一种高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05及其应用，属于生物农业生物饲料添加剂领域。

背景技术

呕吐毒素主体成分为DON（deoxynivalenol, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀（Fusariumculmorum），由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）。

该毒素最早于1970年在日本香川县的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，1972年，由日本的Morooka等首次从赤霉病大麦中分离，Yoshizawa等阐明了这种新的真菌毒素的结构，并将其命名为4-deoxynivalenol（DON）。1973年Vesonder等在美国从被镰刀菌污染的玉米中分离出了同样的化学物质，因为该种物质可以引起猪产生呕吐症状，故命名为呕吐毒素，并相继发现可以在赤霉病大麦、被镰刀菌污染的玉米中分离出该物质。呕吐毒素是食品中常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，通常在欧洲及北美发现的3种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。由于它们具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm。

呕吐毒素对中国谷物类原料和饲料产品的污染相当普遍,汇总江苏奥迈饲料霉菌毒素工程技术研究中心2013年到2019年霉菌毒素分析报告，分析了3632个玉米样品，呕吐毒素检出率100%，，均值784.6ppm，最高3652.3ppm。超标率53.97%。分析了2864个玉米副产品样品，呕吐毒素检出率100%，，均值1164.8ppm，最高4402.7ppm。超标率76.52%。分析了4481个配合饲料样品，呕吐毒素检出率100%，，均值876.2ppm，最高3346.01ppm。超标率22.35%。

呕吐毒素化学性能非常稳定，一般不会在加工、储存以及烹调过程中破坏，在实验室条件下可长期贮存保持毒力不变，有较强的热抵抗力，121℃高压加热25min仅有少量破坏。酸性环境不影响其毒力，但是加碱或高压处理可破坏部分毒素含有呕吐毒素谷物类加工产品，在加工过程中，由于技术限制不可能完全去除，呕吐毒素主要在胃肠道吸收，经血液循环进入肝脏代谢后经肾脏随尿液排出，造成各器官的广泛损伤。呕吐毒素在人体中的半衰期为2～4h，代谢迅速，8h后就检测不到呕吐毒素和它的代谢物。

目前，国内外谷物和饲料霉变脱毒方法主要有物理吸附法、化学脱毒法以及生物脱毒法等。物理吸附法对DON吸附可逆且效率差，还易吸附微量营养元素，造成谷类和饲料中营养物质流失；化学脱毒易残留一些潜在有毒物质，对谷物和饲料造成二次污染，因此DON传统脱毒方法在实际应用中具有一定局限性；生物脱毒法是通过微生物释放的酶作用于DON，并将其转化为更低毒性的代谢产物，由于微生物降解具有成本低、效率高、营养物质损失少，无二次污染和生态恢复性良好等优点而受到广大关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对以上现有技术存在的缺点，提出一种高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05及其应用，该枯草芽孢杆菌应用在降解DON上稳定性好，降解率高。

本发明解决以上技术问题的技术方案是：

一种高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05，该枯草芽孢杆菌AM-05菌株是在感染赤霉病的小麦田间土壤中分离筛选发酵得到。

本发明进一步限定的技术方案是：

进一步的，高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05中，该菌株的制备具体方法如下：

（一）菌种的筛选

（1）取感染赤霉病的小麦田间土壤，铲去表层5cm，取5～15cm处，用无菌器具采样，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，采样后分离，振摇20-25min，使土样与水充分混合，将细胞分散，放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出；

（2）用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，重复步骤，制成10

然后用无菌吸管分别由10

（3）将步骤（2）的平板培养基倒置于30℃培养箱中培养1-3d；

（4）观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到种子培养基上，置于30°C的培养箱中培养，即得到待选的菌株；

（5）对待选的菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株AM-05；

（6）将菌种培养物支撑30%甘油管，放置在-80℃冰箱内保藏，待用；

（二）菌种的发酵

取分离出的枯草芽孢杆菌AM-05，经逐级发酵，加入15吨发酵罐，发酵48小时，喷雾干燥，得500亿/克左右的枯草芽孢杆菌AM-05产品。

高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05中，步骤（2）中培养基的配置方法：蛋白胨：10-13g，酵母膏：4-5g，NaCl：9-12g，可溶性淀粉：1-2g，琼脂：18-20g，用蒸馏水定容至900-1000mL，pH值为7.2-7.6，封口后，于120-125℃，高压灭菌21-23min。

高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05中，步骤（4）中培养基的配置方法：豆饼粉：10-13g，玉米粉:1-3g，Na

高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05中，步骤（二）逐级发酵时所需的发酵培养基按质量百分比计包括以下组分：豆饼粉：70-80%，玉米粉:5-10%，Na

本发明还设计一种枯草芽孢杆菌AM-05在降解呕吐毒素中的应用，先将枯草芽孢杆菌AM-05加入修饰膨润土中，再加入酵母细胞壁，即可得呕吐毒素专用脱毒剂呕吐灵，然后将脱毒剂呕吐灵与被呕吐毒素污染的饲料混合；

