一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol-binding Protein，RBP)是在体内负责结合并转运维生素 A视黄醇类活性代谢物的一类蛋白质。视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因位于10q，mRNA 全长914bp，由181个氨基酸组成，相对分子质量为21kD，是视黄醇结合蛋白家族中 的分泌型RBP，是一种单一肽链的运载蛋白，有一个位点特异结合一分子维生素A， 可将维生素A从肝脏中转运至靶器官，并可实现维生素A的细胞内转运代谢，RBP4 在协助维生素A发挥生理功能中起着重要作用。

目前，用于临床血清RBP4检测的方法主要包括放射性免疫测定法(RIA)、酶联 免疫吸附试验(ELISA)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)等。这些方 法中都需要用到不同或一定浓度的RBP4抗原作为标准品制作标准曲线，从而计算样 品中RBP4的含量。国内禁止买卖人血清，从国外购买RBP4成本昂贵且来源有限， 发展重组RBP4代替人源RBP4非常有必要。目前重组表达的RBP4蛋白是包涵体表达， 存在变性与复兴过程，复兴是不可控的，大大地限制了RBP4的应用，不经突变的RBP4 免疫原性不强，免疫动物获得的抗体性能不佳。而重组突变表达的可溶性RBP4不仅 具有天然蛋白结构与生物活性，其稳定性与免疫原性都优于天然蛋白，可以应用到体 外诊断行业中。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用原核表达系统表达的具有天然蛋白的生物活性且稳 定性与免疫原性都优于未突变重组蛋白的可溶重组突变视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。

本发明具体技术方案如下：

一种重组视黄醇结合蛋白4，所述蛋白具有如序列表SEQ ID NO.1、2或3所述的 氨基酸序列。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4的基因，所述基因具有如序列表SEQ ID NO.5、6或7所示的核苷酸序列。

一种重组载体，所述载体含有上述重组视黄醇结合蛋白4的基因。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10：对视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列进行氨基酸的替换，得到突变氨基酸序列；

S20：用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，并通过PCR技术，得到重组视黄醇结合蛋白4基因；

S30：将重组视黄醇结合蛋白4基因进行双酶切，并连接到经过双酶切的载体上，得到表达载体；

S40：将表达载体转化大肠杆菌Origamin B(DE3)感受态细胞，得到视黄醇结合蛋白4表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化，获得所述重组视黄醇结合蛋白4。

进一步地，所述视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述突变氨基酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.1和5、SEQ ID NO.2和6、SEQ ID NO.3和7中的一组或者多组。

进一步地，所述SEQ ID NO.1是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F 替换为Y获得，所述SEQ ID NO.2是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中35位的L 替换为G获得，所述SEQ ID NO.3是将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F 替换为Y同时将35位的L替换为G获得。

进一步地，所述步骤S30中的双酶切是使用NdeI和XhoI进行双酶切，载体为 pET-32a(+)载体，表达载体为pET-32a(+)-RBP4。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗原中的应用。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4在制备视黄醇结合蛋白4抗体中的应用。

一种上述的重组视黄醇结合蛋白4在视黄醇结合蛋白4检测中作为标准品的应用。

综上所述，本申请上述各个实施例可以具有如下一个或多个优点或有益效果：

1.本发明实现了RBP4蛋白在原核表达系统中的可溶性表达。

2.本发明通过改变RBP4蛋白的氨基酸序列，使突变重组后的RBP4蛋白的稳定性与免疫原性都优于未突变的重组蛋白。

3.本发明得到的可溶性RBP4蛋白在保持了天然蛋白的生物活性的同时还具有优于天然蛋白的稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要 使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的实施例4中对表达载体pET-32a(+)-RBP4、载体pET-32a(+) 和RBP4基因分别进行Xho I和Nde I双酶切鉴定的结果。

图2是本发明的实施例4中对上清进行SDS-PAGE电泳检测的结果。

图3是本发明的的实施例4中对透析样品进行SDS-PAGE电泳检测的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

