基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞靶向富集与检测技术领域，具体涉及一种基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠、制备方法及其应用。

背景技术

磁性分离技术是提升生物样本中靶标检测灵敏度和特异性的关键。目前，绝大部分免疫磁珠依赖于表面直接修饰的抗体完成识别，由于化学偶联反应的随机性影响了其在磁珠表面的负载量和空间分布，影响了磁珠功能化的一致性和稳定性。此外，生物样本中伴随有大量核酸、蛋白质等大分子干扰物(例如，血液标本中总血清蛋白质的浓度高达60-80g/L)，被磁珠表面非特异吸附后产生较高的背景信号，严重干扰低浓度目标分析物(低至ng/L)的检测和量化。有鉴于此，开发能够减少甚至消除血液样本中非特异性靶标吸附的抗生物垢涂层在临床检验诊断中具有重要意义。生物样本中的细菌分离是磁性分离技术的一个重要应用场景，其快速、高灵敏检测有助于血流感染的早期诊断、延缓脓毒血症的进展。在过去十年中，基于细菌特异性适配体靶向捕获细菌的特性而构建的适体生物传感器已实现了对血标本中细菌的直接捕获和检测。这些传感技术主要采用核酸扩增放大、电化学、表面等离子共振以及表面增强拉曼光谱等方法。虽然相对于金标准方法—血培养而言，这些方法具有灵敏性高的优势，但所用检测仪器昂贵或需要复杂的操作，或只能在血培养阳性标本中检测，耗时长达8-10小时，无法满足临床快速检测的需求。因此，开发准确、快速且能直接检测血标本中细菌的方法具有重要价值。从临床标本中高效率分离循环肿瘤细胞(CTC)是当前磁性分离技术的另一个重要应用场景。

CTC作为液体活检标志物可以判断癌症的发生、发展和预后，具有重要的临床应用价值，由于血液样本CTC浓度丰度极低(例如，结肠癌患者血液中CTC高于3个/7.5mL可以判定为阳性)，难以直接进行检测分析，需要通过免疫或者物理方法分离富集后借助试剂盒、基因测序、荧光成像或者基因芯片等方式完成检测。开发能够选择性识别、分离复杂血液样品中的CTC，达到低丰度循环肿瘤细胞的高灵敏检测，是推动液体活检技术大范围进入临床应用的重要环节。

因此，需要一种能定向分离靶细胞，降低复杂生物样本中非特异性吸附的同时提升靶标分离效率的方法，实现细菌和循环肿瘤细胞的高灵敏检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种于金属有机骨架的抗生物垢磁珠、制备方法及其应用，能够定向分离靶细胞，降低复杂生物样本中非特异性吸附的同时提升靶标分离效率，同时利用染料负载UIO-66荧光探针和AuNPs负载化学发光探针的信号放大作用，实现细菌和循环肿瘤细胞的高灵敏检测。

本发明的基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠，所述抗生物垢磁珠以Fe

本发明的基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠的制备方法，包括以下步骤：

S1,通过水热法制备Fe

S2,磁芯表面包覆UIO-66型金属有机骨架功能壳层；

S3,磁珠表面相继偶联功能核酸和磷酸聚乙二醇，实现特异性识别单元和抗生物垢功能化修饰；

进一步，步骤S1中，Fe

将六水合三氯化铁溶于乙二醇和二乙二醇混合溶液中充分搅拌至澄清淡黄色，然后加入聚乙二醇和醋酸钠搅拌至溶液变成土黄色粘稠液体，然后在温度为150-250℃下反应4-8小时后冷却至室温，收集黑色产物后清洗/磁分离后分散于无水乙醇中，制得磁珠分散液；

