犬乳头瘤病毒的检测试剂、试剂盒、引物对、引物组合及应用

技术领域

本发明属于病毒的检测和鉴定，尤其涉及一种犬乳头瘤病毒的检测试剂、试剂盒、引物对、引物组合及应用。

背景技术

犬病毒性乳头瘤(Canine viral papillomatosis)是由犬乳头瘤病毒(Caninepapillomavirus,CPVs)引起一种犬传染病，主要感染犬皮肤和黏膜的鳞状上皮，可以通过接触传播，感染后主要表现为感染部位出现疣或“花椰菜样”的乳头状瘤，如口腔、舌、唇周及生殖器或其他部位皮肤，影响犬的外观同时增加犬的痛苦，严重时可转变为鳞状细胞癌，并可引发犬只死亡。迄今，已鉴定出23种CPVs基因型，且不同亚型CPV基因组序列相似度低，目前暂无使用一精心设计的通用引物对可鉴定23种CPV任一亚型的报道；此外，相较于其他基因亚型CPVs，CPV1和CPV2的感染率最高、危害更大，并存在混合感染，而目前也无可同时鉴别CPV1和CPV2单独或共同感染的分子诊断技术。

PCR以简单、灵敏、特异等优点而被广泛应用，而对于病毒基因型如CPV、HPV的鉴定常常需要采取多次PCR才能确定，如此一来就存在耗时、耗材、易错等缺点。对于占比超过70％的CPV1和CPV2的鉴定，常需要利用两对亚型特异引物分别进行两次PCR才能确定。此外，目前尚无对主要感染亚型CPV1和CPV2病毒载量进行定量的方法。总之，现有的CPV检测方法无法满足实际需要。

鉴于此，有必要提供一种犬乳头瘤病毒的检测试剂、试剂盒、引物对、引物组合及应用，以解决或至少缓解上述无法快速精准鉴定CPV1和CPV2、且未对CPV1和CPV2进行定量分析的技术缺陷。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种犬乳头瘤病毒的检测试剂、试剂盒、引物对、引物组合及应用，以解决上述无法快速精准鉴定CPV1和CPV2、且未对CPV1和CPV2进行定量分析的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种鉴别CPV1亚型和/或CPV2亚型的引物组合，所述引物组合包括第一引物组或第二引物组；所述第一引物组包括上游引物CPV1/2L1-F和第一下游引物，所述第一下游引物包括下游引物CPV1L1-R1和下游引物CPV2L1-R1中的一种或两种；

所述第二引物组包括所述上游引物CPV1/2L1-F和第二下游引物，所述第二下游引物包括下游引物CPV1L1-R2和下游引物CPV2L1-R2中的一种或两种；

所述上游引物CPV1/2L1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物CPV1L1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物CPV1L1-R2的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述下游引物CPV2L1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物CPV2L1-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了一种定量检测CPV1亚型和/或CPV2亚型的引物对，其特征在于，定量检测CPV1亚型的引物对包括上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV1-L1-R0；和/或，定量检测CPV2亚型的引物对包括所述上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV2-L1-R0；

所述上游引物CPV1/2-L1-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物CPV1-L1-R0的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述下游引物CPV2-L1-R0的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。

本发明还提供了一种扩增CPV1亚型L1基因和/或CPV2亚型L1基因的引物对，其特征在于，扩增CPV1亚型L1基因的引物对包括上游引物CPV1L1-U和下游引物CPV1L1-D；和/或，扩增CPV2亚型L1基因的引物对包括上游引物CPV2L1-U和下游引物CPV2L1-D；

所述上游引物CPV1L1-U的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述下游引物CPV1L1-D的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述上游引物CPV2L1-U的核苷酸序列如SEQID NO.13所示，所述下游引物CPV2L1-D的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合或如上述任意所述的引物对在制备犬乳头瘤病毒的检测试剂中的应用。

本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合或如上述任意所述的引物对在制备犬乳头瘤病毒的检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种犬乳头瘤病毒的检测试剂，所述检测试剂包括如上述任意所述的引物组合和/或如上述任意所述的引物对。