按质量百分比计：枯草芽孢杆菌AM-05：10-30%，修饰膨润土：40-60%，酵母细胞壁：5-15%，以上各组分之和为100%。

本发明的有益效果是：

枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中, 易在枯草浸汁中繁殖，它生长速度快,对营养要求比较低, 能高效分泌许多蛋白及代谢产物, 且其不会产生毒素, 是一种无致病性的安全微生物，枯草芽孢杆菌AM-05菌株是在感染赤霉病的小麦田间土壤先中分离筛选得到的，可高效降解呕吐毒素。

本发明中分离纯化得到对DON降解性能好的微生物菌种AM-05培养，筛选分离纯化技术简单。

本发明的菌株降解DON的稳定性良好，在优化培养基中传代8代，DON降解率均能达到90％以上，动物实验证明可有效缓解呕吐毒素的危害。

本发明实施例提供的枯草芽胞杆菌AM-0应用的脱毒剂呕吐灵提高仔猪的生长性能，脱毒剂利用枯草芽胞杆菌实现生物吸附，同时酵母细胞壁能够结合霉菌毒素实现生物吸附，从而有效脱去饲料中的霉菌毒素。

具体实施方式

实施例1

本实施例通过分离筛选，从感染赤霉病的小麦田间土壤中分离筛选发酵得到一种高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌AM-05，具体的制备方法如下：

（一）菌种的筛选

（1）取感染赤霉病的小麦田间土壤，铲去表层5cm，取5～15cm处，用无菌器具规范采样，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证，采样后应尽快分离，振摇二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散，放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出；

（2）用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推重复步骤，制成10

然后用无菌吸管分别由10

（3）将步骤（2）的平板培养基倒置于30℃培养箱中培养1-3d；

（4）观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到种子培养基上，置于30°C的培养箱中培养，即得到待选的菌株，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化；若不能用肉眼更好的观察，对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较；

分离菌株的鉴定

(a)菌落形态鉴定

挑选培养18～24h的AM-05的新鲜单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌种生理形态，将单菌落接种至无机盐培养基中过夜培养，5000r/min离心5min后弃上清，用蒸馏水悬浮菌体，5000r/min离心5min，重复上述操作一次，弃上清后用2mL无菌蒸馏水悬浮菌体，冷冻干燥得到菌粉，用扫描电镜进行观察；

本发明提供的AM-05的形态特征如下：菌株在LB平板上37℃培养24h后，菌落呈圆形，直径在1-2mm，边缘整齐，表面湿润有光泽，呈灰白色；通过革兰氏染色在显微镜下进行观察，该菌株为革兰氏阴性菌，形态呈短杆状，将离心后的菌体冷冻干燥后，用SEM对干燥的菌粉进行观察，在20000×的倍数下，菌体呈长短不等排列不规律的短杆状，两端钝圆，大小在0.5×1～3μm。

(2)生化特性分析

参照《细菌系统鉴定手册》常见菌株鉴定方法对白色菌株进行生理生化鉴定。

葡萄糖及其他糖醇类的氧化发酵：将培养了18～24h AM-05新鲜单菌落穿刺接种于休和利夫森二氏培养基中，用灭菌的凡士林石蜡油封盖，0.5～1cm厚，以隔绝空气，同时设计不做封油的实验组验证菌株的氧化发酵类型，室温培养1，2，3，7，14d后，观察颜色变化，分别用乳糖、麦芽糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、木糖和蔗糖代替葡萄糖，检测菌株的糖醇类利用情况。

（5）对待选的菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株；

（6）将菌种培养物支撑30%甘油管，放置在-80℃冰箱内保藏，待用；

（二）菌种的发酵

取分离出的枯草芽孢杆菌AM-05，经逐级发酵，加入15吨发酵罐，发酵48小时，喷雾干燥，得500亿/克左右的枯草芽孢杆菌AM-05产品。

在本实施例中，步骤（2）中培养基的配置方法：蛋白胨：10-13g，酵母膏：4-5g，NaCl：9-12g，可溶性淀粉：1-2g，琼脂：18-20g，用蒸馏水定容至900-1000mL，pH值为7.2-7.6，封口后，于120-125℃，高压灭菌21-23min。

在本实施例中，步骤（4）中培养基的配置方法：豆饼粉：10-13g，玉米粉:1-3g，Na

在本实施例中，步骤（二）逐级发酵时所需的发酵培养基按质量百分比计包括以下组分：豆饼粉：70-80%，玉米粉:5-10%，Na

本实施例还涉及枯草芽孢杆菌AM-05在降解呕吐毒素中的应用，即先将枯草芽孢杆菌AM-05加入修饰膨润土中，再加入酵母细胞壁，按质量百分比计：枯草芽孢杆菌AM-05：10-30%，修饰膨润土：40-60%，酵母细胞壁：5-15%，以上各组分之和为100%，得到呕吐毒素专用脱毒剂呕吐灵，然后将脱毒剂呕吐灵与被呕吐毒素污染的饲料混合，有效降解呕吐毒素，且饲料中不用再添加其他有害化学试剂，不会造成饲料风味的改变和营养价值的流失，本实施例中的枯草芽孢杆菌AM-05，筛选分离纯化技术简单，对DON降解性能好，降解的稳定性好，对呕吐毒素降解率可以达到90%以上，动物实验证明可有效缓解呕吐毒素的危害。

