸银、碳酸氢银等中的一种。

具体的，S4步骤中，所述偶联反应在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下进行；

优选地，所述甘露糖和所述多聚赖氨酸的投料质量比为1:(0.2-0.5)。

本发明的第二个目的在于提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料，由上述的制备方法制备得到。

本发明的第三个目的在于提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的应用，将上述方法制备得到的复合材料，和/或将上所述复合材料用于耐药结核菌的杀灭。

现有技术中，在抗结核分枝杆菌方面，抗菌剂的脱靶导致抗结核效果不佳也是一个重要问题。本发明发现，甘露糖可与结核分枝杆菌表面特异C1q类受体(CD206)发生结合，可通过酰胺化反应使甘露糖的-COOH与PDA和EPL的-NH

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明实现了银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备，多聚赖氨酸的负载，能够提高体内生物利用度，其本身具有广谱抗菌的性能，此外甘露糖的偶联的引入，能够作为靶向识别分子偶联到微纳材料上，减少脱靶产生的毒性，为解决临床上杀灭结核菌甚至是耐药结核菌提供新思路。利用结核分枝杆菌表面高表达CD206受体即甘露糖受体的特性，再基于银纳米粒子和席夫碱的杀菌作用，构建了银纳米粒子负载甘露糖偶联聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料抗结核系统。

附图说明

图1为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的合成路线图；

图2为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的抗结核模式图；

图3为本发明制备的银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的透射电子显微镜图(TEM)；

图4为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的制备各步骤的(A)X射线电子衍射(XRD)和(B)拉曼光谱(Raman)；

图5为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的制备各步骤的C1s的高分辨X射线表面光电子能谱(XPS)；

图6为本发明不同的Ag@SBA-15/PDA和EPL含量与结核分枝杆菌(H37Rv)共培养平板图；

图7分别为Ag@SBA-15/PDA、EPL、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL对(A)结核分枝杆菌(H37Rv)和(B)耐多药结核菌(MDR)的最小抑菌浓度(MIC)图。

具体实施方式

下面将结合对本发明优选实施方案进行详细说明。

我们对Ag@SBA-15/PDA和EPL的比例进行优化，获得最佳抗结核效果的组合和较优的组合。当加入0.2mg EPL与结核分枝杆菌(H37Rv)共培养时，对H37Rv的生长无抑制作用；当加入2mg EPL与H37Rv共培养时，对H37Rv的生长抑制作用不大；当加入1mgAg@SBA-15/PDA与H37Rv共培养时，未见对H37Rv有抑制作用；当加入2mgAg@SBA-15/PDA与H37Rv共培养时，对H37Rv有抑制作用，但仍有菌生长；当加入1mgAg@SBA-15/PDA和0.2mg EPL时，平板上未见H37Rv生长；当加入0.5mgAg@SBA-15/PDA和0.2mg EPL时，平板上仍未见H37Rv生长。所以，Ag@SBA-15/PDA和EPL的最佳抗结核比例为5:2，按照上述比例合成了银纳米粒子负载甘露糖偶联聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL)材料。并做了实施例1-4，几组平行实验。

实施例1

本实施例提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备方法，包括如下步骤：

S1.将50mg介孔氧化硅(SBA-15)和20mg多巴胺加入到pH 8.5Tris-HCl(0.1M)溶液中，在超声条件下，使得多巴胺自聚合在介孔氧化硅的表面，洗涤、离心后烘干，获得聚多巴胺(PDA)修饰介孔氧化硅(SBA-15/PDA)粉末；

S2.将S1中获得的聚多巴胺(PDA)修饰介孔氧化硅40mg和2mL硝酸银(32mM)加入pH8.5Tris-HCl(0.1M)溶液中，搅拌2-6h，硝酸银与聚多巴胺螯合，生成银纳米粒子负载聚多巴胺修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA)，经洗涤、离心、烘干后，获得粉末；

S3.将S2中获得的银纳米粒子负载聚多巴胺修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA)50mg和20mg多聚赖氨酸(EPL)加入到pH 7.0Tris-HCl(0.1M)溶液中，搅拌6-12h，经洗涤、离心、烘干后，得到银纳米粒子负载聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA-EPL)粉末；

S4.在EDC/NHS的存在下，加入S3中获得的银纳米粒子负载聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅(Ag@SBA-15/PDA-EPL)50mg和5mg甘露糖，与聚多巴胺-多聚赖氨酸发生偶联反应，生成席夫碱，经洗涤、离心、烘干后，得到银纳米粒子负载甘露糖偶联聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料(Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL)粉末。

本发明的第二个目的在于提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料，由上述的制备方法制备得到。

实施例2

本实施例提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备方法，其与实施例1基本相同，不同之处在于，S3步骤中，加入的EPL的量为10mg。