本发明还提供了一种犬乳头瘤病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上述任意所述的检测试剂。

进一步地，所述还包括阳性对照试剂，所述阳性对照试剂中包括阳性对照品，所述阳性对照品具有如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示核苷酸序列中的至少一种。

本发明还提供了一种如上述任意所述的检测试剂在非诊断目的扩增犬乳头瘤病毒核酸提取物中的应用。

本发明还提供了一种如上述任意所述的检测试剂盒在非诊断目的扩增犬乳头瘤病毒核酸提取物中的应用。

本发明的有益效果至少包括：

本发明通过设计第一引物组和第二引物组，第一引物组包括上游引物CPV1/2L1-F、下游引物CPV1L1-R1和下游引物CPV2L1-R1；第二引物组包括上游引物CPV1/2L1-F、下游引物CPV1L1-R2和下游引物CPV2L1-R2；建立了可同时鉴别CPV主要亚型CPV1和CPV2单独或共感染的便捷PCR方法。本发明通过设计定量检测CPV1亚型和CPV2亚型的引物对，定量检测CPV1亚型的引物对包括上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV1-L1-R0，定量检测CPV2亚型的引物对包括所述上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV2-L1-R0；建立了一种实施CPV1、CPV2病毒载量的定量PCR方法。本发明中提供的引物和PCR方法为CPV1和CPV2的系统、便捷、快速检测以及相应检测试剂盒研发奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明中研发过程的流程示意图；

图2为本发明中CPV 1-23的部分序列截取图；

图3为本发明中CPV 1-23的另一部分序列截取图；

图4为本发明实施例1中，以CPV1或CPV2基因组DNA为模板，利用CPV1L1-U+CPV1L1-D，CPV2L1-U+CPV2L1-D引物对得到的PCR产物的电泳图谱；

图5为本发明实施例2中，以重组质粒为检测模板，利用CPV-General23-F0+CPV-General23-R0引物对得到的PCR产物的电泳图谱；

图6为本发明实施例2中，以倍比稀释的pEF-CPV1 L1质粒为检测模板，利用CPV-General23-F0+CPV-General23-R0引物对得到的PCR产物的电泳图谱；

图7为本发明实施例2中，以倍比稀释的pEF-CPV1 L1质粒为检测模板，利用CPV-General7-F+CPV-General7-R引物对得到的PCR产物的电泳图谱；

图8为本发明实施例2中，以16份CPV1-7任一亚型基因组样品为检测模板，利用CPV-Genera l23-F0+CPV-General23-R0引物对(General 23primer)或CPV-General7-F+CPV-General7-R引物对(General 7primer)得到的PCR产物的电泳图谱；

图9为本发明实施例3中，以pEF-CPV1-L1和/或pEF-CPV2-L1质粒为检测模板，利用第一引物组或第二引物组得到的PCR产物的电泳图谱；其中，(a)对应第一引物组，(b)对应第二引物组；

图10为本发明实施例3中，以16份单独或同时含CPV1或CPV2的基因组样品为检测模板，利用第一引物组得到的PCR产物的电泳图谱；

图11为本发明实施例4中CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0引物对的熔解曲线图；

图12为本发明实施例4中CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0引物对的熔解曲线图；

图13为本发明实施例4中利用CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0引物对建立的标准曲线图；

图14为本发明实施例4中利用CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0引物对建立的标准曲线图；

图15本发明实施例4中，以10倍梯度稀释的pEF-CPV1 L1 DNA为检测模板，利用CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0引物对得到的PCR产物的电泳图谱；

图16本发明实施例4中，以10倍梯度稀释的pEF-CPV2 L1 DNA为检测模板，利用CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0引物对得到的PCR产物的电泳图谱。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

作为对本发明中专用术语的说明，简并碱基是指在DNA或RNA分子中，存在一定程度上的替代性，即多种不同的碱基可以编码相同的氨基酸或核苷酸。这种替代性主要是由于遗传密码的简并性，即不同的三个核苷酸(或三个碱基)序列可以编码相同的氨基酸。在遗传密码中，这种简并性是通过密码子的多样性实现的。

