一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。随着世界人口的老龄化，AD的发病率也在逐年上升，已成为继心脑血管疾病和肿瘤后第三大危及人类生命健康的疾病。阿尔茨海默症是一种与年龄相关的疾病，患病概率极高，我国65岁的老年人患病概率为5％左右；到85岁，患病概率高达40％。世界各地的研究人员正在开发新的诊断方法，可让人们能够在症状还很轻微或者症状出现之前检测出来，以达到早发现早干预的目的。

现有的阿尔茨海默病的检测方法有以下几种：(1).实验室检查。血、尿常规、血生化检查；(2).脑电图，阿尔茨海默病的早期脑电图改变主要是波幅降低和节律减慢；(3).影像学，CT检查见脑萎缩、脑室扩大，头颅磁共振检查显示双侧颞叶、海马萎缩情况；(4).神经心理学检查，对阿尔茨海默病的认知进行评估，评估领域包括记忆功能、语言功能、定向力、运用能力、注意力、知觉和执行功能等七个领域；(5).基因检查，对有明确家族史的患者可以进行基因检测；(6).采用免疫结合反应的原理来检测阿尔茨海默病，且在阿尔茨海默病中的价值越来越受到广泛的关注。

目前，采用免疫结合反应的原理来检测阿尔茨海默病的方法有酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)、PCR法、免疫组化法等。其中，应用较多的为ELISA法，其是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。上述方法主要是针对已有发病症状的被检测者进行检测，而不能针对未发病的被检测者进行检测。因为，上述方法均采用检测抗体的方式进行检测被检测者是否患有阿尔茨海默病。众所周知，当体内产生特异性抗体时，说明抗原已经在体内存在至少一个月的时间了，也就是说，该被检测者已经患有阿尔茨海默病，那么就表现出症状，所以说上述方法是针对已有发病症状的被检测者进行检测的。那么，也就是不属于早期诊断，而属于中晚期诊断，与早期诊断相比会耽误最佳干预时机。

如专利CN 111175277 A，公开了一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法，其采用抗原-抗体-二抗酶的模式进行检测。再如专利CN107907676A，其公开了一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒及其制备方法，其试剂盒，设有试纸卡，所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株。该专利采用了酶联免疫吸附测定(ELISA)法中的(抗体-抗原-抗体酶)模式进行检测，虽然在一定程度上可达到早期诊断的目的，但是其还存在以下缺点：一是，虽然采用ELISA法检测灵敏度高，但是如果抗体有非特异性结合，那么检测结果准确性将会受到影响。二是，待测样本多采用血清、血浆等，需要进行创伤性采集，对人体伤害相对较大。虽然该专利中采用了无创伤便可采集的尿液，但是采用尿液作为样本，尿液需要等待24小时后才可用于检测，从时间上来讲，检测时间较长。

目前，还没有研究人员将Western Blot法应用于阿尔兹海默病的检测中。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种可实现对阿尔茨海默病的早期检测，且高特异性，检测迅速，便捷，无创伤的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，用被检测者口腔咽喉部分泌物为待测样本，所述待测样本与特异性抗体相结合后，用酶对特异性抗体进行标记，通过滴加与酶反应的显色底物后，观察是否显色来判断检测结果的检测方法。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，所述检测方法包括如下步骤：

S1.待测样本采集，采集被检测者的口腔咽喉部分泌物，备用；

S2.检测卡冲洗，然后用缓冲液冲洗检测卡，冲洗的次数为3-5次，备用；

S3.加入待测样本，将步骤S1采集得到的口腔咽喉部分泌物加至步骤S2得到的检测卡上，等待30-35min；其中，口腔咽喉部分泌物的抗原与检测卡上的特异性抗体相结合，使得特异性抗体上的酶特定结合点暴露；