进一步，步骤S2中，采用锆基金属有机骨架包覆磁珠形成UIO-66型金属有机骨架功能壳层；

进一步，步骤S2中，将磁芯分散液磁分离后洗涤，加入八水氯氧化锆、二氨基对苯二甲酸和冰醋酸超声混匀呈黑色混合溶液，然后在温度为100-140℃下机械搅拌10-12小时后室温冷却，在外加磁场作用下使砖红色产物聚集在磁场周围，将砖红色产物清洗后磁分离，冷冻干燥6-10小时，制得Zr-mMOF；

进一步，步骤S3中，将Zr-mMOF加入5’端磷酸根修饰的鲍曼不动杆菌特异性适配体，充分混用后在摇床上孵育，然后分离出探针，去除多余适配体后分散于磷酸聚乙二醇水溶液中，充分混用后在摇床上孵育，然后再次分离出探针，除去多余适配体后分散于Tris-HCl缓冲液；

进一步，摇床温度控制为35-40℃，摇床转速为1500-2500rpm，缓冲液pH值为中性。

本发明还公开一种抗生物垢磁珠结合染料负载UIO-66荧光信号放大探针/纳米金(AuNPs)负载化学发光探针在细胞分离中的应用。

进一步，包括以下步骤：

将基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠加入待检的鲍曼不动杆菌样本形成混合液，然后在摇床上孵育，经磁分离后用Tris-HCl缓冲液清洗并去除未结合的细菌，然后将分离物重悬于Tris-HCl缓冲液，然后加入染料负载UIO-66荧光信号放大探针后在摇床上再孵育，孵育结束后经磁分离并用Tris-HCl缓冲液洗涤，将洗涤所得复合物重悬于磷酸氢二钠溶液，再次孵育后磁分离，取上清液用于荧光信号检测。

一种抗生物垢磁珠结合纳米金AuNPs负载化学发光探针用于特定循环细胞检测的方法，包括以下步骤：

将基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠加待检的鲍曼不动杆菌样本，所形成的混合液在摇床上孵育，然后经磁分离后用Tris-HCl缓冲液清洗去除未结合的细菌，然后将分离物重悬于Tris-HCl缓冲液，然后加入AuNPs负载化学发光探针后在摇床上孵育，孵育结束后经磁分离后，用PBS缓冲液洗涤，所得复合物重悬于PBS缓冲液，吸取混合液加入预混好的化学发光混合液，检测化学发光信号。

本发明的有益效果是：本发明公开的于金属有机骨架的抗生物垢磁珠、制备方法及其应用，通过锆基金属有机骨架壳层包覆的抗生物垢功能磁珠可定向分离靶细胞，结合具有信号放大作用的染料负载UIO-66荧光探针和AuNPs负载化学发光探针，不仅可以有效降低生物非特异性吸附和提升靶标分离效能，还能提高检测细菌和循环肿瘤细胞的灵敏检度。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

图1为抗生物垢磁珠的形貌表征图：其中，左图为裸磁芯的扫描电镜(A)和透射电镜(a)图，右图为抗生物垢磁珠扫描电镜(B)和透射电镜(b)图；

图2为磁珠抗生物垢修饰前后的理化性表征：其中，左图为磁滞曲线图，中图为傅里叶红外光谱图，右图为zeta电位分析图；

图3为抗生物垢磁珠的非特异性吸附性能测试对比图；

图4为抗生物垢磁珠捕获检测细菌：其中，左图为染料负载UIO-66荧光信号探针XRD图，中图为加入磷酸盐前后探针荧光信号强度测试图，右图为不同浓度细菌对应的荧光信号强度变化图；

图5为抗生物垢磁珠捕获检测循环肿瘤细胞：其中，左图为AuNPs负载化学发光探针透射电镜图，中图为AuNPs负载化学发光探针信号强度测试图，右图为不同浓度循环肿瘤细胞对应的化学发光信号强度变化图。

具体实施方式

实施例一

基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠联合染料负载UIO-66荧光探针检测血液样本中的鲍曼不动杆菌，其操作方法包括以下步骤：