需说明的是，以PCR为主的分子检测因其简单、灵敏和特异等优势而广泛应用，但在病毒具有众多基因型鉴定方面，如CPV、HPV等，通常需要多次PCR才能确定，导致耗时、耗材和易错等问题。虽然有文献(J Clin Microbiol.2011Feb；49(2):707-9)报道显示存在一种可通用检测CPV1-7亚型的PCR方法，但其对于后续鉴定出的CPV亚型(如CPV8-23亚型)则不一定有效，导致CPV的检出率不高，并且该先前建立的方法灵敏度仍待提高。

同时，对于占比超过70％的CPV1和CPV2的鉴定，也通常需要使用两对亚型特异引物进行两次PCR，而通过精心设计的3条引物可以实现一次PCR确定这两个亚型的单独或共同感染。此外，目前尚无对CPV感染主要亚型CPV1和CPV2的病毒载量进行定量的方法。综合而言，现有的CPV检测方法存在无法满足实际需求。

以此，本发明设计和建立了使用一对通用引物可检测23种CPV基因亚型任一亚型感染的PCR方法；另考虑到临床中CPV1、CPV2感染占大多数，设计和建立了使用一含3条引物对可同时鉴别CPV1和CPV2单独或共感染的便捷PCR方法；本发明还设计和建立了针对CPV1、CPV2实施病毒载量定量的引物对和定量PCR方法。

为了提高犬乳头瘤病毒的检出率、检测灵敏度、特异性和敏感性，并同时满足23种CPV基因亚型的检测，本发明提供了一种检测犬乳头瘤病毒的通用引物对，所述通用引物对包括上游引物CPV-General23-F0和下游引物CPV-General23-R0；所述上游引物CPV-General23-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物CPV-General23-R0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。需指出的是，在对CPV1和CPV2进行鉴别和定量分析之前，可以采用所述通用引物对对犬乳头瘤病毒进行检测，从而快速和准确地判断样品中是否含有犬乳头瘤病毒。

为了实现CPV1和CPV2的鉴别，本发明还提供了一种鉴别CPV1亚型和/或CPV2亚型的引物组合，所述引物组合包括第一引物组或第二引物组。所述第一引物组包括上游引物CP V1/2L1-F和第一下游引物，所述第一下游引物包括下游引物CPV1L1-R1和下游引物CPV2L1-R1中的一种或两种；所述第二引物组包括所述上游引物CPV1/2L1-F和第二下游引物，所述第二下游引物包括下游引物CPV1L1-R2和下游引物CPV2L1-R2中的一种或两种。优选地，为了实现一次PCR确定CPV1和CPV2的单独或共同感染，所述第一引物组可以包括所述上游引物CPV1/2L1-F、所述下游引物CPV1L1-R1和所述下游引物CPV2L1-R1；所述第二引物组可以包括所述上游引物CPV1/2L1-F、所述下游引物CPV1L1-R2和所述下游引物CPV 2L1-R2。所述上游引物CPV1/2L1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物CPV1L1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物CPV1L1-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物CPV2L1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物CPV2L1-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

为了实现CPV1亚型和CPV2亚型的定量分析，本发明还提供了一种定量检测CPV1亚型和/或CPV2亚型的引物对，定量检测CPV1亚型的引物对包括上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV1-L1-R0；定量检测CPV2亚型的引物对包括所述上游引物CPV1/2-L1-F0和下游引物CPV2-L1-R0。所述上游引物CPV1/2-L1-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物CPV1-L1-R0的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述下游引物CPV2-L1-R0的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

为了对CPV1亚型L1基因和CPV2亚型L1基因进行特异性的全长扩增，从而为CPV1亚型和CPV2亚型的检测提供基础，本发明还提供了一种扩增CPV1亚型L1基因和/或CPV 2亚型L1基因的引物对，扩增CPV1亚型L1基因的引物对包括上游引物CPV1L1-U和下游引物CPV1L1-D；扩增CPV2亚型L1基因的引物对包括上游引物CPV2L1-U和下游引物CP V2L1-D；所述上游引物CPV1L1-U的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述下游引物CPV 1L1-D的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述上游引物CPV2L1-U的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述下游引物CPV2L1-D的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

