奥扎格雷钠残留溶剂的测定方法

技术领域

本发明涉及一种奥扎格雷钠残留溶剂的测定方法。

背景技术

奥扎格雷钠，其化学名为：反式-3-4-(1H-咪唑基-1-甲基)苯基-2-丙烯酸钠，适用于治疗急性血栓性脑梗死和脑梗死所伴随的运动障碍。

该化合物在合成过程中，可能会使用到甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃这几类溶剂。这些残留溶剂对人体健康有一定的不利影响，需要将其控制在中国药典和ICH指导原则的规定限度内，保证用药的安全。

发明内容

针对现有技术中无法同时测定多种残留溶剂、重现性低、方法不稳定等缺陷，提供了一种奥扎格雷钠残留溶剂的测定方法，该方法能够同时准确定量测定奥扎格雷钠中4种残留溶剂，灵敏度高、准确度高、专属性强、重现性良好、方法稳定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种奥扎格雷钠残留溶剂的测定方法，其包括以下步骤：

分别将空白溶液、对照品溶液和供试品溶液加热平衡后，采用顶空进样的方式注入到气相色谱仪中，记录色谱图，按外标法以峰面积计算残留溶剂的含量；

所述残留溶剂包括甲醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃中的一种或其混合(例如两种以上)；

所述空白溶液、所述对照品溶液和所述供试品溶液中，溶剂为水；

气相色谱的条件为：

色谱柱温度：起始温度为35～45℃，维持1～3min；以24～26℃/min的速率升至235～245℃，维持3～6min；

顶空条件：平衡温度为75～85℃，平衡时间为25～35min，定量环温度为85～95℃。

所述气相色谱的条件中，色谱柱为DB-624毛细管柱。

所述气相色谱的条件中，色谱柱的规格为30m×0.53mm，3.0μm。

所述气相色谱的条件中，采用的检测器可为本领域常规，较佳地为火焰离子化检测器(FID)。

所述气相色谱的条件中，检测器的温度可为本领域常规，较佳地，检测器的温度为245～255℃，例如250℃。

所述气相色谱的条件中，气相色谱仪可为本领域常规，较佳地，气相色谱仪为安捷伦GC 7890B。

所述气相色谱的条件中，进样口的温度可为本领域常规，较佳地，进样口的温度为195～205℃，例如200℃。

所述气相色谱的条件中，载气可为本领域常规，较佳地，载气为氮气。

所述气相色谱的条件中，载气的流量可为本领域常规，较佳地，载气的流量为3.5～4.5mL/min，例如4.0mL/min。

所述气相色谱的条件中，分流比可为本领域常规，较佳地，分流比为(9～11)：1，例如10:1。

所述气相色谱的条件中，较佳地，所述色谱柱温度中，所述起始温度为40℃，维持2min；以25℃/min的速率升至240℃，维持5min。

所述气相色谱的条件中，较佳地，所述顶空条件中，所述平衡温度为80℃，平衡时间为30min。

所述气相色谱的条件中，较佳地，所述顶空条件中，所述定量环温度为90℃。

所述气相色谱的条件中，传输线温度可为本领域常规，较佳地，传输线温度为95～105℃，例如105℃。

所述气相色谱的条件中，进样量可为本领域常规，较佳地，进样量为0.8～1.2mL，例如1mL。

所述气相色谱的条件中，尾吹流量可为本领域常规，较佳地，尾吹流量为25-35mL/min，例如30mL/min。

所述测定方法中，较佳地，所述空白溶液为水，例如纯化水。

所述测定方法中，较佳地，所述对照品溶液包括甲醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃中的一种或其混合的水溶液。更佳地，所述对照品溶液为包括甲醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃的水溶液。

所述测定方法中，较佳地，所述对照品溶液中，甲醇的浓度为0.14-0.16mg/mL，例如0.15mg/mL，所述浓度指单位体积所述对照品溶液中甲醇的质量。

所述测定方法中，较佳地，所述对照品溶液中，异丙醇的浓度为0.24-0.26mg/mL，例如0.25mg/mL，所述浓度指单位体积所述对照品溶液中异丙醇的质量。

所述测定方法中，较佳地，所述对照品溶液中，乙腈的浓度为0.020-0.021mg/mL，例如0.0205mg/mL，所述浓度指单位体积所述对照品溶液中乙腈的质量。