S4.滴加酶，向检测卡上滴加1ml的酶，对检测卡上的特异性抗体进行标记，等待30-35min，其中，加入酶后，酶与特异性抗体上暴露出的酶特定结合点相结合；

S5.滴加底物，向检测卡上滴加1ml的可与酶反应而显色的底物，等待5-10min；

S6.观察检测结果，最后观察检测卡上有没有显色，并与对照卡上的色条对比，如没有显现出有色条带则检测结果为阴性，如果显现出有色条带则检测结果为阳性。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，所述口腔咽喉部分泌物为采用含有被检测者口腔腮部上皮细胞的漱口水。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，所述口腔咽喉部分泌物为采用咽拭子检测的方式使用医用棉棒进行采集得到的口腔腮部上皮细胞。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，在步骤S3中，等待30-35min后，用缓冲液冲洗3-5次。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，在步骤S4中，在温度为37℃条件下恒温摇动，待30-35min后，用缓冲液冲洗3-5次。

上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，在步骤S4中，所述酶为辣根过氧化物酶。

本发明上述的用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用的有益效果是：本发明首次利用Western Blot法来对早期阿尔茨海默病进行检测。

首先，摒弃传统的Western Blot法中(抗原-抗体-二抗酶)模式进行检测，而采用(抗体-抗原-抗体酶)新的模式，即通过利用特异性抗体来检测待测样本中是否含有抗原，来检测人体是否患有阿尔茨海默病。由于抗体是由抗原刺激产生的，所以采用检测抗原的方式，可以实现对还没有发病症状的被检测者进行检测，从而实现对阿尔茨海默病的早期诊断，达到早发现早干预、治疗的目的。且通过采用阿尔茨海默单克隆抗体与特定抗原相结合，高特异性，可使得检测结果更为准确。

其次，本发明的待检测样本采用人体口腔咽喉部分泌物，具体采用了含有口腔腮部上皮细胞的漱口水作为待检测样本，由于漱口水的采集是无创性的，且采集完成后便可直接作为检测样本使用，不仅可减少被检测人员的疼痛，还可提高检测速度，进一步缩短检测时间，提高检测效率。

本发明能够快速得到检测结果，不仅实现了真正意义上阿尔茨海默病的早期检测，且检测准确率高，简单便捷，更易于推广，无创伤，安全、可靠，值得被广泛推广应用。

附图说明

图1为本发明快速检测早期阿尔茨海默病的检测流程图。

具体实施方式

下面结合具体附图及实施例对本发明做进一步详细说明；

实施例1

如图1所示，一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，用被检测者口腔咽喉部分泌物为待测样本，所述待测样本与特异性抗体相结合后，用酶对特异性抗体进行标记，通过滴加与酶反应的显色底物后，观察是否显色来判断检测结果的检测方法。

具体的，检测方法包括如下步骤：

S1.待测样本采集，采集被检测者的口腔咽喉部分泌物，备用；其中，口腔咽喉部分泌物采用含有被检测者口腔腮部上皮细胞的漱口水；

S2.检测卡冲洗，用缓冲液冲洗检测卡，冲洗的次数为3次，备用；

S3.加入待测样本，将步骤S1采集得到的口腔咽喉部分泌物滴加至步骤S2得到的检测卡上，等待30min，然后用缓冲液冲洗3次；其中，口腔咽喉部分泌物的抗原与检测卡上的特异性抗体相结合，使得特异性抗体上的酶特定结合点暴露；

S4.滴加酶，向检测卡上滴加1ml的酶，对检测卡上的特异性抗体进行标记，在温度为37℃条件下恒温摇动，等待30min，然后用缓冲液冲洗3次；其中，酶为辣根过氧化物酶，加入辣根过氧化物酶后，辣根过氧化物酶与特异性抗体上暴露出的酶特定结合点相结合；

S5.滴加底物，向检测卡上滴加1ml的可与辣根过氧化物酶反应而显色的底物，等待8min；

S6.观察检测结果，最后观察检测卡上有没有显色，并与对照卡上的色条对比，如没有显现出条带检测结果为阴性，如果显现出条带检测结果则为阳性。

其中，检测卡包括膜体，膜体的制备步骤如下：

(一)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1).准备玻璃板，依次用水、10％SDS、H2O，乙醇，和水冲洗干净，备用；