为了便于对CPV1亚型和/或CPV2亚型进行鉴定和定量分析，本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合或如上述任意所述的引物对在制备犬乳头瘤病毒的检测试剂中的应用。本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合或如上述任意所述的引物对在制备犬乳头瘤病毒的检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种犬乳头瘤病毒的检测试剂，所述检测试剂包括如上述任意所述的引物组合和/或如上述任意所述的引物对。当所述检测试剂同时包括如上述任意所述的引物组合和如上述任意所述的引物对时，所述检测试剂可以为两种试剂，一种为鉴别试剂，另一种为定量分析试剂。

本发明还提供了一种犬乳头瘤病毒的检测试剂盒，包括如上述任意所述的检测试剂。当所述检测试剂同时包括如上述任意所述的引物组合和如上述任意所述的引物对时，所述检测试剂盒同时包括上述鉴别试剂和定量分析试剂。

进一步地，所述检测试剂盒还可以包括阳性对照试剂，所述阳性对照试剂中包括阳性对照品，所述阳性对照品具有如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示核苷酸序列中的至少一种，优选为同时具有如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；在对23种CPV进行检测时，也可以同时具有如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列。

示例性地，所述阳性对照品中的核苷酸序列分别位于第一质粒载体、第二质粒载体、第三质粒载体-第二十三质粒载体；所述第一质粒载体具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，所述第二质粒载体具有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，所述第三质粒载体-第二十三质粒载体分别依次具有如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.39中所示的核苷酸序列。作为其中一种方式，为了对所述犬乳头瘤病毒的23种亚型进行检测对照，所述阳性对照品可以包括如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，或包括所述第一质粒载体、所述第二质粒载体和所述第三质粒载体-第二十三质粒载体；作为另一方式，为了对所述CPV1亚型和/或CPV2亚型进行鉴定对照，所述阳性对照品可以包括如SEQ ID NO.17～SEQ IDNO.18所示的核苷酸序列中的一种或多种，或包括所述第一质粒载体和所述第二质粒载体中的一种或多种。

为了对犬乳头瘤病毒进行快速和准确的检测，预先判断待测样品中是否含有犬乳头瘤病毒，所述检测试剂盒中还可以包括犬乳头瘤病毒的通用筛查试剂；优选地，所述通用筛查试剂中含有如上述任意所述的通用引物对。

本发明还提供了一种如上述任意所述的检测试剂在非诊断目的扩增犬乳头瘤病毒核酸提取物中的应用。本发明还提供了一种如上述任意所述的检测试剂盒在非诊断目的扩增犬乳头瘤病毒核酸提取物中的应用。所述犬乳头瘤病毒核酸提取物可以含有CPV1-23任意一种或多种亚型的L1基因，或CPV1-2任意一种或多种亚型的L1基因。

需指出的是，犬乳头瘤病毒的疫苗研发过程中，同样需要对犬乳头瘤病毒的核酸提取物进行扩增，甚至对CPV1亚型和CPV2亚型(占比超70％)进行鉴别和定量检测；因此，上述应用可以为非诊断目的的扩增，本发明属于如上述任意所述的检测试剂或如上述任意所述的检测试剂盒在非诊断目的下扩增犬乳头瘤病毒核酸提取物中的应用。

需说明的是，相较于文献(J Clin Microbiol.2011Feb；49(2):707-9)中提及的引物，本发明的检测范围更广，更具针对性，且灵敏度和特异性更优。

下表(记为表1)为本发明和相关文献中涉及的引物：

上表中，H、D、V、K、B、W、Y、M、N等表示简并碱基；简并碱基和正常碱基的对应关系见下表(记为表2)：

本发明中，所述第一质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.17)为CPV1 L1全长序列。

所述第二质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.18所示)为CPV2 L1全长序列。

所述第三质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.19所示)为通用引物所覆盖的CPV3L1部分序列。

所述第四质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.20所示)为通用引物所覆盖的CPV4L1部分序列。

所述第五质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.21所示)为通用引物所覆盖的CPV5L1部分序列。

所述第六质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.22所示)为通用引物所覆盖的CPV6L1部分序列。

所述第七质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.23所示)为通用引物所覆盖的CPV7L1部分序列。

所述第八质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.24所示)为通用引物所覆盖的CPV8L1部分序列。

所述第九质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.25所示)为通用引物所覆盖的CPV9L1部分序列。

所述第十质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.26所示)为通用引物所覆盖的CPV10L1部分序列。