(1)抗生物垢功能磁珠的制作

A.纳米磁芯的制备：将六水合三氯化铁(2.0g)溶于乙二醇(20mL)和二乙二醇(20mL)混合溶液中充分搅拌至澄清淡黄色，加入聚乙二醇(PEG-800，2.0g)和醋酸钠(3.0g)，继续搅拌30分钟至溶液变成土黄色粘稠液体。将混合物转移至高压反应釜，在200℃下反应6小时，冷却至室温。收集黑色产物，用无水乙醇连续清洗/磁分离三次后，分散于50mL无水乙醇中，室温保存。

B.锆基金属有机骨架包覆的磁珠(Zr-mMOF)的制备：取10mL步骤(1)所制备磁芯分散液，磁分离后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，分散于装有45mL DMF的三颈圆底烧瓶。加入八水氯氧化锆(161mg)、二氨基对苯二甲酸(90mg)和冰醋酸(5mL)，超声混匀。黑色混合溶液在120℃下机械搅拌(300rpm)反应，溶液在30分钟内由深黑色逐渐变成砖红色。12小时后停止反应，室温冷却，在外加磁铁的作用下，砖红色产物聚集在磁场周围，上清液变澄清，弃去上清。砖红色产物用DMF和无水乙醇溶液连续清洗三次后磁分离，经冷冻干燥8小时，最后置于4℃保存备用。

C.抗生物垢功能磁珠的制备(FmMOF)：取160μL(4.0mg)的Zr-mMOF(25mg/mL)加入1mL含有100nM 5’端磷酸根修饰的鲍曼不动杆菌特异性适配体(Tris-HCl缓冲液，20mM，pH7.4)，充分混用后在摇床上孵育1小时(37℃，200rpm)。用磁铁将探针分离，去离子水清洗三次除去多余适配体后，分散于1.0mL浓度为10％(wt％)的磷酸聚乙二醇水溶液，充分混用后在摇床上孵育1小时(37℃，200rpm)。用磁铁将探针分离，Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)清洗三次除去多余适配体后，分散于1.16mL Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)，4℃保存备用。

(2)染料负载UIO-66荧光信号放大探针的制备

A.UIO-66-NH

B.染料负载UIO-66荧光信号放大探针的制备：将500μL的UIO-66-NH

(3)荧光法检测细菌：将80μL步骤(1)制备好的捕获探针FmMOF加入1mL待检的鲍曼不动杆菌样本，混合液在摇床上37℃孵育1小时，经磁分离后，用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.4)清洗三次去除未结合的细菌，然后将分离物重悬于1mL Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.4)。然后加入3μL步骤(2)制备的染料负载UIO-66荧光信号放大探针，在37℃摇床上再孵育1小时。磁分离后，用Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)洗涤3次，所得复合物重悬于400μL磷酸氢二钠溶液(1M)。孵育5分钟后，磁分离，取200μL上清液检测荧光信号。

本发明基于锆基金属有机骨架的抗生物垢磁珠结合染料负载UIO-66荧光探针于检测鲍曼不动杆菌的分离与检测，其检测原理为利用锆基有机骨架纳米材料包被磁珠外层形成核-壳结构的磁性锆基金属有机骨架微球，利用其表面的锆位点与磷酸根标记的细菌特异性适配体中的P-O键形成Zr-O-P键使其以“尾-端结合”的方式固定在磁性纳米球表面。捕获细菌后，外加磁场可选择性地将细菌从血液样本中分离。进一步利用锆基金属有机骨架纳米粒UIO-66负载荧光染料，以相同方式联接5’端磷酸根修饰的细菌脂多糖特异性的适配体，封闭装载荧光染料的同时增加探针的靶向识别性能。在高浓度磷酸根离子的作用下，UIO-66结构被破坏，释放荧光染料，实现快速、有效的信号放大。在捕获的细菌中加入信号放大探针，共孵育后形成双探针夹心复合物，继而加入高浓度磷酸盐，荧光素释放至上清液中完成靶向性荧光信号输出。上清液中的荧光信号与捕获的细菌数量呈正相关，在缓冲液或血液样本中都有良好的线性关系，可以实现对鲍曼不动杆菌定量检测。

