一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白及其在育种中的应用

技术领域

本发明涉及农业育种技术领域，具体为一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白及其在育种中的应用。

背景技术

水稻属被子植物门，单位子叶植物纲，禾本科，稻属。一年生水生草本，高0.5-1.5米。叶二列互生，线状披针形。穗为圆锥花序、自花授粉。水稻的优点是生长快、一年可生产一代甚至两代、籽粒多、生活力强。水稻籼粳亚型的基因组序列已公布，功能基因占总基因组的比例高，如籼型则占到92％，许多基因的功能还未知，因此克隆它的有关基因，研究其功能就显得尤为必要。

水稻的研究包括正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，关注的是具有某种缺陷的突变体。譬如，如果要研究与植物发芽机理有关的基因调控过程，可以先用化学、物理或生物的方法将野生型水稻诱变，然后在发芽条件下进行突变体的筛选。如果在诱变群体后代中出现了对发芽反应不同于野生型的个体(例如比野生型发芽率高、低等)，这种个体就是突变体。这种植物对种子发芽率的不同反应可能就是因为突变体中某一个基因遭到破坏后所造成，而这个基因必定与植物的发芽机制有关。在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。在获得了基因序列后，可以更深入了解这个基因的功能，并分析它是以何种形式影响了植物种子的发芽过程以及发芽过程中其他相关基因的关系。

鉴于水稻在遗传操作上所具有的优势，它广泛应用于植物整体生命活动许多过程的研究，取得了一系列重要发现；但对于水稻类钙调磷酸酶B蛋白的研究以及其对水稻种子发芽及幼苗生长的影响还有待进一步研究并应用于水稻的培育中，为以后育种工作提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白及其在育种中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白，所述类钙调磷酸酶B蛋白为水稻CBL8。

优选的，所述CBL8构建该基因的过表达载体(PWM101-CBL8)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行了验证，发现6个过表达株系均显著高于野生型。

优选的，通过CRISPR-Cas9构建了敲除CBL8基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行了鉴定，发现均缺失部分碱基。

优选的，所述CBL8的过表达植株CBL8-OE5植株和CBL8-OE6植株表现为低发芽率表型，CBL8缺失的突变体CRISPRL8-48和CRISPR L8-51均表现为发芽率正常表型，与野生型无异。

优选的，所述CBL8的过表达植株CBL8-OE5植株和CBL8-OE6植株表现为幼苗株高较矮、根量较少且较短的表型，CRISPR L8-48和CRISPR L8-51均表现为幼苗生长正常表型，与野生型无异。

优选的，一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白育种中的应用，所述育种包括通过转基因技术创制禾本科植物的低发芽率种质和幼苗株高较矮、根量较少且较短的表型种质；其中，禾本科植物为水稻。

优选的，所述类钙调磷酸酶B蛋白应用于禾本科植物转基因育种工作中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明针对水稻选育工作无法准确进行，如无法通过基因操作选择低发芽率的水稻材料或无法根据实际需要选择幼苗株高较矮、根量较少且较短的技术问题，通过各种实验证明水稻类钙调磷酸酶B蛋白8过表达株系和缺失突变体，分别具有低发芽率/正常发芽率表型，幼苗株高较矮、根量较少且较短/正常表型，通过上述研究，对水稻基因进行转基因研究分析，筛选出需要的水稻种子进行培育，选种准确，节省时间。

附图说明

图1是本发明提供的水稻类钙调磷酸酶B蛋白8的过表达株系的荧光定量表达鉴定图；

图2是本发明提供的基因CBL8缺失突变体的克隆测序比对图；

图3是本发明提供的基因CBL8相关转基因植株发芽表型及发芽率分析图；

图4是本发明提供的基因CBL8相关转基因植株幼苗生长表型及株高和根长比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供如下技术方案：一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白，所述类钙调磷酸酶B蛋白为水稻CBL8。

其中，所述CBL8构建该基因的过表达载体(PWM101-CBL8)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行了验证，发现6个过表达株系均显著高于野生型；通过CRISPR-Cas9构建了敲除CBL8基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行了鉴定，发现均缺失部分碱基。

所述CBL8的过表达植株CBL8-OE5植株和CBL8-OE6植株表现为低发芽率表型，CBL8缺失的突变体CRISPRL8-48和CRISPR L8-51均表现为发芽率正常表型，与野生型无异；所述CBL8的过表达植株CBL8-OE5植株和CBL8-OE6植株表现为幼苗株高较矮、根量较少且较短的表型，CRISPR L8-48和CRISPR L8-51均表现为幼苗生长正常表型，与野生型无异。

实施例案例：

本实施案例提供了一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白(CBLs)在育种中的应用；其中，水稻CBL8为类钙调磷酸酶B蛋白中的一种，构建该基因的过表达载体(PWM101-CBL8)，获得过表达株系，荧光定量PCR对其表达进行了验证，发现6个过表达株系均显著高于野生型(如图1所示)；通过CRISPR-Cas9构建了敲株该基因的株系，通过克隆测序的方法对其进行了鉴定，发现均缺失部分碱基(如图2所示)；发芽表型实验如图3所示，CBL8基因过表达株系较野生型发芽率(发芽7天时统计)明显下降，缺失突变体与野生型发芽无差异，随着发芽时间的延长，发芽数增加，3天前快速增加，后增加缓慢，野生型与缺失突变体在4天达最大值，后不再增加，而过表达株系在3-5天内增加缓慢，5天后才不再增加；幼苗表型实验如图4所示，从种子浸种开始发芽14天后过表达株系的幼苗较野生型矮、根系较小，而缺失突变体与野生型无差异。即所述CBL8的过表达植株L8-OE5和L8-OE6均表现为低发芽率表型；CRISPR L8-48和CRISPR L8-51均表现为发芽正常表型；所述CBL8的过表达植株L8-OE5和L8-OE6均表现为幼苗较矮、根量较少且较短的表型；CRISPR L8-48和CRISPR L8-51均表现为幼苗生长正常表型，如图4所示；该基因的过表达株系和缺失突变体存在不同表型，这为植物控制种子发芽和幼苗生长提供了基因储备。

综上所述，本发明针对水稻选育工作无法准确进行，如无法通过基因操作选择低发芽率的水稻材料或无法根据实际需要选择幼苗株高较矮、根量较少且较短的技术问题，通过各种实验证明水稻类钙调磷酸酶B蛋白8过表达株系和缺失突变体，分别具有低发芽率/正常发芽率表型，幼苗株高较矮、根量较少且较短/正常表型，通过上述研究，对水稻基因进行转基因研究分析，筛选出需要的水稻种子进行培育，选种准确，节省时间。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。