所述第十一质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.27所示)为通用引物所覆盖的CP V11 L1部分序列。

所述第十二质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.28所示)为通用引物所覆盖的CP V12 L1部分序列。

所述第十三质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.29所示)为通用引物所覆盖的CP V13 L1部分序列。

所述第十四质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.30所示)为通用引物所覆盖的CP V14 L1部分序列。

所述第十五质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.31所示)为通用引物所覆盖的CP V15 L1部分序列。

所述第十六质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.32所示)为通用引物所覆盖的CP V16 L1部分序列。

所述第十七质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.33所示)为通用引物所覆盖的CP V17 L1部分序列。

所述第十八质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.34所示)为通用引物所覆盖的CP V18 L1部分序列。

所述第十九质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.35所示)为通用引物所覆盖的CP V19 L1部分序列。

所述第二十质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.36所示)为通用引物所覆盖的CP V20 L1部分序列。

所述第二十一质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.37所示)为通用引物所覆盖的CPV21 L1部分序列。

所述第二十二质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.38所示)为通用引物所覆盖的CPV22 L1部分序列。

所述第二十三质粒载体具有的核苷酸序列(SEQ ID NO.39所示)为通用引物所覆盖的CPV23 L1部分序列。

SEQ ID NO.17～39与相应CPV的对应关系见下表(记为表3)：

本发明还提供了一种CPV L1基因相对保守区域在设计犬乳头瘤病毒检测引物或在检测犬乳头瘤病毒中的应用。

需说明的是，本发明在设计通用引物时使用了简并碱基，简并碱基的使用是依据序列比对结果中与一致(consensus)序列的差异及位置而进行替换的，替换方式或规则是基于简并碱基符号对应表而实施的。本发明在探索阶段，曾尝试了不使用兼并碱基或在前述文献报道引物的区域设计引物，但效果极差。

参见图1所示，以下为本发明研发过程的详细阐述：

1、对23种CPV亚型L1基因序列进行比对，选择相对保守的两个区域设计引物，并将其中几个碱基替换成简并碱基(图2-3)；图2-3中，通过对犬乳头瘤病毒CPV1-23亚型L1基因序列比对而获得的用于设计通用引物的相对保守区域位于黑色线内；即，设计本发明中通用引物的区域为图2-3中CPV L1基因的404-425bp位置和1086-1108bp位置。

设计通用引物的CPV L1相对保守区域详见下表(记为表4)：

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对CPV1和CPV2亚型L1基因序列进行比对，设计同一条上游引物，和两条分别对CPV1和CPV2 L1基因特异的下游引物并使它们的扩增产物相差100bp；另各设计一对针对CPV1和CPV2 L1基因的用于定量PCR的引物；此外还各设计一对扩增全长CPV1和CPV2L1基因的引物。

2、检测CPVs的通用引物对、同时检测CPV1和CPV2 L1三引物对、定量检测CPV1和CPV2的引物对，以及扩增CPV1和CPV2全长L1基因的引物对等。

3、合成上述系列引物；合成除CPV1和CPV2 L1外，其它CPVs通用引物所覆盖的L1基因部分序列并将它们克隆至pUC57载体，获得相应的pUC57-CPV3-23 L1质粒。提供合成和克隆服务的公司为Genscript。

4、通过PCR，以CPV1和CPV2基因组DNA为模板和相应引物分别扩增其全长L1基因序列片段，并将其克隆至pEF-GFP载体中，分别获得pEF-CPV1 L1、pEF-CPV2 L1质粒作为后续检测的阳性模板。

5、以pEF-CPV1 L1、pEF-CPV2 L1质粒为模板，优化出检测23种CPV亚型的最佳试剂和反应条件。

6、以pEF-CPV1 L1、pEF-CPV2 L1单个或混合质粒为模板，利用共用上游引物和分别靶向CPV1 L1、CPV2 L1的下游引物所组成3条引物对，建立和优化检测CPV感染主要亚型CPV1、CPV2的最适试剂和反应条件。

7、将pEF-CPV1 L1、pEF-CPV2 L1质粒梯度稀释，利用CPV1、CPV2定量PCR引物对进行定量PCR反应，分析引物熔点曲线特异性、检测特异性及下限，并建立标准曲线。