锆基金属有机骨架微球的成功合成对此传感器的制备起着至关重要的作用，本发明采用扫描透射电镜、大角度环形暗场扫描透射电子显微镜和元素维度谱分布分析对其进行了形态学表征。如附图1所示，核-壳结构的磁性锆基金属有机骨架纳米球的透射电镜结果显示，均一的球形结构，且平均尺寸约360nm，大角度环形暗场扫描透射电子显微镜显示，明显的壳核结构，壳的厚度在30nm左右。元素分析图谱显示锆元素和铁元素均匀的分布于纳米球的壳和核上，提示核-壳结构的锆基金属有机骨架纳米球(Zr-mMOF)构建成功。进一步对其的磁性进行表征，磁力曲线显示和磁球相比，Zr-mMOF具有良好的磁性(附图2左)，保障其能够快速分离细菌。

为了证明细菌特异性的适配体已经牢固地结合在锆基金属有机骨架表面，我们采用傅立叶变换红外光谱和Zeta电位进行表征。附图2中所示傅立叶变换红外光谱显示适配体修饰后P-O拉伸震动键从1040cm

本发明就抗生物垢磁珠联合染料负载UIO-66荧光探针检测细菌的可行性进行了证明：

首先通过细菌计数试验证实捕获探针Zr-mMOF-p-Ab-Apt可以捕获细菌。将探针与鲍曼不动杆菌共孵育后，磁性分离后，将捕获的沉渣接种于LB平板上培养16-18小时后，可见平板上有显著菌落生长，而对照组未见细菌生长，提示捕获探针可以捕获细菌。其次，为验证信号探针的信号放大的策略，我们采用透射电镜、XRD和荧光检测进行评价，在加入1M磷酸氢二钠溶液后，乳白色的UIO-66溶液变得澄清。透射电镜显示分散性良好的UIO-66纳米粒发生聚集，且棱角清晰的八面体结构被破坏，边缘模糊不清。附图4左中XRD显示典型清晰的衍射折线谱已消失，提示1M磷酸氢二钠溶液破坏了UIO-66。进一步将信号探针加入1M磷酸氢二钠，荧光检测结果显示，加入1M磷酸氢二钠后，探针的荧光信号在512nm处有显著增强，提示信号探针中UIO-66结构破坏，释放荧光素而实现信号放大。因此，将此信号探针与上述细菌形成的复合物共孵育后，磁分离，取细菌和双探针夹心的复合物重悬于1M磷酸氢二钠后，上清液产生明显的荧光信号，而显著高于对照组的荧光信号(附图4中)。以上结果表明该传感策略具有检测靶细菌的能力。

本发明对该传感策略的重复性进行了试验。方法如下：取三个浓度水平的鲍曼不动杆菌菌液(10

本发明对该传感器的特异性进行了试验。制备10

为了评估对靶细菌的分析性能，我们在稀释全血标本中加入一系列不同浓度的靶细菌进行了测试。如附图4右所示，当靶细菌浓度在10

实施例二

基于金属有机骨架的抗生物垢磁珠联合AuNPs负载化学发光探针检测循环肿瘤细胞，其操作方法包括以下步骤：

(1)抗生物垢功能磁珠的制作

A.纳米磁芯的制备：将六水合三氯化铁(2.0g)溶于乙二醇(20mL)和二乙二醇(20mL)混合溶液中充分搅拌至澄清淡黄色，加入聚乙二醇(PEG-800，2.0g)和醋酸钠(3.0g)，继续搅拌30分钟至溶液变成土黄色粘稠液体。将混合物转移至高压反应釜，在200℃下反应6小时，冷却至室温。收集黑色产物，用无水乙醇连续清洗/磁分离三次后，分散于50mL无水乙醇中，室温保存。

