一种斑兰组培种苗快速繁育方法

技术领域

本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体涉及一种斑兰组培种苗快速繁育方法。本发明还提供了适合斑兰种苗规模化产业化生产的快繁方法。

背景技术

斑兰，学名香露兜(Pandanus amaryllifolius，Roxb.)，也叫香兰叶、板兰叶、斑斓叶，为露兜树科(Pandanaceae)露兜树属(Pandanus)多年生常绿香料植物。原产地为印尼马古鲁群岛，主要分布在东半球热带和亚热带地区，在我国海南部分市县有种植。露兜树科有3属约800多种植物，其中，斑兰是该属具有独特“粽香”香味的植物，香味主要来自其叶片，“棕香”香气成分为2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)。此外，斑兰叶片富含角鲨烯、亚油酸等活性成分，具有增强细胞活力、提高人体免疫力等作用。东南亚国家将其叶汁作为食物香料添加到糕点、冰淇淋、饮料以提升品质，其中，新加坡国糕—绿蛋糕风靡全球。海南流行用其叶片做成本地糕点等各种小吃。

由于斑兰可以在林下种植，其叶子具有较高经济价值，近年对其种苗需求量激增。而我国斑兰主要是从东南亚国家引种而来，目前种植面积较小。且斑兰由于其花果未见，传统繁殖方式以分蘖繁育为主。此方法要求母株至少定植两年以上，每一母株每年可用分蘖10个左右，目前的分蘖无法满足产业发展对大规模种苗的需求。因此急需研发种苗快速繁育方法，为产业提供充足优质种苗。组织培养技术是解决这一问题的有效方法，可在短期内对种苗进行快速增殖，实现种苗规模化生产。国内外学者对此均进行了研究。

现有技术中，CN111226792B吉训志等(2020)公开了一种斑兰种苗的高通量繁育方法，该方法以靠近根端、半木质化、3-5mm长的茎段基部作为外植体，诱导基部致密愈伤组织，通过愈伤组织诱导、丛生芽诱导、芽伸长及生根等过程获得组培种苗。但实际应用中发现，选择靠近根端，半木质化、3-5mm长的茎段基部，具有愈伤组织诱导及扩繁需要花费较长时间，根系不够发达的缺陷。因此，亟待一种新的高通量的斑兰组培种苗的快繁方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的获得斑兰组培苗的方法，方法以新萌发、较幼嫩的地上茎段为外植体，通过切面诱导颗粒状愈伤组织，从愈伤组织萌发绿色芽点，绿色芽点发育成不定芽，同一外植体切面诱导愈伤期间腋芽伸长，愈伤组织诱导不定芽期间腋芽不定芽增殖，愈伤诱导不定芽、增殖与腋芽诱导不定芽、增殖，实现了腋芽增殖和愈伤长芽及增殖同时进行；不定芽增殖后，两步生根法生根，根系发达健壮，可批量获得斑兰组培种苗。

本发明的另一目的在于提供了一种高通量的获得斑兰组培苗的方法，通过采用新的外植体取样部位和切取方式，使同一块外植体诱导腋芽增殖的同时通过切面诱导愈伤组织发育成不定芽，提高了不定芽诱导率，幼苗生根率和移栽成活率。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

(1)外植体采集：挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集淡黄色、新萌发的斑兰嫩茎顶端部位4-18cm处，剪去其他叶鞘，只保留贴着芽点部位的叶鞘，作为外植体；

(2)外植体消毒：将所述斑兰顶端清洗、消毒、灭菌处理；

(3)外植体制备和愈伤组织诱导：剥离贴着芽的叶鞘，切除嫩茎基部1-5mm，顶端切到露出顶芽，再将其切成0.5-1cm长的带芽茎段，按照生物学极性方向竖着放入愈伤组织诱导培养基培养20-30天，一端切口插入培养基内,另一端切口向上，此阶段向上的切面形成愈伤组织，腋芽伸长；

(4)不定芽诱导：将带有愈伤组织的茎段切段在不定芽诱导培养基继代培养2-4次，每次20-30天，切面颗粒状愈伤组织进一步增殖，表面长出绿色芽点并进一步发育成嫩芽，此阶段腋芽进一步增殖；

(5)不定芽增殖：将长有嫩芽的茎段切掉0.5cm以上叶子，再切成2-4段转到不定芽增殖培养基进行不定芽增殖，每次增殖20-30天，此步骤循环，直至获得足够不定芽；

(6)不定芽伸长：将上述不定芽转到不定芽伸长培养基，散射光培养，培养温度为25℃-30℃，使不定芽伸长至1.5cm以上；

(7)不定芽生根：将伸长的不定芽转入1号生根培养基，先培养1-3天，再转入2号生根培养基培养20-30天，光照培养，培养温度为25℃-30℃，不定芽长出5-10条根。