所述测定方法中，较佳地，所述对照品溶液中，四氢呋喃的浓度为0.035-0.037mg/mL，例如0.036mg/mL，所述浓度指单位体积所述对照品溶液中四氢呋喃的质量。

所述测定方法中，较佳地，所述供试品溶液为包括奥扎格雷钠的水溶液。更佳地，所述供试品溶液为奥扎格雷钠的水溶液。

所述测定方法中，较佳地，所述供试品溶液中，奥扎格雷钠的浓度为48-52mg/mL，例如50mg/mL。

本发明中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。

本发明中，“外标法”中，奥扎格雷钠残留溶剂的重量含量的计算公式为：

其中：

A

C

A

C

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明测试方法能够同时准确定量测定奥扎格雷钠中4种残留溶剂，线性良好(线性相关系数均r≥0.999)，在100％加标浓度水平的回收率在90％～104％之间且RSD＝1％，重现性良好，灵敏度高，准确度高，专属性强，方法稳定。通过对其中这些可能存在的残留溶剂的控制，确保其作为原料药的安全性，从而进一步保证其制剂的安全性，降低用药风险。该方法适用于实验室研发，同时也适用于商业化生产的质量控制。

附图说明

图1为实施例1空白溶液色谱图；

图2为实施例1对照品溶液色谱图；

图3为实施例1供试品溶液色谱图；

图4为实施例2专属性实验中的色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中，如无特别说明，稀释剂为纯化水。

以下实施例中，使用的气相色谱条件如下表1所示：

表1

实施例1

1.空白溶液的制备：

取稀释剂2mL置10mL顶空瓶中，加盖密封。

2.对照品溶液的制备：

取甲醇300mg，异丙醇500mg，乙腈41mg，四氢呋喃72mg，精密称定，置一个装有少量稀释剂的100mL的容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。再取此溶液5mL置一个100mL的容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得，标记为STD。进样时，取2mL置10mL顶空瓶中，加盖密封。

室温条件下，对照品溶液在17.4小时内稳定。

3.供试品溶液的制备：

称取奥扎格雷钠样品100mg(购自山东希尔康泰药业有限公司，批号191101)，精密称定，置于10mL顶空瓶中，加入2mL稀释剂，加盖密封。

室温条件下，供试品溶液在17.4小时内稳定。

4.含量测定：

将上述空白溶液、对照品溶液和供试品溶液采用顶空进样的方式注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。

进样检测的顺序为：以第一针为空白溶液，接着连续六针对照品溶液，最后两针平行的供试品溶液的进样顺序依次进样检测。

5.实验结果

如图1～3和表2所示，空白基线干净稳定，对各目标溶剂(即各残留溶剂)检测无干扰。

表2

6针连续进样的对照品溶液色谱图中各目标溶剂峰面积的RSD均≤2％，保留时间的RSD均≤0.02％。

实施例2专属性实验

1.稀释剂

纯化水。

2.空白溶液的制备：

取稀释剂2mL置10mL顶空瓶中，加盖密封。

3.各目标溶剂的定位溶液，具体配制如表3所示：

表3

4.供试品溶液的制备：

称取奥扎格雷钠样品99.93mg，精密称定，置于10mL顶空瓶中，加入2mL稀释剂，加盖密封。

5.对照品溶液的制备：

取甲醇301.07mg，异丙醇500.71mg，乙腈41.75mg，四氢呋喃73.44mg，精密称定，置一个装有少量稀释剂的100mL的容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。再取此溶液5mL置一个100mL的容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得，标记为L-100。进样时，取2mL置10mL顶空瓶中，加盖密封。

6.分离度溶液的制备：

称取奥扎格雷钠样品1001.42mg，精密称定，加入20mL对照品溶液进行稀释，加盖密封。

7.专属性考察：

将上述空白溶液、各目标溶剂的定位溶液、供试品溶液、对照品溶液和分离度溶液采用顶空进样的方式注入气相色谱仪，气相色谱条件如实施例1表1所示，记录色谱图，考察方法的专属性。分别将专属性结果以及空白溶剂和分离度溶液的放大叠加谱图输入表4与图4。