对本实施例枯草芽孢杆菌AM-05应用时混合的脱毒剂呕吐灵进行体外、模拟体内评估方法（HPLC 法）Q/3201 AOMAI-BIO 10-2013：

1. 呕吐毒素标准储备溶液

称取标准品呕吐毒素 1.0mg（精确到 0.01mg）置于 50ml 容量瓶中，用甲醇溶解，定容至 50ml，此标准溶液浓度为 20μg/ml，保存于 4℃冰箱备用；

2.呕吐毒素标准工作液

准确移取一定量的呕吐毒素标准储备液，用甲醇稀释，分别配成 0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml 的标准工作液；

3. 试样的制备

按 GB/T 14699.1 采样，选本发明的脱毒剂呕吐灵样品500g，四分法缩减至100g，全部通过 0.28mm 孔筛，混匀装入密闭容器中，避光室温保存备用；

采集猪小肠肠道食糜，高速离心机 20000 rpm 离心，提取上清液共 10ml，保存于4℃冰箱备用；

4. 试样溶液的制备

体外法测定时：称取试样 0.2g（精确到 0.002g），置于 100ml 容量瓶中，双蒸水定容（得到 2mg/ml 的吸附剂溶液），避光、磁力搅拌 24 小时，分别精密吸取 0.25ml 吸附剂溶液与 0.25ml 10μg/ml 呕吐毒素标准品于 1.5ml 离心管中，置于恒温振荡金属浴上37℃避光吸附 4 小时，15000r/min 高速离心 10min，取上清液过滤进行 HPLC 检测；

模拟体内法测定时：称取试样 0.2g（精确到 0.002g），置于 100ml 容量瓶中，吸取小肠食糜上清液 10ml加入，再用双蒸水定容（得到 2mg/ml 的吸附剂溶液），避光、磁力搅拌 24 小时，分别精密吸取 0.25ml 吸附剂溶液与 0.25ml 10μg/ml 呕吐毒素标准品于1.5ml 离心管中，置于恒温振荡金属浴上 37℃避光吸附 4 小时。15000r/min 高速离心10min，取上清液过滤进行 HPLC 检测。

5. 测定

高效液相色谱条件：色谱柱：C18 柱，长 150mm，内径 4.6mm，填料直径 5μm；

测定呕吐毒素时，流动相为甲醇：水=20:80，超声脱气，经过 0.45μm滤膜过滤；

流速：1ml/min，进样体积：20μL，检测波长：呕吐毒素218nm，保留时间： 10-15min；

6. 定量测定

标准曲线的制定：向色谱柱注入标准工作液，以标准工作液浓度为横坐标，色谱峰面积值为横坐标，绘制标准曲线；

向色谱柱注入试样溶液，得到色谱峰面积的响应值，根据标准溶液峰面积标准曲线图计算试样溶液中霉菌毒素的残留量。

试样溶液对霉菌毒素的吸附率计算公式：

X = m 1/ m 0* 100% = (m 0 -m 2)/ m 0* 100%

X：供试品对霉菌毒素的吸附率（%）

m 0 : 霉菌毒素的添加量

m 1 : 霉菌毒素的吸附量

m 2 : 霉菌毒素的残留量

取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，平行测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 0.2%，由此得到呕吐灵对呕吐毒素降解率可以达到90%以上。

呕吐灵对仔猪生长性能的影响

本试验选取28头断奶仔猪（3周龄），随机分配到4个处理组，每组7头，每头仔猪饲养于1个代谢笼。第1组饲喂基础（BD），其日粮满足NRC（2012）的营养需要量，其它3组饲喂BD分别添加1.0 mg/kg DON、3.0 mg/kg DON及3.0 mg / kg DON + 0.05％呕吐灵（本发明制备的呕吐灵）。

试验分组具体见表1所示：

表1试验分组

记录试验期间仔猪每周的体重及采食量，计算其日增重和饲料转化率。

日粮中各毒素含量，具体见表2所示：

表2 每组日粮中几种毒素实际含量

注：1DON、AFB1及ZEA的检测线分别为100、0.5及10 μg/kg；DON为HPLC测定值；AFB1与ZEA为ELISA测定值；-为未检测出。

生长性能指标见表3所示：

表3呕吐毒素和呕吐灵对仔猪生长性能的影响

注：结果表示为平均数±标准误（n=7），同行肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

由表3可知，与对照组相比，日粮添加DON为1.0 mg/kg能显著降低（

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。