在一优选的实施方式中，所述外植体采集步骤中，外植体长度为4-18cm新萌发嫩茎。

在一优选的实施方式中，所述外植体消毒步骤中，将嫩茎用洗衣粉清洗，流水冲洗后，转入超净工作台，有效成分为0.05％的多菌灵溶液轻轻摇动10分钟，75％酒精表面消毒30秒，0.1％氯化汞消毒3-5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，每次2-3分钟。

在一优选的实施方式中，所述愈伤组织诱导步骤中，所述诱导条件为，散射光培养20-30天，培养温度为25℃-30℃，此时向上的切面长出白色颗粒状愈伤组织。

在一优选的实施方式中，所述愈伤组织诱导步骤中，所述的愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基、1-5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1-0.5mg/Lα-萘乙酸或吲哚乙酸、5g/L琼脂粉和30-40g/L蔗糖，调节pH至5.8。

在一优选的实施方式中，所述不定芽诱导步骤中，所述诱导条件为，散射光培养，培养温度为25℃-30℃；所述不定芽增殖步骤中，所述增殖条件为，散射光培养，培养温度为25℃-30℃。

在一优选的实施方式中，所述不定芽诱导步骤中，所述的不定芽诱导培养基包括：MS培养基、2-4mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1-0.5mg/Lα-萘乙酸或吲哚乙酸、5g/L琼脂粉、30-40g/L蔗糖，0.3-1g/L活性炭，调节pH至5.8。

在一优选的实施方式中，所述不定芽增殖步骤中，所述的不定芽增殖培养基包括：MS培养基、0.5-2mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1-0.5mg/Lα-萘乙酸或吲哚乙酸、5g/L琼脂粉、30-40g/L蔗糖，调节pH至5.8。

在一优选的实施方式中，所述不定芽伸长步骤中，所述的不定芽伸长培养基包括：MS培养基、5g/L琼脂粉、30-40g/L蔗糖，调节pH至5.8。

在一优选的实施方式中，所述不定芽生根步骤中，所述的不定芽1号生根培养基：MS培养基、2-3mg/L吲哚丁酸、5g/L琼脂粉、10-30g/L蔗糖，调节pH至5.8；2号生根培养基是MS培养基，7g/L琼脂粉、10-30g/L蔗糖，调节pH至5.8。

与现有技术相比，根据本发明的一种新的获得斑兰组培苗的方法具有如下优点：

(1)本发明在实验过程发现斑兰极易褐化，因此清洗及消毒嫩茎时通过保留贴着芽的叶鞘，有效保护了芽点及茎段，避免全部剥掉叶鞘后直接清洗、消毒对芽点及茎段的伤害，处理后的萌动芽健壮，易生长。

(2)另外，本发明通过保留贴着芽的叶鞘清洗、消毒芽和茎段，整个切面都长愈伤，而全部掉叶鞘直接清洗、消毒后，愈伤只长在髓部切面，进而，有效提高了腋芽萌动率和切面愈伤诱导率，加快了腋芽萌动时间。

(3)本发明在常规消毒前添加了有效成分为0.05％的多菌灵溶液处理10分钟，与常规消毒方法相比污染率降低约10％，避免后续处理过程中，外植体的脱分化失败。

(4)本发明通过在茎段切面诱导愈伤组织，再诱导不定芽及生根等过程，获得斑兰组培种苗，丰富了斑兰组培种苗的快繁方法。

(5)本发明通过在茎段切面诱导愈伤组织获得斑兰组培种苗，使同一块外植体既可以通过腋芽增殖，又可以通过切面增殖，大大提高了繁殖效率，加速相关领域的发展。

(6)本发明通过两步生根法，诱导得到的根粗壮、健康，根数合理，移栽成活率达到100％。

(7)本发明通过茎段切面获得的斑兰组培种苗生长旺盛，保持了原有的“粽香”香味。

(8)本发明工艺流程简单，所采用的培养基成分易于获取，具有很大的应用价值。

附图说明

图1是外植体的采集及制备过程；

其中，从左至右，图依次为：室外生长的斑兰，刚采集的茎部顶端，保留贴着芽的叶鞘，撕掉贴着芽的叶鞘。

图2是实施例的愈伤组织诱导及增殖过程；

其中，左侧图为：切成带芽茎段，右侧图为：萌动的芽及切面愈伤。

图3是实施例的不定芽诱导及增殖过程；

其中，左上图为：切面愈伤长芽点，左下图为：芽进一步生长，右侧图为：芽伸长。

图4是实施例的制备的斑兰组培苗；

其中，左侧图为：生根的斑兰组培苗；右侧图为：健壮、舒展、发达的根系。

图5是实施例和对比例1诱导的愈伤组织；

其中，左侧图为：实施例诱导的愈伤组织：茎段绿色、萌发的芽壮、愈伤形成快；右侧图为：对比例1诱导的愈伤组织：茎段变褐、不萌发或萌发的芽弱、愈伤难以形成。

图6是对比例2的制备的斑兰组培苗；

其中，左侧图为：未生根的斑兰组培苗；右侧图为：膨大、愈伤化，未长根的茎基部。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明提供的一种斑兰组培种苗快速繁育方法中所用培养基成分均可由市场购得；

