血清淀粉样蛋白A的校准品稀释液、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生化检测试剂技术领域，尤其涉及一种血清淀粉样蛋白A 的校准品稀释液、其制备方法及其应用。

背景技术

人血清淀粉样蛋白A(SAA)是急性时相反应蛋白种的一种正反应蛋白，分子量12000。它的生物学功能是脂质代谢、炎症防御及免疫应答。正常人的血清中SAA的含量是以衡量存在的，当机体被细菌或病毒感染后在白介素6、白介素1及肿瘤坏死因子的刺激下由肝脏分泌，SAA呈现升高趋势，所以可以通过检测血液中SAA的含量来判定感染是否发生及严重程度。

为了保证SAA检测结果的准确性，必须有可靠的配套校准品，校准品的范围应覆盖0.0-500mg/l，国际通用SAA的参考区间正常人血清SAA 浓度平均值为2.33mg/L，现有技术中有利用从人血清中分离SAA蛋白的方法，但是该方法成本昂贵，不适宜于工业化生产和应用，大部分厂家均选择采购SAA重组蛋白进行校准品的配置工作，但是在配置过程中，一方面与血清基质存在非常显著的差异，使测定的准确度偏差较大；另一方面由于重组蛋白降解，校准品稳定性的影响，使测定值有较大波动，无法满足临床精准测定的要求。市面上的保护剂也难以满足需求。因此，如何得到无基质效应且稳定的校准品，有效提高检测的准确度，是目前免疫胶乳比浊技术测定SAA亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，有必要提供一种血清淀粉样蛋白A的校准品稀释液，用以获得物基质效应且温度的校准品。

本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的校准品稀释液，包含蛋白保护剂和防腐剂，所述蛋白保护剂为糖类物质、蛋白质类物质、电解质、醇类和表面活化剂中的至少一种；其中，所述糖类物质选自脱氧核糖、蛋白聚糖、赤藓糖醇和藜麦多糖中的至少一种。

具体的，所述校准品稀释液，包含以下浓度组分：

糖类物质30-50g/l；

蛋白质类物质5-20g/l；

电解质10-15g/l；

醇类物质10-25g/l；

表面活化剂0.1-1.5ml/l；

防腐剂0.1-2ml/l；

所述校准品稀释液可用于稀释0-500mg/l浓度的血清淀粉样蛋白A 的校准品。

具体的，所述蛋白质类物质选自胶原蛋白、植物蛋白、精蛋白、角蛋白、组蛋白、卵清蛋白和羊血清前白蛋白中的至少一种。

具体的，所述电解质调节剂选自氯化钠、氯化钾和氯化镁中至少一种。

具体的，所述醇类物质为甘油和乙二醇中的至少一种。

具体的，所述表面活化剂为PEG和非离子表面活化剂中的至少一种。

具体的，所述防腐剂选自叠氮钠和PC-300中的至少一种。

本发明还提供一种所述校准品稀释液的配制方法，包括以下步骤：

制备溶液A：向水中加入防腐剂、电解质，至完全混匀，得到溶液A；

制备溶液B：将表面活化剂完全溶解于水中，得到溶液B；

制备溶液C：将糖类物质及蛋白质类物质完全溶于水中，得到溶液C；

制备溶液D：将溶液A、溶液B、溶液C混合得到空白缓冲液，往其中加入醇类物质，完全混匀得到溶液D；

定容后，0.22um滤膜过滤后得到所述校准品稀释液。

本发明还提供一种所述校准品稀释液在制备胶乳免疫比浊检测系统SAA检测试剂盒中的应用。

有益效果：

本发明提供的稀释液能够有效去除校准品稀释液，有助于提高检测准确度，且能实行液体运输模式，减少校准品稀释不必要的冻干过程。对于本实施例配置的校准品，也运用于日常的试剂评价中，对精密度，灵敏度，检测限，准确度等评价工作均不产生干扰作用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明旨在得到无基质效应且稳定的校准品，有效提高检测的准确度，是目前胶乳比浊技术测定SAA亟需解决的技术问题。

对基质效应有影响因素有：仪器、试剂、测量方法和被评价的样品 (参考物质、校准品、质控品等处理过的样品)。而通常情况下，检测运用的设备和测量方法差别不大，而试剂盒被评价的样品就成为主要影响因素。其中，对于被评价的样品而言，其中包含的稀释液的离子强度、 pH值、温度等会对分析物活性系数有影响，从而影响测值，导致基质效应。