接受标准：

空白基线干净稳定，对各目标溶剂检测应无干扰。如存在干扰峰，其峰面积不得过前6针STD色谱图中被干扰溶剂峰面积平均值的10％，并在计算中予以扣除。

分离度溶液中各目标溶剂与相邻峰的分离度应不小于1.5。

验证结果：

表4专属性

结果显示，空白基线干净稳定，对各目标溶剂检测无干扰；分离度溶液中各目标溶剂与相邻峰的分离度均≥2.0，符合规定。

实施例3系统精密度

将以实施例2中的对照品溶液(L-100)采用顶空进样的方式注入气相色谱仪，并连续进样6针(分别标记为STD_01～STD_06)，气相色谱条件如实施例1表1所示，记录色谱图，计算6针供试品溶液色谱图中各目标溶剂峰面积的RSD以及保留时间的RSD。

接受标准：

连续6针进样STD色谱图中各目标溶剂峰面积的RSD应≤10％，保留时间的RSD应≤1.0％。

验证结果：

结果如表5所示：

表5系统精密度

结果显示连续6针进样供试品溶液色谱图中各目标溶剂峰面积的RSD均≤1％，保留时间的RSD均≤0.04％，符合规定。

实施例4定量限(LOQ)和检测限(LOD)测试

1.LOQ测试溶液和LOD测试溶液的制备和测试：

将实施例2中的对照品溶液(L-100)进一步稀释得到一组LOQ测试溶液(L-2和L-0.2)，每份溶液进6针；计算LOQ测试溶液中各目标溶剂的信噪比与6针峰面积的RSD。

将LOQ测试溶液(L-2和L-0.2)进一步稀释得到一组LOD测试溶液(L-1、L-0.5和L-0.05)，每份溶液进1针；计算LOD测试溶液中各目标溶剂的信噪比，选择S/N≥3的最小浓度作为LOD。

LOQ测试溶液和LOD测试溶液的配制方法如表6所示，气相色谱条件如实施例1表1所示。

表6

2.接受标准：

LOD S/N≥3；

LOQ S/N≥10，峰面积的RSD≤20％。

结果如以下表7～10所示：

表7甲醇的LOQ&LOD

表8异丙醇的LOQ&LOD

表9乙腈的LOQ&LOD

表10四氢呋喃的LOQ&LOD

结果显示，各目标溶剂LOD S/N均≥7；LOQ S/N均≥10，峰面积的RSD均≤8％，符合规定。

实施例5线性关系考察

1.配制标准储备溶液，配制过程如下表11：

表11

2.配制一组不同标准浓度水平的线性溶液(50％，80％，100％，150％和200％)，每个浓度水平进一针，气相色谱条件如实施例1表1。配制过程如下表12：

表12

将各目标溶剂实施例4中LOQ的第一针与线性溶液的测试结果一起考察并计算线性方程与相关系数。

从LOQ到200％的线性浓度水平，包括6个标准测试浓度。

在LOQ～200％浓度区间，以浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，作图得到各目标溶剂的线性方程与相关系数r。

接受标准：

LOQ～200％的浓度区间，各目标溶剂的线性方程相关系数r应≥0.990。

验证结果：

将线性测试的结果分别输入表13～16。

表13甲醇的线性数据

表14异丙醇的线性数据

表15乙腈的线性数据

表16四氢呋喃的线性数据

结果显示，LOQ～200％的浓度区间，各目标溶剂的线性方程相关系数r均≥0.9998，符合规定。

实施例6重复性实验

1.在100％浓度水平配制6份加标样品溶液，配制过程如下表17：

表17

2.空白样品溶液的配制：

平行配制两份空白样品溶液(50mg/mL)，配制过程如下表18：

表18

3.计算6份100％浓度水平加标样品溶液中各目标溶剂的百分回收率，相关结果如表19～22所示。

按照下列公式计算各目标溶剂的百分回收率(Recovery)：

其中：

C

C

C

按照下列公式计算加标溶液中相应溶剂的测得浓度(mg/mL)：

其中：

A

A

C

按照下列公式计算加标溶液中相应溶剂的原有浓度(mg/mL)：

其中：

％C

W

V

接受标准：

各目标溶剂在100％加标浓度水平的回收率应为80％～120％，6份百分回收率的RSD应≤15％。

验证结果：

表19甲醇的重复性

表20异丙醇的重复性

表21乙腈的重复性

表22四氢呋喃的重复性

结果显示，各目标溶剂在100％加标浓度水平的回收率为91％～105％，6份百分回收率的RSD均＝1％，符合规定。

实施例7准确度实验

1.在50％和150％浓度水平配制6份加标样品溶液，每个浓度平行配制3份，配制过程如下表23：

表23

2.计算50％和150％浓度水平配制6份加标样品溶液中各目标溶剂的百分回收率。

将50％和150％浓度水平6份加标样品溶液连同重复性实验(实施例6)项下前3份100％浓度水平加标样品溶液的百分回收率，一起计算各目标溶剂的百分回收率，结果如表24～27所示。

