一种基于荧光探针的快速测定抑菌活性的比色方法

技术领域

本发明属于抗菌领域，涉及一种基于荧光探针的快速测定抑菌活性的比色方法。

背景技术

微生物在自然界的分布非常广泛，在不同的生态系统中起着重要的作用，是氮、碳等物质循环的重要及关键的参与者，与人类生活密切相关。微生物千姿百态，大部分微生物给对人们带来巨大好处，如用于食品制造的乳酸菌、酵母菌和食用菌，用于抗生素生产的链霉菌和数丝状真菌，用于环境治理的各种厌氧微生物等。但部分微生物给人类的健康带来了极大的危害，如食源性病原菌，导致人类得病，甚至死亡，以及腐败微生物，使食物腐败，失去食用价值，或导致食用者发生食物中毒。此外，部分霉菌能够导致化工材料、塑料产品、纺织品发生霉变，造成重大的损件。

目前，从植物、动物及微生物中寻找天然抑菌物质是一个重要研究内容。并且可以基于天然抑菌成分的化学结构，通过化学修饰和合成进行制备抗菌物质。这些抗菌成分及化合物成为防腐剂和抗生素的重要来源。抑菌活性的测定是评估天然来源产物及化学合成物抗菌作用的重要前提。目前，通常采用打孔法、牛津杯法、纸片法、最小抑菌浓度法、最小杀菌浓度法等方法测定和评价测试物的抑菌效果及抑菌谱，但这些方法具有周期较长、步骤繁琐、灵敏度低等缺点。因此，开发快速、灵敏度高的抑菌活性分析方法具有重要意义，有利于促进抑菌研究的开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光探针的快速测定抑菌活性的比色方法，适用于分析水溶性抑菌物质对细菌的抑制和杀菌活性，以5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, CTC）为荧光探针，主要应用于细菌死活的鉴定，是一种无色的水溶性唑盐，可被细菌细胞膜上的电子呼吸传递链中的脱氢酶还原为一种非水溶性红色荧光物质积累于胞内（见图1），红色强表示细菌活性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于荧光探针的快速测定抑菌活性的比色方法，主要步骤如下（参见图2）：

（1）以5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑CTC作为荧光探针，用无菌生理盐水或PBS缓冲液配制成50 mM的荧光染色液，4℃保藏备用；

（2）无菌生理盐水制备（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等）细菌菌悬液，使其菌浓为1×10

（3）吸取适量的菌悬液，加入需测试的抑菌物质，终浓度为0.05-0.1 mg/mL，在常温下作用15-30 min后加入原体积10倍的无菌生理盐水稀释，终止抑菌物质对菌体细胞的作用；

（4）吸取1 mL稀释后的样品，加入CTC荧光染色液，使其终浓度为5 mM，37℃条件下染色30 min；

（5）将染色后的样品离心，弃上清，并加入2 mL二甲基亚砜提取菌体细胞中的CTC还原产物，并不时搅拌；

（6）提取完成后离心，以二甲基亚砜为空白，测定上清液在470 nm处的吸光度值；

（7）菌悬液未抑菌处理的作为参考，根据吸光度值的变化评估抑菌物质的抑菌活性，吸光度越小，表示抑菌物质的抑菌活性强，吸光度值越大，表示抑菌物质抑菌活性弱或无抑菌活性。

本发明的有益效果是：1）短时间内（约2 h）可完成抑菌活性的测试，而传统方法至少需12 h以上，测试时间显著缩短； 2）精确度显著提高，不同抑菌成分之间抑菌活性的微小差异可以测出；3）分析结果准确度高。

附图说明

图1为细菌染色机理图；

图2为本发明比色法实验操作步骤流程简图；

图3为实施例1中是否采用ɛ-聚赖氨酸溶液处理的对比图。

具体实施方式

本发明公布了一种基于荧光探针的快速测定抑菌活性的比色法，下面实施例来进一步描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。

实施例1 ɛ-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌的抑菌活性

1. 将活化的枯草芽孢杆菌接种1环至装有30 mL营养肉汤培养基100 mL三角瓶，37℃，150 rpm/min培养18 h，菌浓约为5×10

2. 菌液8000 rpm离心10 min，弃上清，无菌生理盐水重悬，调节菌浓约为1×10

3. 吸取1 mL菌悬液至于无菌离心管中，加入无菌的ɛ-聚赖氨酸溶液，终浓度为0.1 mg/mL，处理30 min后，加入10 mL无菌生理盐水稀释，以终止或减弱ɛ-聚赖氨酸继续对菌体细胞的作用；未加ɛ-聚赖氨酸溶液的菌悬液作为对照（用无菌生理盐水替代ɛ-聚赖氨酸溶液），其它操作方法相同；

4. 吸取1 mL稀释后的样品，加入CTC荧光染色液（BS-02 CTC快速染色试剂盒，购自于日本同仁化学），终浓度为5 mM，37℃条件下染色30 min，不同处理组的染色效果见附图3；