本发明需要获得血清淀粉样蛋白A校准品的稳定性，则需保持其抗原活性，主要目的为保持校准品结构空间的稳定，包括其一级结构中的肽键、二级结构中的氢键以及三级结构中疏水键、离子键、氢键、范德华力的稳定，而影响这些结果键稳定性的因素一般为体系中pH值、离子强度、盐分和微生物的作用及空气的氧化等。

一般而言，氨基酸具有抗氧化剂且能降低离子强度，能够有效的维持校准品三级结构中的肽键、氢键、离子键的稳定，同时对稳定溶液pH 值、校准品的溶解性具有一定作用，这其中精氨酸和羊血清前蛋白作用比较突出，在不同pH条件下不会导致校准品结构变化。

另外，本发明中创造性地发现脱氧核糖、蛋白聚糖、赤藓糖醇和藜麦多糖这几种糖类物质能够增大血清淀粉样蛋白A在体系中的粘度，使其氨基酸链段运动受阻，阻止其在体系中展开和沉淀，从而抑制了其亚能级与结构松弛之间的相互转换，维持其分子三级结构稳定，起到保护其活性的作用，优选的为赤藓糖醇和藜麦多糖。

醇类不仅可以保持抗原表面滋润，且使其不至于因失水而失活，而且可以降低分子运动，避免蛋白聚集。表面活性剂可以通过降低分子间范德华力，且抑制非特异结合，另外一些化学惰性的高分子物质的聚合物(PEG)因其分子量大，能够在抗原表面形成一种保护膜，如此即可保护氢键的连接位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性使蛋白结构免遭受破坏；另一方面，随着保存时间的延长，抗原及其稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物受到空气、水中微生物的腐蚀，因此需要加入一定的防腐剂。

由此，本发明实施例提供一种血清淀粉样蛋白A的校准品稀释液，包含蛋白保护剂和防腐剂，所述蛋白保护剂为糖类物质、蛋白质类物质、电解质、醇类和表面活化剂中的至少一种；其中，所述糖类物质选自脱氧核糖、蛋白聚糖、赤藓糖醇(简称mE)和藜麦多糖(简称LM)中的至少一种。

具体的，本发明实施例提供的校准品稀释液，包含以下浓度组分：

糖类物质30-50g/l；

蛋白质类物质5-20g/l；

电解质10-15g/l；

醇类物质10-25g/l；

表面活化剂0.1-1.5ml/l；

防腐剂0.1-2ml/l；

校准品稀释液可用于稀释0-500mg/l浓度的SAA校准品。

其中，蛋白质类物质选自胶原蛋白、植物蛋白、精蛋白、角蛋白、组蛋白、卵清蛋白和羊血清前白蛋白中至少一种。优选为精蛋白(简称 Pro)和羊血清前白蛋白(简称PA)。

其中，电解质调节剂选自氯化钠，氯化钾和氯化镁中至少一种。

其中，醇类物质为甘油和乙二醇中至少一种。

其中，表面活化剂为PEG和非离子表面活化剂中至少一种。其中，非离子表面活性剂举例如烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯酯(AE)或脂肪酸甲酯乙氧基化物(FMEE)

其中，防腐剂选自叠氮钠和PC-300中至少一种。

本发明还提供一种上述实施例提供的校准品稀释液的配制方法，包括以下步骤：

制备溶液A：向水中加入防腐剂、电解质，至完全混匀，得到溶液A；

制备溶液B：将表面活化剂完全溶解于水中，得到溶液B；

制备溶液C：将糖类物质及蛋白质类物质完全溶于水中，得到溶液C；

制备溶液D：将溶液A、溶液B、溶液C混合得到空白缓冲液，往其中加入醇类物质，完全混匀得到溶液D；

定容后，0.22um滤膜过滤后得到所述校准品稀释液。

本发明实施例提供的校准品稀释液能够在制备胶乳免疫比浊检测系统SAA检测试剂盒中得以应用。

为对上述校准品稀释液的具体实施例进行表述，下方将其列入表1 和表2中。

表1

表2

为评价本发明实施例提供的校准品稀释液对SAA蛋白的影响，本发明实施例将用上述实施例提供的校准品稀释液，按不同比例梯度稀释获得SAA蛋白不同浓度的校准品(5.0mg/l，120.0mg/l，250.0mg/l)；并分别进行热破稳定性试验和运输稳定性试验，具体实验操作及结果如下： 1、热破稳定性