接受标准：

各目标溶剂在50％，100％，150％加标浓度水平的百分回收率应为80％～120％。

验证结果：

表24甲醇的准确度

表25异丙醇的准确度

表26乙腈的准确度

表27四氢呋喃的准确度

结果显示，各目标溶剂在50％，100％，150％加标浓度水平的百分回收率为91％～110％，符合规定。

实施例8溶液稳定性

1.用100％浓度水平的加标样品溶液(RS)考察分离度溶液的稳定性，配制过程如下：准确称量1001.42mg奥扎格雷钠，使用20mL的L-100(来自实施例2)进行稀释，摇匀即得，标记为RS。

2.将RS溶液按一定的时间间隔重复进样，考察一定时间的稳定性。

计算每个时间间隔RS溶液中各目标溶剂的含量C

3.接受标准：

每个时间间隔RS溶液中各目标溶剂的含量CX与第一针RS溶液中各目标溶剂的含量C0的百分比S应为90％～110％。

验证结果：结果如表28～31所示：

表28甲醇的稳定性

表29异丙醇的稳定性

表30乙腈的稳定性

表31四氢呋喃的稳定性

结果显示，每个时间间隔RS溶液中各目标溶剂的含量C

实施例9中间精密度实验

1.由另一位分析人员配制100％浓度水平的对照品溶液，配制过程如下表32：

表32

2.由另一位分析人员平行配制2份空白样品溶液以及6份100％浓度水平的加标样品溶液，配制过程如下表33：

表33

3.参考前述实施例，计算6份100％浓度水平加标样品百分回收率的RSD，结果如表34～37所示：

接受标准：

中间精密度项下各目标溶剂在6份100％加标浓度水平的百分回收率应为80％～120％，其回收率的RSD应≤15％。

重复性项下与中间精密度项下共12份100％浓度加标样品溶液中，各目标溶剂的百分回收率的RSD应≤20％。

验证结果：

表34甲醇的重复性

表35异丙醇的重复性

表36乙腈的重复性

表37四氢呋喃的重复性

4.将表19～22和表34～37中的结果整合如表38所示：

表38各目标溶剂的中间精密度

结果显示，中间精密度项下各目标溶剂在6份100％加标浓度水平的百分回收率为90％～104％，其回收率的RSD均＝1％；实施例6的重复性实验项下与本实施例中间精密度项下共12份100％浓度加标样品溶液中，各目标溶剂的百分回收率的RSD≤2％，符合规定。

实施例10耐用性实验

通过改变表39参数来验证该方法的耐用性，每次仅改变其中一个参数。方法耐用性通过对对照溶液、供试品溶液及专属性溶液的测试来验证。改变下列参数并进行测试，其结果和不改变参数时所测结果比较。

表39

1.在100％浓度水平配制对照品溶液，配制过程如下表40：

表40

2.配制12份空白样品溶液(50mg/mL)，配制过程如下表41：

表41

3.在100％浓度水平配制18份加标样品溶液，配制过程如下表42：

表42

4.在每个耐用性考察条件下，将2份空白样品溶液和3份100％浓度水平的加标样品溶液各进一针，计算各目标溶剂的百分回收率。百分回收率(Recovery)计算公式参见实施例6。

5.各条件下的系统适用性结果见表43～45。

表43

表44

表45

耐用性结果如表46～57所示：

表46 MeOH的耐用性结果

表47 IPA的耐用性结果

表48 ACN的耐用性结果

表49 THF的耐用性结果

表50 MeOH的耐用性结果

表51 IPA的耐用性结果

表52 ACN的耐用性结果

表53 THF的耐用性结果

表54 MeOH的耐用性结果

表55 IPA的耐用性结果

表56 ACN的耐用性结果

表57 THF的耐用性结果

结果显示，在各个条件下，均符合系统适用性要求；在各个实验参数(平衡温度、进样口温度、流速)调整条件下的6份100％浓度水平加标样品溶液中各目标溶剂的回收率分别与原始条件下的3份100％浓度水平加标样品溶液中各目标溶剂的回收率均在87％～105％范围内，且9份回收率的RSD均≤5％。