8、利用通过传统分子检测技术如PCR和RCA等确知的CPV临床样品，对上述建立的各种检测方法进行验证，并与已报道相类似的方法进行比较。

9、经试验分析，本发明提供的引物和阳性模板为CPVs系统、便捷、快速诊断以及相应的检测试剂盒研发奠定了基础。

以下为本发明的具体示例：

实施例1

1.1CPV1与CPV2阳性对照(L1全长基因)质粒构建

1.1.1PCR扩增CPV1/2-L1目的片段

以CPV1或CPV2基因组DNA为模板，分别利用CPV1L1-U和CPV1L1-D、CPV2L1-U和CPV2L1-D引物对，通过常规PCR法分别扩增其L1基因全长序列。

本实施例中，设计CPV1L1-U的区域为SEQ ID NO.17序列中第1-24位碱基位置，设计CPV1L1-D的区域为SEQ ID NO.17序列中第1489-1512位碱基位置；设计CPV2L1-U的区域为SEQ ID NO.18序列中第1-25位碱基位置，设计CPV2L1-D的区域为SEQ ID NO.18序列中第1487-1512位碱基位置。

PCR体系(50μL)包括：22μL无菌水、1μL上游引物、1μL下游引物、25μL 2×PCR mix(Thermo fisher，K0171)及1μL DNA模板；反应条件均为95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，共设置35个循环；最后72℃10min。PCR反应结束后将产物进行琼脂凝胶电泳，并观察结果(图4)。

参见图4进行理解，本实施例利用含CPV1或CPV2基因组DNA为模板，以及本发明所设计的CPV1L1-U+CPV1L1-D，CPV2L1-U+CPV2L1-D引物对，实施PCR分别扩增获得它们的全长L1基因DNA片段，并将它们克隆至pEF-GFP载体用作阳性对照样品。

图4中的标记说明为：

M：DNA Marker；1：全长CPV1-L1基因DNA片段；2：全长CPV2-L1基因DNA片段；NC：阴性对照。

1.1.2CPV1/2-L1 DNA目的片段克隆至pEF-GFP载体

按照分子克隆方法，分别将CPV1 L1和CPV2 L1全长DNA片段(具体参见SEQ IDNO.17～18)克隆至pEF-GFP载体，原载体中的GFP片段为插入DNA片段所替代，从而获得pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1质粒(略)，测序证实后小量制备这些质粒DNA和测定其浓度，用作后续阳性对照。

1.1.3将合成的CPV3-23部分L1目的片段克隆至pUC57载体

将合成的通用引物所覆盖的CPV3-23 L1基因部分序列DNA片段(具体参见SEQ IDNO.19～39)克隆至pUC57载体，从而获得相应的pUC57-CPV3-23 L1质粒(Genscript公司完成)，稀释质粒DNA至指定浓度。用作后续阳性对照。

实施例2

1.2建立一种基于L1基因可通用检测23种不同亚型CPV的PCR方法

首先，以上述构建及制备的CPV各亚型L1重组质粒为模板，探究利用本研究所设计的通用引物对CPV-General23-F0+CPV-General23-R0检测CPV1-23亚型的可行性。

PCR体系(50μL)包括：22μL无菌水、1μL上游引物(20μM)、1μL下游引物(20μM)、25μL2×PCR mix(Thermo fisher，K0171)及1μL DNA模板；反应条件均为95℃2min；95℃30s，50℃30s，72℃45s，设置35个循环，最后72℃10min。PCR反应结束后将等量产物进行琼脂凝胶电泳，并观察结果(图5)。

参见图5进行理解，本实施例利用本发明所设计的CPV-General23-F0+CPV-General23-R0引物对，实施PCR检测分别含CPV1-23全长或部分L1基因片段的质粒，结果显示均能成功检测出各型CPVs(虽然部分条带较淡，但并不影响本领域技术人员对结果的判断)。

图5中的标记说明为：

N(Negative)：阴性对照；M：DNA ladder。

其次，按照上述方法，分析比较本发明所设计的通用引物对CPV-General23-F0+CPV-General23-R0和文献报道的能够通用检测CPV1-7亚型的引物对CPV-General7-F+CPV-General7-R进行CPV阳性质粒样品检测的表现。