(2).依次将40ml的分离胶、8ml的浓缩胶置入电泳装置中；其中，

所述分离胶的配制如下：水13.2ml；30％丙烯酰胺溶液16.0ml；1.5mol/L Tirs(PH8.8)10.0ml；10％SDS 0.4ml；10％过硫酸铵0.4ml；TEMED 0.016ml；

所述浓缩胶的配制如下：水5.5ml；10％丙烯酰胺溶液1.3ml；1.0mol/L Tirs(PH6.8)1.0ml；10％SDS 0.08ml；10％过硫酸铵0.08ml；TEMED 0.008ml；

(3).加样，将特异性抗体蛋白标准加入梳孔内；

(4).电泳，开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加至15V/cm凝胶，继续电泳至染料抵达分离胶底部，断开电源；

(5).取下凝胶，备用；

(二)、抗体从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜

(1).裁剪出尺寸大小与SDS-聚丙烯酰胺凝胶相同的6块3MM滤纸和一块硝酸纤维素膜，备用；

(2).将步骤(1)得到的滤纸及硝酸纤维素膜转移至转移缓冲液中浸泡3-5min；

(3).将步骤(2)得到的滤纸、硝酸纤维素膜及SDS-聚丙烯酰胺凝胶置入转移装置中；

(4).接通转移装置电源后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶上带有负电的抗体向转移装置正极方向的硝酸纤维素膜移动，其中，控制为电压40V，电流为0.17-0.2A，转移时间为1.5-6h；

(5).转移结束，断电，取出转移有抗体的硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜放在一张干净的3MM滤纸上，在室温下干燥30-60min，即得到载有特异性抗体的膜体。

上述内容是先将特异性抗体印转至膜体上，然后将特异性抗体与检测样本中的阿尔茨海默抗原相结合，相结合后形成抗体抗原复合物，此时特异性抗体上的酶特定结合点暴露出，然后依次加入酶、与酶反应显色的底物，最后根据是否显色来判断检测结果，最终实现对早期的阿尔茨海默病的定性检测，达到早发现早干预、治疗的目的。当待测样本里面不含有阿尔茨海默抗原时，此时，特异性抗体由于未受到阿尔茨海默抗原的刺激，酶在抗体上的特定结合点不能暴露，使得酶不能达到特定结合点而不能与抗体结合，也就无法与酶相反应的底物反应，那么就无法显色，所以说如果检测卡上没有显色则代表人体内没有阿尔茨海默抗原，则检测结果为阴性，也就说明该被检测者是健康的。反之，当待测样本里面含有阿尔茨海默抗原时，此时，特异性抗体由于未受到阿尔茨海默抗原的刺激，酶在抗体上的特定结合点暴露出来，酶到达到特定结合点后与抗体结合，当滴加与酶相反应的底物后，酶与底物反应而进行显色，所以说如果检测卡上有显色条带则代表人体内有阿尔茨海默抗原，则检测结果为阳性，说明该被检测者携带有阿尔茨海默抗原，可对被检测者进行早期干预或者治疗。

实施例2

一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，用被检测者口腔咽喉部分泌物为待测样本，待测样本与特异性抗体相结合后，用酶对特异性抗体进行标记，通过滴加与酶反应的显色底物后，观察是否显色来判断检测结果的检测方法。

具体的，检测方法包括如下步骤：

S1.待测样本采集，采集被检测者的口腔咽喉部分泌物，备用；其中，口腔咽喉部分泌物为采用咽拭子检测的方式使用医用棉棒进行采集得到的口腔腮部上皮细胞；

S2.检测卡冲洗，用缓冲液冲洗检测卡，冲洗的次数为4次，备用；

S3.加入待测样本，将步骤S1采集得到的口腔咽喉部分泌物滴加至步骤S2得到的检测卡上，等待32min，然后用缓冲液冲洗4次；其中，口腔咽喉部分泌物的抗原与检测卡上的特异性抗体相结合，使得特异性抗体上的酶特定结合点暴露；