所述生物学极性方向是指：在培养鞘、芽、幼叶和幼根中，生长素从形态学上端运输到形态学下端；在本文中愈伤组织诱导是，按生物学极性方向，从鞘、芽、幼叶到幼根，自上而下竖着放入愈伤组织诱导培养基培养。

实施例

外植体采集：在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集淡黄色、新萌发的斑兰4-18cm嫩茎，剪去除贴着芽部分的叶鞘,以此作为外植体；具体外植体的采集及制备过程如图1从左至右，前3组图所示。

外植体清洗、消毒：将嫩茎在流水下逐一冲洗，注意拨开叶鞘，将叶鞘内的尘土冲洗干净，然后放入含洗洁精的烧杯，轻柔搓洗嫩茎表面，再在流水下轻柔搓洗，冲去茎段表面泡沫，然后转入超净工作台，有效成分为0.05％的多菌灵溶液轻轻摇动10分钟，75％酒精表面消毒30秒，0.1％氯化汞消毒5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，每次2-3分钟，沥干水分。

外植体制备和愈伤组织诱导：剥离贴着芽的叶鞘，切除嫩茎基部1-5mm，顶端切到露出顶芽，切成2-4段带芽茎段，按照生物学极性方向竖着放入愈伤组织诱导培养基培养,一端切口插入培养基内,另一端切口向上，散射光培养，培养温度为25℃-30℃；愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基、1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/Lα-萘乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，调节pH至5.8。具体观察情况如图2所示。

不定芽诱导：将带有愈伤组织的茎段切段在不定芽诱导培养基继代培养1-2次，每次25天，散射光培养，培养温度为25℃-30℃；切面颗粒状愈伤组织进一步增殖，表面长出绿色芽点并进一步发育成嫩芽；不定芽诱导培养基包括：MS培养基、3mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/Lα-萘乙酸、0.5g/L活性炭、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，调节pH至5.8。

不定芽增殖：将长有嫩芽的茎段切掉0.5cm以上叶子，再切成2-4块转到不定芽增殖培养基以诱导更多不定芽，每次20天；培养条件及培养基同不定芽诱导。具体不定芽诱导及增殖的观察情况如图3所示。

不定芽伸长：将上述不定芽转到不定芽伸长培养基，散射光培养，培养温度为25℃-30℃，使不定芽伸长至1.5cm以上；不定芽伸长培养基包括：MS培养基、30g/L蔗糖、5g/L琼脂粉，调节pH至5.8。

不定芽生根：将伸长的不定芽转入1号生根培养基培养1天，再转入2号生根培养基培养20-30天，光照培养，培养温度为25℃-30℃，不定芽1号生根培养基：MS培养基、3mg/L吲哚丁酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂粉、调节pH至5.8；2号生根培养基是MS培养基，30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调节pH至5.8。最终制备出的斑兰组培苗如图4所示，不定芽长出5-10条根，根长为3-5cm，健壮，根尖白。

对比例1

外植体采集：在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集淡黄色、新萌发的斑兰4-18cm嫩茎，剪去除贴着芽部分的叶鞘,以此作为外植体；具体的外植体如图1最右侧图所示。

外植体清洗、消毒：将叶鞘全部剥离，置于流水下轻柔搓洗嫩茎表面，然后放入含洗洁精的烧杯，再在流水下轻柔搓洗，冲去茎段表面泡沫，然后转入超净工作台，有效成分为0.05％的多菌灵溶液轻轻摇动10分钟，75％酒精表面消毒30秒，0.1％氯化汞消毒5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，每次2-3分钟。沥干水分。

其余步骤同实施例，具体愈伤组织状况如图5右侧所示。

对比例2

不定芽生根：将伸长的不定芽直接转入生根培养基培养20-30天，光照培养，培养温度为25℃-30℃，不定芽生根培养基：MS培养基、3mg/L吲哚丁酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂粉、调节pH至5.8。最终制备出的斑兰组培苗如图6所示，不定芽基部变黄，膨大，未萌发不定根。

其余步骤同实施例，具体生根状况如图6所示。

试验例

按照实施例和对比例1-2所述方法进行斑兰组培苗快速繁育，具体数据指标如表1所示：

表1不同培养方法的褐化率、腋芽萌动率、愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率对比

如上表所示，与实施例相比，对比例1在外植体清洗、消毒时，全部剥掉叶鞘。由于没有叶鞘的保护作用，在消毒过程中，很容易对娇嫩的芽点及茎段部位产生伤害，从而使斑兰褐化。而褐化过程又会抑制酶活性，严重影响外植体的脱分化。而且，全部剥掉叶鞘直接清洗、消毒愈伤只长在髓部切面，极大减少不定芽及腋芽萌动率。

与实施例相比，对比例2生根步骤中，采用传统的生根培养基一次完成，并未使娇嫩的不定芽生根，而本申请方案中，采用两步生根法，先采用传统生根培养基处理，再二次转入无激素培养基生根培养，大幅提升了生根率。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。