5. 染色后的样品8000 rpm离心10 min，弃上清，向沉淀的菌体细胞加入2 mL二甲基亚砜提取菌体细胞中的CTC还原产物，提取过程不时搅拌，提取时间为30 min；

6. 提取完成后8000 rpm离心10 min，取上清，以二甲基亚砜为空白测定其470 nm处的吸光度值；

7. 结果显示吸光度值为0.21，对照组的吸光度为0.57，显示菌体细胞经过ɛ-聚赖氨酸处理后，细菌活性下降63%，由此表明ɛ-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌的抑菌活性强。

对比例1传统测试ɛ-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌的抑菌活性方法如下：

1. 将活化的枯草芽孢杆菌接种1环至装有30 mL营养肉汤培养基100 mL三角瓶，37℃，150 rpm/min培养18 h，菌浓约为5×10

2. 菌液8000 rpm离心10 min，弃上清，无菌生理盐水重悬，调节菌浓约为1×10

3. 吸取2 mL菌悬液至于无菌离心管中，加入无菌的ɛ-聚赖氨酸溶液，终浓度为0.1 mg/mL，处理30 min后，加入20 mL无菌生理盐水稀释，以终止或减弱ɛ-聚赖氨酸继续对菌体细胞的作用；未加ɛ-聚赖氨酸溶液的菌悬液作为对照（用无菌生理盐水替代ɛ-聚赖氨酸溶液），其它操作方法相同；

4.取0.1 mL稀释后的样品，涂布于营养琼脂平板上，37℃培养24 h，计数。营养琼脂配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g,氯化钠5 g，葡萄糖1g，琼脂15 g，1000mL水。

5. 结果显示ɛ-聚赖氨酸溶液处理后的枯草芽孢杆菌数量为9.5 log CFU/mL，对照的枯草芽孢杆菌数量为3.7 log CFU/mL，显示菌体细胞经过ɛ-聚赖氨酸溶液处理后，细菌活性下降61%。对比例1的检测方法的检测时间为18-24小时；因此，本发明的分析结果能够在2小时内分析抑菌物质的活性，更加准确和快速。

实施例2鱼精蛋白对大肠杆菌的抑菌活性

1. 活化好的大肠杆菌接种至装有30 mL LB培养基100 mL三角瓶，37℃，220 rpm/min培养12 h，菌体细胞浓度约为1×10

2. 培养好的菌液8000 rpm离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水重悬，调节菌体细胞浓度为1×10

3. 吸取1 mL菌悬液至于无菌离心管中，加入过滤除菌的鱼精蛋白溶液，终浓度为0.05 mg/mL，处理15 min后，加入10 mL无菌生理盐水稀释，以终止或减弱鱼精蛋白溶液继续对菌体细胞的作用；以未添加鱼精蛋白溶液的菌悬液作为对照（用无菌生理盐水替代鱼精蛋白溶液），其它操作方法相同；

4. 取1 mL稀释后的样品，加入CTC荧光染色液（BS-02 CTC快速染色试剂盒，购自于日本同仁化学），终浓度为5 mM，于37℃条件下染色30 min；

5. 染色后的样品于8000 rpm离心10 min，弃上清，向沉淀的菌体细胞加入2 mL二甲基亚砜，以提取菌体细胞中积累的CTC还原产物，在提取过程不时搅拌，提取时间为30min；

6. 提取后样品8000 rpm离心10 min，取上清，以二甲基亚砜为空白测定其470 nm处的吸光度值；

7. 结果显示鱼精蛋白处理的样品，吸光度值为0.34，对照组的吸光度为0.64，显示菌体细胞经鱼精蛋白处理后，细菌活性下降47%，由此表明鱼精蛋白对大肠杆菌具有较强的抑制作用。

对比例2传统测试鱼精蛋白对大肠杆菌的抑菌活性方法如下：

1. 将活化好的大肠杆菌接种至装有30 mL LB培养基100 mL三角瓶，37℃，220rpm/min培养12 h，菌体细胞浓度约为1×10

2. 培养好的菌液8000 rpm离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水重悬，调节菌体细胞浓度为1×10

3. 吸取2 mL菌悬液至于无菌离心管中，加入过滤除菌的鱼精蛋白溶液，终浓度为0.05 mg/mL，处理15 min后，加入20 mL无菌生理盐水稀释，以终止或减弱鱼精蛋白溶液继续对菌体细胞的作用；以未添加鱼精蛋白溶液的菌悬液作为对照（用无菌生理盐水替代鱼精蛋白溶液），其它操作方法相同。

4. 取0.1 mL稀释后的样品，涂布于营养琼脂平板上，37℃培养24 h，计数。营养琼脂配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g,氯化钠5 g，葡萄糖1g，琼脂15 g，1000mL水。

5. 结果显示鱼精蛋白溶液处理后的大肠杆菌数量为9.7 log CFU/mL，对照的大肠杆菌数量为5.2 log CFU/mL，显示菌体细胞经过鱼精蛋白溶液处理后，细菌活性下降46%。对比例1的检测方法的检测时间为18-24小时；因此，本发明的分析结果能够在2小时内分析抑菌物质的活性，更加准确和快速。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。