蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统的构建

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统的构建。

背景技术

酿酒酵母广泛用于基础生物学研究和食品，药品以及化学材料料的生产。酿酒酵母作为真核模式生物，是分子生物学和细胞生物学中研究最深入的生物模型。酿酒酵母不仅具有操作简单，容易培养等特点，而且酿酒酵母自然HRR效率比较高，在外源DNA转入后，依赖自身的重组便可以实现外源基因的转入，可以较为容易的构建各种基因突变体模型。

I-SceI是一类由内含子编码的归位内切酶，编码I-SceI内切酶的氨基酸有235个，此内切酶具有特异性，能特异性的识别特定碱基序列发挥核酸内切酶的活性，I-SceI的识别序列为18个非对称核苷酸序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)，在特异性的酶切核酸后，可以产生一个4bp的切口。I-SceI诱导的DSB可以用于体外与体内研究DNA的重组。

在酿酒酵母，最常用的是依赖营养扰动的表达系统，通常使用的转录因子为(TF)Gal4p，当含有Gal4p识别序列(UAS GAL)时，启动子控制的靶基因可以在半乳糖存在下选择性诱导，此系统很难在空间和时间上精确的控制基因的表达。光是一种理想的表达诱导物，可控性强、无毒性，而且能实现对基因表达在时空上的双重精准控制。

该光控系统是以来源于山葡萄红杆菌(Erythrobacter litoralis)的EL222光敏蛋白为转录因子与C120DNA结合序列为基础的蓝光调控基因表达系统。该系统中，EL222由222个氨基酸组成，N端为光氧化调控域(LOV)，C端为螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合域，LOV的C末端与LOV和HTH的Jα螺旋连接。LOV的核心是PAS结构域，可与黄素单核苷酸(FMN)结合。在蓝光照射下，FMN和LOV的结合导致Jα螺旋从PAS摇摆，从而释放HTH，使EL222二聚并与DNA结合。在黑暗中，N端LOV结构域抑制DNA结合的C端HTH结构域时，EL222自发地逆转，从而迅速使EL222失活。该系统可突破时空上的限制精准的控制基因表达。蓝光诱导酿酒酵母定点产生DSB，可作为酿酒酵母DNA损伤修复机制的又一模式菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统，步骤如下：

(1)构建site-I-SceI-kanMX转化盒，利用pC120-El222蓝光诱导型启动子，通过PEG/LiAC法向酿酒酵母中进行转化，即得到蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统，同时构建半乳糖启动子启动site-I-SceI-kanMX转化盒，作为对照。

构建site-I-SceI-kanMX转化盒时，I-SceI酶识别位点site序列为SEQ IDNO.1TAGGGATAACAGGGTAAT

构建了一种在真核生物中蓝光诱导的启动子pC120-EL222，所述启动子中包括能够表达蓝光调节启动子pC120、蓝光蛋白SV40-VP-El222以及启动蓝光蛋白的GAPpromoter和AOX1terminator。所述蓝光蛋白SV40-VP-EL中的SV40为核定位信号SV40，VP为转录激活域VP16，EL222为蓝光响应蛋白；所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2

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当诱导I-sce1酶表达时，识别特异性位点进行酶切反应，发生定点突变，此时，细胞发生修复应答。

(2)本实验将含有上述蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统中进一步敲除活性氧产生关键基因yno1，在蓝光诱导下检测其生存率。半乳糖诱导酿酒酵母定点DSB系统中同时敲除yno1，作为对照。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明将pC120-El222蓝光诱导型启动子，I-SceI连同1个识别位点组合成为一组操作盒，将其转入酿酒酵母中，经过半乳糖诱导后产生了1个4bp的特异性切口，从而形成1个DSB，构建了一种蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统。

2、本发明创新性地在酿酒酵母定点DSB系统中引入蓝光诱导下启动子，打破了现有技术中通过Gal promoter进行诱导固定思维，突破了时空的局限性，解决了现有技术中的不足，实现了用蓝光诱导染色体中定点DSBs的目的，降低了经济成本和人力资源，并且为基因编辑技术的改良优化提供了新思路。