S4.滴加酶，向检测卡上滴加1ml的酶，对检测卡上的特异性抗体进行标记，在温度为37℃条件下恒温摇动，等待32min，然后用缓冲液冲洗4次；其中，酶为辣根过氧化物酶，加入辣根过氧化物酶后，辣根过氧化物酶与特异性抗体上暴露出的酶特定结合点相结合；

S5.滴加底物，向检测卡上滴加1ml的可与辣根过氧化物酶反应而显色的底物，等待9min；

S6.观察检测结果，最后观察检测卡上有没有显色，并与对照卡上的色条对比，如没有显现出条带检测结果为阴性，如果显现出条带检测结果则为阳性。

实施例3

一种用“Western Blot”法快速检测早期阿尔茨海默病的应用，用被检测者口腔咽喉部分泌物为待测样本，所述待测样本与特异性抗体相结合后，用酶对特异性抗体进行标记，通过滴加与酶反应的显色底物后，观察是否显色来判断检测结果的检测方法。

具体的，检测方法包括如下步骤：

S1.待测样本采集，采集被检测者的口腔咽喉部分泌物，备用；其中，口腔咽喉部分泌物采用含有被检测者口腔腮部上皮细胞的漱口水；

S2.检测卡冲洗，用缓冲液冲洗检测卡，冲洗的次数为5次，备用；

S3.加入待测样本，将步骤S1采集得到的口腔咽喉部分泌物滴加至步骤S2得到的检测卡上，等待35min，然后用缓冲液冲洗5次；其中，口腔咽喉部分泌物的抗原与检测卡上的特异性抗体相结合，使得特异性抗体上的酶特定结合点暴露；

S4.滴加酶，向检测卡上滴加1ml的酶，对检测卡上的特异性抗体进行标记，在温度为37℃条件下恒温摇动，等待35min，然后用缓冲液冲洗5次；其中，酶为辣根过氧化物酶，加入辣根过氧化物酶后，辣根过氧化物酶与特异性抗体上暴露出的酶特定结合点相结合；

S5.滴加底物，向检测卡上滴加1ml的可与辣根过氧化物酶反应而显色的底物，等待10min；

S6.观察检测结果，最后观察检测卡上有没有显色，并与对照卡上的色条对比，如没有显现出条带检测结果为阴性，如果显现出条带检测结果则为阳性。

由于抗体是由抗原刺激产生的，所以采用检测抗原的方式，可以实现对还没有发病症状的被检测者进行检测，也就是说，当被检测者还没有表现出该病的症状时，可以利用本发明的试剂盒进行检测，从而实现对阿尔茨海默病的早期诊断，达到早发现早干预、治疗的目的。且通过采用阿尔茨海默单克隆抗体与特定抗原相结合，高特异性，可使得检测结果更为准确。

在具体应用时，无需借助任何机器设备，即完全脱离各种仪器的使用，使用更为便捷，且检测时间短，大概1-1.5小时就能得到检测结果，更易于推广应用。由于膜体的显色剂不会掉色，检测完成后的样本可以留存下来，作为干预后对比样本，具有为后期医师诊断提供指导的作用。也就是说，为干预后的患者再次检测时提供参考，为后期医师提供诊断指导。具体的，被检测者使用本发明的试剂盒进行患病检测后，当检测结果为阳性时，可将检测样本保存下来，采取干预措施后，进行再次检测时，为再次检测结果提供参考，来分析检测阿尔茨海默病是否得到有效治疗，干预措施是否起效。如果再次检测的结果还是阳性，则可指导医生改变干预策略。经实验证明，采用本发明的试剂盒检测准确率高于96.7％。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修改，都应涵盖在本发明的保护范围内。