图6-7结果显示，在以pEF-CPV1 L1质粒为检测模板，对倍比稀释的质粒样品进行检测中，表明本发明所设计引物对其检测表现(包括敏感性、特异性)完全优于文献报道者。其中本发明所设计的通用引物检测下限可达6.25×10

即，以构建的pEF-CPV1 L1质粒为检测样品，利用CPV-General23-F0+CPV-General23-R0引物对(图6，704bp)，与文献所报道CPV-General7-F+CPV-General7-R引物对(图7，389bp)分别实施PCR检测倍比稀释的样品，检测结果显示本研究所设计引物对其检测表现(包括敏感性、特异性)完全优于文献报道者。

图6-7中的标记说明为：

1-10：CPV1 L1 DNA含量依次为6.25×10

最后，按照上述方法，分析比较本发明所设计的通用引物对CPV-General23-F0+CPV-General23-R0和文献报道的能够通用检测CPV1-7亚型的引物对CPV-General7-F+CPV-General7-R对已知含CPV1-7亚型的16份临床样品(CPVs基因组DNA由利用DNeasy Blood&Tissue Kit,Qiagen制备，并通过亚型特异性PCR或RCA鉴定，再存储在本实验室)进行检测的表现。

图8结果显示，在对16份临床样品进行检测中，本发明所设计引物对其检测表现(包括敏感度、检出率)完全优于文献报道。即，利用本发明所设计CPV-General23-F0+CPV-Gene ral23-R0引物对与文献所报道CPV-General7-F+CPV-General7-R分别实施PCR，检测已知含CPV1-7任一亚型基因组样品(K1-16，N＝16)，检测结果显示：本发明所设计引物对其检测表现(包括敏感度、检出率)完全优于文献报道。

图8中的标记说明为：

K1-K16：16份临床样品；P：阳性对照；N：阴性对照；M：DNA ladder。

实施例3

1.3建立CPV感染主要亚型CPV1和CPV2检测三引物PCR体系

1.3.1CPV1和CPV2 L1特异引物准备

根据CPV1和CPV2亚型的保守区域共设计5条引物，其中一条为共用上游引物和各两条针对CPV1、CPV2亚型特异的下游引物，从而形成两组三引物PCR检测体系，三引物组分别为CPV1/2L1-F+CPV1L1-R1+CPV2L1-R1(第一引物组)、CPV1/2L1-F+CPV1L1-R2+CP V2L1-R2(第二引物组)，序列及扩增产物大小如表1所示。

本实施例中，设计CPV1/2L1-F的区域为SEQ ID NO.17序列中第626-650位碱基位置和SEQ ID NO.18序列中第621-650位碱基位置；设计CPV1L1-R1的区域为SEQ ID NO.17序列中第1029-1055位碱基位置，设计CPV1L1-R2的区域为SEQ ID NO.17序列中第1081-1105位碱基位置；设计CPV2L1-R1的区域为SEQ ID NO.18序列中第926-950位碱基位置，设计CPV2L1-R2的区域为SEQ ID NO.18序列中第975-1000位碱基位置。

1.3.2建立CPV1和CPV2三引物PCR检测体系

首先，分别以pEF-CPV1 L1、pEF-CPV2 L1，及等摩尔量混合的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1为模板，实施PCR以确定上述三引物检测单独或混合感染的可行性、引物特异性及最佳反应条件。

PCR体系(50μL)包括：22μL无菌水、1μL上游引物(20μM)、各1μL下游引物(20μM)、25μL 2×PCR mix(Thermo fisher，K0171)及1μL DNA模板；反应条件均为95℃2min；95℃30s，50℃30s，72℃30s，设置35个循环，最后72℃5min。PCR反应结束后将等量产物进行琼脂凝胶电泳，并观察结果。

结果如图9所示：CPV1和CPV2 L1基因单独或混合的存在均能使PCR扩增出相应预期大小的单一或两个目的片段，而两个目的片段存在时，它们大小相差100bp，非常易于分别，表明所设计的引物对特异性好，反应条件也适合。

