降解灵芝β-葡聚糖制备灵芝β-葡寡糖的方法

技术领域

本申请涉及化学领域，具体地，涉及降解灵芝β-葡聚糖制备灵芝β-葡寡糖的方法。

背景技术

灵芝自古就有“仙草”、“瑞草”之称，在古代灵芝常被人们认为可以延年益寿，灵芝营养丰富，药用价值很高，在我国已经有了超过4000年的中医药应用历史。灵芝β-葡聚糖作为灵芝中最丰富的成分之一，具有广泛的药理作用，如免疫调节、抗癌、抗氧化及抗炎等。灵芝β-葡聚糖是生物大分子，其主链结构为β-1,3-葡聚糖，侧链为β-1,6-吡喃葡萄糖基，通常采用水提醇沉的方法得到，作为大分子量多糖，灵芝β-葡聚糖的水溶性较差、黏度较高，这极大的阻碍了其在临床上的广泛应用。已有文献表明，多糖降解后得到的寡糖生物学活性提高，因此将灵芝β-葡聚糖降解为寡糖被认为具有较高的临床应用潜力。目前常用的降解方法主要有化学法、物理法及酶法等，这些方法在微生物、谷物及酵母β-葡聚糖的应用较为广泛，但对于灵芝β-葡聚糖的降解效果仍鲜有报道。由于不同的β-葡聚糖在分子量、结构及物理特性等方面存在着差异，其降解效果也会存在明显的差异，而目前对于灵芝β-葡聚糖的降解研究较少，因此寻找一种有效降解灵芝β-葡聚糖的方法至关重要。

发明内容

本发明通过一种简单高效的微波降解方法，从灵芝β-葡聚糖中降解得到了灵芝β-葡寡糖，采用化学法测定了降解率，通过色谱分析与质谱分析相结合的方法，确定了其降解后的分子量及聚合度分布。该方法的降解率高，并可以得到特定分子量区段的多种寡糖片段。

本发明目的在于提供一种简单高效且污染较少的灵芝β-葡聚糖的微波降解方法，通过该方法得到的产物降解率高、寡糖组成丰富。

本发明提供的一种灵芝β-葡聚糖的降解方法，包括如下步骤：

1、配制灵芝β-葡聚糖浓度为5-30mg/mL；

2、将溶液采用均质化处理，使灵芝β-葡聚糖均匀分散在溶液中；

3、将此溶液置于微波消解仪中，设置微波功率为800-1000w，在120-180℃下进行降解，降解时间为40-60min；

4、离心除去降解后不溶性杂质，即得到灵芝β-葡寡糖。

本发明所具有的有益效果如下：

1)通过上述微波法降解灵芝β-葡聚糖重现性好，产品质量稳定；

2)本发明工艺简单，流程短，可以大大缩短降解时间，成本低廉；

3)与传统的降解方法相比，本发明产物的分子量显著降低，降解效率高、产物中寡糖组成丰富，产物后处理简单，对环境的污染较小。

附图说明

图1示出了实施例1的灵芝β-葡聚糖微波降解产物的高效凝胶排阻色谱图。

图2示出了实施例1的灵芝β-葡聚糖微波降解产物的高效阴离子色谱图。

图3示出了实施例1的灵芝β-葡聚糖微波降解产物的质谱图。

图4示出了实施例2的灵芝β-葡聚糖微波降解产物的高效阴离子色谱图。

图5示出了实施例3的灵芝β-葡聚糖微波降解产物的高效凝胶排阻色谱图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本申请，但不以任何方式限制本申请。除非另有说明，本申请中使用的试剂均为常用的商购试剂。

实施例1：灵芝β-葡聚糖的降解

称取灵芝β-葡聚糖GLP206 g加入700mL蒸馏水，配成8.57mg/mL的灵芝β-葡聚糖溶液。水浴100℃加热保持30min，降至室温，均质化处理3min使灵芝β-葡聚糖均匀分散于溶液中。将此溶液置于微波消解仪中，调节微波功率为1000W，140℃降解50min。降解产物用离心机以8000rpm转速离心20min，取出上清液，冷冻干燥得到淡黄色固体产物。

实施例2：灵芝β-葡聚糖的降解

称取灵芝β-葡聚糖GLP206 g加入1200mL蒸馏水，配成5mg/mL的灵芝β-葡聚糖溶液。水浴100℃加热保持30min，降至室温，均质化处理3min使灵芝β-葡聚糖均匀分散于溶液中。将此溶液置于微波消解仪中，调节微波功率为1000W，120℃降解60min。降解产物用离心机以8000rpm转速离心20min，取出上清液，冷冻干燥得到淡黄色固体产物。

实施例3：灵芝β-葡聚糖的降解

称取灵芝β-葡聚糖GLP206 g加入200mL蒸馏水，配成30mg/mL的灵芝β-葡聚糖溶液。水浴100℃加热保持30min，降至室温，均质化处理3min使灵芝β-葡聚糖均匀分散于溶液中。将此溶液置于微波消解仪中，调节微波功率为1000W，180℃降解40min。降解产物用离心机以8000rpm转速离心20min，取出上清液，冷冻干燥得到淡黄色固体产物。

采用醇沉分离结合苯酚硫酸法测定降解率，计算公式为：

式中：A

醇沉分离步骤：取降解产物，边搅拌边加入无水乙醇至醇浓度为50％，4℃静置过夜，8000rpm离心20min，分别收集上清及沉淀，减压浓缩挥去乙醇，定容后采用苯酚硫酸法分别测定醇沉上清及沉淀中糖含量。

苯酚硫酸法测定糖含量：

①标准曲线的测定：准确吸取0.1mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于试管中，加水补足至1mL，分别加0.5mL 5％的苯酚，2.5mL浓硫酸混合均匀，100℃水浴加热15min，冷却至室温，490nm处测定吸光度值。以紫外吸光度对葡萄糖标准溶液浓度作图，得葡萄糖浓度标准曲线及回归方程。

②样品糖含量测定：准确吸取约0.1mg/mL的样品溶液1mL加入5％苯酚0.5mL，浓硫酸2.5mL，混合均匀后，100℃水浴加热15min，冷却至室温，490nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准曲线回归方程计算样品糖含量。

采用醇沉分离结合苯酚硫酸法测定微波降解灵芝β-葡聚糖的降解率均高于94％。

经高效凝胶色谱(Waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，结果如图1及图5所示，原样灵芝β-葡聚糖的分子量为2.28×10

经高效阴离子色谱(Dionex公司ICS-5000+离子色谱系统)配备CarbopacTM PA-100色谱柱(4mm×250mm)进行分离，以脉冲安培检测器进行分析，结果如图2及图4所示，降解产物中寡糖含量较多。

经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(AB SCIEX公司5800MALDI-TOF/TOF系统)测定产物聚合度，结果如图3所示，经微波法降解得到的产物聚合度为3-19。

如图1至图5所示，微波降解产物经高效凝胶排阻色谱法测定，产物在原样处的色谱峰基本消失，分子量明显降低，说明微波法对灵芝β-葡聚糖有明显的降解效果，采用苯酚硫酸法测得其产物的降解率均高于94％，与液相结果相符。采用高效阴离子色谱及质谱对降解产物进行分析(如图2、图3所示)，结果表明，微波降解产物中寡糖种类较丰富，产物的聚合度为3-19。

另外，对实施例2和实施例3得到的产物进行了相应的测定，与实施例1中得到的结果相近。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。