采用武汉华美SAA重组蛋白，分别采用上述实施例和对比例制备的稀释液配置3种水平的SAA校准品，分别在4℃冰箱与37℃烘箱中放置 14天(每管均设置平型管，取平均值)，到既定时间取样，使用外购试剂SAA试剂盒测定相应校准品SAA含量的变化率，结果见表3。

表3第14天不同浓度校准品(mg/l)的变化率(％)

由上表3可知，本发明实施例1～13制得各种浓度的SAA校准品相较于对比例1～14和外购稀释液制得校准品在37℃和4℃条件下存放均有一定优势，14天SAA含量波动＜7％。

2、运输稳定性

采用武汉华美SAA重组蛋白，分别采用上述实施例1～13和对比例 1～14制备的稀释液分别配置3种水平(5.0mg/l、120.0mg/l和250.0mg/l) 的SAA校准品和市售稀释液制备的3种水平(5.0mg/l、120.0mg/l和 250.0mg/l)的SAA校准品，分别在42℃摇床中放置1、2、3、4、5天(模拟运输条件，每管均设置平行管，取平均值)，到既定时间取样，使用外购试剂SAA试剂盒测定相应校准品SAA含量的变化率，结果见表4。

表4第5天不同浓度校准品(mg/l)的变化率(％)

由上表4可知，上述实施例1～13制得各浓度SAA校准品的运输稳定性优于对比例1～14。

3、基质效应评价：

取至少20例新鲜人血清样本，血清的浓度应覆盖线性范围。处理过的样本即为本实验例的被评价对象(采用实施例1～13和对比例1～14分别制备的校准品)，将处理过的样品夹杂在20例新鲜人血清中，重复测定三次，每次重新定标；测试在一天内完成，对照方法为试剂盒自带校准，被评价方法为处理过样本。数据如下表5列出各浓度校准品的平均偏差所示。由表5可知，各实施例1～13的在各浓度样品水平均显著低于对比例1～14。

表5

再以120.0mg/l水平对各实施例1～13和对比例1～14制备的各校准品，依据WS/T356-2011基质效应与互通性评估指南进行基质效应评估，采用的对照方法为：ID-LC/MS/MS(同位素稀释液相色谱串联质谱方法)，评估方法为：臻科生物试剂盒，其中的置信区间技术公式采用该指南中 4.3.4指出的公式(1)计算得出，如下：

式中：

表5基质效应评估(120.0mg/l)， +表示有基质效应，-表示无基质效应

利用以上方法，将对比方法测定均值作为X轴，计算每个校准品(上述实施例1～13和对比例1～14校准品稀释液对应制备的校准品)的y值的95％置信区间。如果评估方法的测定均值落在该区间内，说明该校准品稀释液对评估方法无基质效应，表面该物质在比对方法和评估方法具有互通性。由表5可知，评估方法对实施例1～13校准品的测定均落在上述置信区间内，而对于对比例1～14校准品的测定均未落在上述置信区间内，存在基质效应。由此说明，本发明提供的校准品稀释液能够有效去除校准品稀释液，有助于提高检测准确度。

综上，本发明提供的稀释液能够有效去除校准品稀释液，尤其是实施例中使用了赤藓糖醇或藜麦多糖作为糖类保护剂，其使得校准品在热破稳定性和运输稳定性优于对比例，且无基质效应(如实施例7相对于对比例1)；赤藓糖醇或藜麦多糖不仅可增大SAA的体系粘度，使其链段运动受阻，阻止其展开和沉淀，其还能在溶液对空气中氧气溶解于溶液体系中形成的羟基自由基具有清除作用，具有一定抗氧化性，而赤藓糖醇利用其自身对酸和热的稳定性，对校准品提供了保护作用。而这些作用在现有的乳糖以及其他一般的糖类保护剂中并未能够提供。

进一步的，通过其他实施例与对比例的比较(如实施例1～5与实施例7的比较，实施例1～5与对比例1～5的比较)发现，精蛋白能够辅助赤藓糖醇，增强体系的抗氧化能力且能降低离子强度，能够有效的维持校准品三级结构中的肽键、氢键、离子键的稳定。而使用羊血清前白蛋白作用蛋白保护剂，并优化稀释液体系中电解质、醇类、表面活化剂和防腐剂，能够同上述糖类保护剂协同作用，维持校准品的结构稳定。由此，糖类保护剂、蛋白类保护剂以及其他保护剂的综合作用，有助于提高检测准确度，且能实行液体运输模式，减少校准品稀释不必要的冻干过程。对于本实施例配置的校准品，也运用于日常的试剂评价中，对精密度，灵敏度，检测限，准确度等评价工作均不产生干扰作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。