B.锆基金属有机骨架包覆的磁珠(Zr-mMOF)的制备：取10mL步骤(1)所制备磁芯分散液，磁分离后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，分散于装有45mL DMF的三颈圆底烧瓶。加入八水氯氧化锆(161mg)、二氨基对苯二甲酸(90mg)和冰醋酸(5mL)，超声混匀。黑色混合溶液在120℃下机械搅拌(300rpm)反应，溶液在30分钟内由深黑色逐渐变成砖红色。12小时后停止反应，室温冷却，在外加磁铁的作用下，砖红色产物聚集在磁场周围，上清液变澄清，弃去上清。砖红色产物用DMF和无水乙醇溶液连续清洗三次后磁分离，经冷冻干燥8小时，最后置于4℃保存备用。

C.抗生物垢功能磁珠的制备(FmMOF)：取160μL(4.0mg)的Zr-mMOF(25mg/mL)加入1mL含有100nM 5’端磷酸根修饰的鲍曼不动杆菌特异性适配体(Tris-HCl缓冲液，20mM，pH7.4)，充分混用后在摇床上孵育1小时(37℃，200rpm)。用磁铁将探针分离，去离子水清洗三次除去多余适配体后，分散于1.0mL浓度为10％(wt％)的磷酸聚乙二醇水溶液，充分混用后在摇床上孵育1小时(37℃，200rpm)。用磁铁将探针分离，Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)清洗三次除去多余适配体后，分散于1.16mL Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)，4℃保存备用。

(2)AuNPs负载化学发光探针的制备

A.AuNPs的合成：配置50mL浓度为1mM的氯金酸(HAuCl

B.AuNPs负载化学发光探针的制备：取200μL的AuNPs溶液依次加入初始浓度为10μM的功能核酸和初始浓度50mg/mL的辣根过氧化物酶，使功能核酸终浓度达到1.0μM且辣根过氧化物酶终浓度达到0.6mg/mL，漩涡震荡混匀后在摇床上震摇30min(37℃，200rpm)。将混合液在-20℃冰箱冻存2h以上，室温解冻后离心30分钟(离心速度16000rpm)后用50μL的PBS缓冲液分散均匀，重复离心分离、PBS缓冲液分散5次以上，所得沉淀分散到50μL的PBS缓冲液中即得到AuNPs负载化学发光探针，4℃保存备用。

(3)化学发光法检测循环肿瘤细胞：将80μL步骤(1)制备好的捕获探针FmMOF加入1mL待检的鲍曼不动杆菌样本，混合液在摇床上37℃孵育1小时，经磁分离后，用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.4)清洗三次去除未结合的细菌，然后将分离物重悬于1mL Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)。然后加入5μL步骤(3)制备的AuNPs负载化学发光探针，在37℃摇床上再孵育1小时。磁分离后，用PBS缓冲液洗涤3次，所得复合物重悬于10μL的PBS缓冲液。用移液器吸取10μL混合液加入预混好的化学发光混合液，检测化学发光信号。

为测定本发明所制备AuNPs负载化学发光探针的形貌，采用透射电镜进行观测。由附图5左可知，本发明所制备的AuNPs负载化学发光探针单分散性良好，尺寸均一，平均粒径约为13nm。

为测试本发明所制备AuNPs负载化学发光探针的信号响应性能，采用光谱仪测定了其混合化学发光底物后的信号强度和稳定性。由附图5中可知，本发明所制备的AuNPs负载化学发光探针信号放大作用明显，取3μL探针溶液直接加入到预混好的化学发光底物反应液，测定的化学发光信号强度超过450A.U.。动力学试验还显示，所制备AuNPs负载化学发光探针的信号强度在1h内无明显衰减。

为了评估对循环肿瘤细胞的捕获和分析检测性能，我们在稀释全血标本中加入一系列不同浓度的循环肿瘤细胞进行了测试。如附图5右所示，当循环肿瘤细胞浓度在10

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。