实施例3

本实施例提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备方法，其与实施例1基本相同，不同之处在于，S3步骤中，加入的EPL的量为15mg。

实施例4

本实施例提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的制备方法，其与实施例1基本相同，不同之处在于，S3步骤中，加入的EPL的量为30mg。

我们分别选用Ag@SBA-15/PDA、EPL、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL，做了多组表征测试，以下将对表征结果进行详细阐述：

如图3为本发明制备的银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的透射电子显微镜图(TEM)，TEM结果显示：Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL具有规整的介孔孔道，且表面形成了颗粒状的银纳米粒子。

图4为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的制备各步骤的X射线电子衍射(XRD)、和拉曼光谱(Raman)。

XRD如图4(A)结果显示：Ag@SBA-15/PDA、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL的四个峰在38°、44°、64°和77°位置代表了布拉格反射(111)、(200)、(220)和(311)面，符合Ag(JCPDS Card No.04-0783)，表明立方晶型金属银的形成，且Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL的晶型更加明显。Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL还存在其他峰位于28°、32°、46°、55°、57°和67°，代表了(111)、(200)、(220)、(311)、(222)和(400)晶面，符合AgCl(JCPDS Card No.06-0480)，表明AgCl颗粒的存在；

拉曼光谱(Raman)(如图4(B))结果显示：Ag@SBA-15/PDA、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL均存在两个位于1406和1580cm

图5为本发明银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅的制备各步骤的X射线表面光电子能谱(XPS)。XPS结果显示：Ag@SBA-15/PDA、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL中Ag的原子百分浓度分别为0.87、1.22和0.59％，质量百分浓度分别为5.02、6.91和4.02％。Ag@SBA-15/PDA的C1s高分辨能谱中位于284.90和288.80eV处的峰为PDA的C-C/C-H和C＝O；Ag@SBA-15/PDA-EPL的C1s高分辨能谱中存在284.70、285.30和288.00eV处的峰，可能对应为C-C/C-H、C-N和C＝O，证明了EPL的成功负载；Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL的C1s高分辨能谱中存在284.80、286.00和287.60eV处峰，可能对应为C-C/C-H、C＝N和C＝O，表明PDA和EPL上的氨基与甘露糖上的羰基发生了反应生成了席夫碱(C＝N)(图5)。

实施例5

本实施例提供一种银纳米粒子负载甘露糖偶联多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅复合材料的应用，分别采用上述实施例1-4制备得到的复合材料，进行抗结核分枝杆菌的检测。

对比例

在进行抗结核效果测试时，我们选用了几组对比实验，分别是选用不同质量的EPL和Ag@SBA-15/PDA与结核分枝杆菌进行共培养，共培养结果如图6所示。

本发明中采用阿尔马蓝指示剂法分别检测Ag@SBA-15/PDA、EPL、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL对结核分枝杆菌(H37Rv)和临床分离的耐多药结核菌(MDR)的最小抑菌浓度(MIC)。临床分离的耐多药结核菌(MDR)对利福平和异烟肼的最小抑菌浓度(MIC)分别为64和32μg/mL。根据图7结果显示：Ag@SBA-15/PDA、EPL、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL对H37Rv的MIC分别为128、>512、128和64μg/mL；Ag@SBA-15/PDA、EPL、Ag@SBA-15/PDA-EPL和Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL对MDR的MIC分别为128、>512、32和16μg/mL。根据分级抑菌浓度指数(FICI)的计算(如表1)，Ag@SBA-15/PDA-EPL中Ag@SBA-15/PDA和EPL成分对H37Rv可能是协同作用，也可能无关；Ag@SBA-15/PDA-EPL中Ag@SBA-15/PDA和EPL成分对MDR均是协同抗结核作用。此外，Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL对H37Rv和MDR的MIC值较Ag@SBA-15/PDA-EPL均下降，表明甘露糖的引入可以增强银纳米粒子负载聚多巴胺-多聚赖氨酸修饰介孔氧化硅对结核菌的抗菌作用，可能与结核分枝杆菌表面高表达CD206受体有利于Ag@SBA-15/Man-PDA-EPL的识别和结合，也可能是由于甘露糖与PDA和EPL生成的席夫碱对结核菌的杀菌作用。

表1.Ag@SBA-15/PDA、EPL和Ag@SBA-15/PDA-EPL对结核分枝杆菌H37Rv和MDR的MIC值和相应的分级抑菌浓度指数(FICI)

以上所述仅为本发明较佳的实施方式，并非用以限定本发明的保护范围；同时以上的描述，对于相关技术领域中具有通常知识者应可明了并据以实施，因此其他未脱离本发明所揭露概念下所完成之等效改变或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。