即，利用本发明构建的pEF-CPV1 L1或pEF-CPV2 L1质粒为检测模板，分别实施PCR分析CPV1/2L1-F+CPV1 L1-R1+CPV2 L1-R1，CPV1/2L1-F+CPV1 L1-R2+CPV2 L1-R2两个3引物对，进行CPV1和CPV2检测的可行性和特异性，结果显示该两个3引物对均能检测出CPV1或CPV2单独或同时存在。

图9中的标记说明为：

M：DNA Marker；NC：阴性对照。

接着，按照上述建立的方法体系，利用CPV1/2L1-F+CPV1L1-R1+CPV2L1-R1三引物对，实施对16份单独或共感染CPV1或CPV2临床样品的检测。

结果如图10所示：检测结果与预期完全一致，其中400bp条带显示存在CPV1感染，而300bp条带显示存在CPV2感染，两条带同时存在显示存在共同感染。

即，利用CPV1/2L1-F+CPV1L1-R1+CPV2L1-R1 3引物对实施PCR检测已知单独或同时含CPV1或CPV2基因组临床样品(n＝16)，检测结果与预期完全一致。400bp条带显示存在CPV1 DNA，而300bp条带显示存在CPV2 DNA。

图10中的标记说明为：

S1-S16：16份单独或共感染CPV1或CPV2临床样品；M：DNA ladder。

实施例4

1.4建立CPV1和CPV2病毒载量定量检测的实时PCR体系

1.4.1CPV1和CPV2定量引物准备

根据CPV1和CPV2亚型的保守区域共设计3条引物，其中一条为共用上游引物和各一条针对CPV1、CPV2亚型特异的下游引物，从而组成CPV1和CPV2定量PCR引物对，分别为CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0、CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0，序列及扩增产物大小如表1所示。

本实施例中，设计CPV1/2-L1-F0的区域为SEQ ID NO.17序列中第656-682位碱基位置和SEQ ID NO.18序列中第647-673位碱基位置；设计CPV1-L1-R0的区域为SEQ IDNO.17序列中第828-850位碱基位置，设计CPV2-L1-R0的区域为SEQ ID NO.18序列中第770-790位碱基位置。

1.4.2标准质粒样品准备

将测定浓度的标准质粒pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1，换算成1×10

1.4.3建立定量PCR熔点曲线、标准曲线和检测下限

首先，以上述10倍梯度稀释后的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1标准质粒作模板，分别实施实时荧光定量PCR，再进行引物熔解曲线制作。

实时定量PCR反应体系：3μL H

结果如图11-12所示，CPV1和CPV2定量检测引物熔解曲线皆呈单峰，而无杂峰，表明该引物对扩增产物特异性很好。即，以10倍梯度稀释的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1DNA为模板实施定量PCR，分析定量检测CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0(图11)、CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0(图12)引物特异性，表明待测引物的熔解曲线均呈单峰状态，具有良好的特异性。图11和图12中的-d(RFU)/dT表示每个温度对应的相对荧光强度。

其次，为了实现相对准确定量CPV1、CPV2病毒载量，选用pEF-CPV1 L1：6.8×10

结果如图13-14所示：制作的标准曲线呈现极好的线性相关性，R

即，以10倍梯度稀释的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1 DNA为模板，利用CPV1和CPV 2定量检测引物对CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0(图13)，CPV1/2-L1-F0+CPV2-L1-R0引物对(图14)实施定量PCR，建立标准曲线以便能够准确分析CPV1、CPV2 DNA含量，结果显示：建立的标准曲线呈现极好的线性相关性，R

再者，为了分析CPV1和CPV2定量检测引物的特异性，并估计它们的检测下限。以10倍梯度稀释的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1 DNA为模板，利用CPV1和CPV2定量检测引物对CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0(模板浓度依次为6.8×10

结果如图15-16所示：CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0引物对对CPV1最低检出量低于6.8×10

即，以10倍梯度稀释的pEF-CPV1 L1和pEF-CPV2 L1 DNA为模板，利用CPV1和CPV 2定量检测引物对CPV1/2-L1-F0+CPV1-L1-R0(图15，模板浓度依次为6.8×10

图15中的标记说明为：

1-10：模板浓度依次为6.8×10

图16中的标记说明为：

1-10：模板浓度依次为7.9×10

本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。