附图说明

图1为蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统示意图；

图2为pcr扩增示意图；

图3为不同条件下菌株的敏感性实验；

图4为本发明方法的一种流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统的构建，步骤如下：

1.设计site-pC120-El222-I-SceI-kanMX基因表达盒

将蓝光启动子pC120-El222进行全合成，将I-SceI-kanMX基因的表达盒从质粒pGSKU扩增下来，利用重叠延伸PCR技术将两个目的片段进行连接，并在上游引物中插入一个I-SceI识别序列，同源臂为60bp；

较优地，所述PCR扩增目的基因，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应体系及条件如下：

Fastpfu DNA聚合酶体系：

Fastpfu DNA聚合酶程序设定：

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较优地，所述重叠延伸的具体制备如下：

①扩增待转入的目的片段，称为片段A；

②将全合成的蓝光启动子pC120-El222，称为片段B；

③通过重叠延伸PCR将待转入的目的片段即片段A与片段B连接起来，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应具体体系条件及程序设定如下，连接合成的片段称为片段C；

重叠延伸PCRFastpfu DNA聚合酶体系：

重叠延伸PCRFastpfu DNA聚合酶程序设定：

④使用上游引物、下游引物将连接合成的片段C进行扩增，提高浓度，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应具体体系条件及程序设定如下：

重叠延伸PCRFastpfu DNA聚合酶体系：

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重叠延伸PCRFastpfu DNA聚合酶程序设定：

2.构建单DSB突变株

利用PEG/LiAC法向酵母中进行转化，涂布于G418筛选板上生长，挑取生长出的单克隆菌株提取基因组，PCR验证；

较优地，具体步骤如下：

⑴前晚将待转化菌体接种于YPDA培养基中，220r/min，30℃摇床培养过夜；

⑵次日将前一晚活化的菌液再加入YPDA培养基，继续220r/min，30℃摇床培养3-4h；

⑶将培养的菌液转移到进行离心，3000rpm离心2min；

⑷弃掉部分上清，留部分上清，用移液枪吹悬，然后2000rpm离心1min后丢弃全部上清；

⑸把鲑鱼精DNA用沸水浴5min，立马放冰上备用；

⑹向菌体中加入需要转化的目的基因，即PCR扩增好的I-SceI基因表达盒，鲑鱼精DNA，迅速使用涡旋振荡器振荡混匀；

⑺加入40％PEG4000/1×TE-LiAc，移液枪轻轻吹悬混匀；所述40％PEG4000/1×TE-LiAc为按PEG4000:1×TE:LiAc的体积比为8:1:1混合配置得到；

⑻加入总体积10％的DMSO，上下颠倒离心管混匀，然后30℃静置30min，恒温孵育器42℃热激15min；

⑼3000rpm离心2min，弃去上清；加入无菌水，吹悬混匀；涂布在普通板上生长4-6小时，转印到KanMX抗性筛选板生长；

⑽挑取转化后生长的单菌落，接入YPDA培养基，过夜培养；4500rpm离心2min，弃去上清，吸取菌液，提取基因组DNA，PCR验证。

3.获得蓝光诱导的单DSB突变株后，进一步敲除yno1基因。同时，构建Galpromoter诱导酿酒酵母定点DSB模型。诱导通过蓝光诱导进一步验证其菌株发生定点突变后生存效率及其生存效率与Gal promoter诱导的差异。

构建蓝光诱导和Gal promoter诱导的one-DSB yno1△突变株是通过PCR的方式在筛选标记基因两端连上80bp左右同源臂，将带有同源臂的片段转化进入酵母细胞，达到敲除目的。本研究基因组序列均来源于SGD数据库。

具体步骤同上

获得蓝光诱导的one-DSB yno1△突变株和Gal promoter诱导的one-DSB yno1△突变株后，分别挑取突变株置于10mLYPDA培养基中，以220r/min，30℃的黑暗条件过夜培养；吸取10

再将Gal promoter诱导的one-DSB yno1△突变株，挑取突变株置于10mL YPDA培养基中，以220r/min，30℃的条件过夜培养；取5mL菌液加至YPD-GAL培养基中，以220r/min，30℃的条件培养4h；吸取10

如图所示，Gal promoter诱导的one-DSB yno1△突变株，在光照条件下，突变株没有明显损伤，表明光照不会对菌株产生影响，在半乳糖诱导产生DSB后，突变菌株的存活率受到了影响。在470nm蓝光光照条件下，突变株的存活率同样受到了影响，表明在蓝光照射下，可诱导I-sce1的表达，可诱导DSB的产生。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。