【实施例1】重组RBP4(20)的制备

(1)重组RBP4(20)蛋白设计：

根据NCBI网站公布的RBP4蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，1-18位氨基 酸为信号肽，成熟的蛋白序列为19-201位氨基酸，共183个氨基酸，其氨基酸序列如 序列表SEQ ID NO.4所示，将20位的F替换为Y得到如序列表SEQ ID NO.1所示的 氨基酸序列。

(2)重组RBP4(20)基因序列的优化和获得：

用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.1反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.5，并通过3轮退火延伸PCR反应，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重 组RBP4(20)基因。

将RBP4(20)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双 蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟， 30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(20)基因。

(3)重组RBP4(20)表达载体的构建：

将上述重组RBP4(20)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体 pET-32a(+)(根据Merck Millipore公司，目录号是69015)的Xho I/Nde I之间的片 段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(20)。

(4)重组RBP4(20)表达菌株的构建：

S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅 速冰浴化开；

S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(20)加入100μL感受态细胞 内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；

S30：迅速冰浴5分钟；

S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；

S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑 选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞， 命名为pET-32a(+)-RBP4(20)/Origamin B。

(5)重组RBP4(20)的表达纯化：

S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(20)/Origamin B接种于含有氨苄的LB 培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；

S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至 OD600达到0.6，得到第二菌液；

S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养 16小时，得到第三菌液；

S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；

S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；

S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；

S70：透析后分装保存于缓冲液中；

S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。

【实施例2】重组RBP4(35)的制备

(1)重组RBP4(35)蛋白设计：

将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中35位的L替换为G得到如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

(2)重组RBP4(35)基因序列的优化和获得：

用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.2反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.6，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组 RBP4(35)基因。

将RBP4(35)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、双 蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟， 30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(35)基因。

(3)重组RBP4(35)表达载体的构建：

将上述重组RBP4(35)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体 pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(35)。

(4)重组RBP4(35)表达菌株的构建：

S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅 速冰浴化开；

S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(35)加入100μL感受态细胞 内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；

S30：迅速冰浴5分钟；

S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；

S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑 选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞， 命名为pET-32a(+)-RBP4(35)/Origamin B。

(5)重组RBP4(35)的表达纯化：

S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(35)/Origamin B接种于含有氨苄的LB 培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；

S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；

S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养 16小时，得到第三菌液；

S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；

S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；

S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；

S70：透析后分装保存于缓冲液中；

S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。

【实施例3】重组RBP4(20-35)的制备

(1)重组RBP4(20-35)蛋白设计：

将将视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列中20位的F替换为Y同时将35位的L替换 为G得到如序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

(2)重组RBP4(20-35)基因序列的优化和获得：

用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.3反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.7，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组 RBP4(20-35)基因。

将RBP4(20-35)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2 ×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1 分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、 双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(20-35)基因。

(3)重组RBP4(20-35)表达载体的构建：

将上述重组RBP4(20-35)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(20-35)。

(4)重组RBP4(20-35)表达菌株的构建：

S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅 速冰浴化开；

S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(20-35)加入100μL感受态细 胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；

S30：迅速冰浴5分钟；

S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；

S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑 选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞， 命名为pET-32a(+)-RBP4(20-35)/Origamin B。

(5)重组RBP4(20-35)的表达纯化：

S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(20-35)/Origamin B接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；

S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至 OD600达到0.6，得到第二菌液；

S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养 16小时，得到第三菌液；

S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；

S50：将上清进行SDS-PAGE电泳检测；

S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；

S70：透析后分装保存于缓冲液中；

S80：取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测。

【实施例4】重组RBP4(对比)的制备和重组RBP4的检测

(1)重组RBP4(对比)蛋白选择：

根据NCBI网站公布的RBP4蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，1-18位氨基 酸为信号肽，成熟的蛋白序列为19-201位氨基酸，共183个氨基酸，其氨基酸序列如 序列表SEQ ID NO.4所示。

(2)重组RBP4(对比)基因序列的优化和获得：

用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列SEQ ID NO.4反向翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.8，并通过退火延伸PCR技术，得到由大肠杆菌优势密码子组成的重组 RBP4(对比)基因。

将RBP4(对比)基因设计成A、B两段，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2 ×PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1 分钟，72℃ 1分，5个循环；后续两轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液、 双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B两种基因。取A、B基因产物加入2× PCR反应液、双蒸水、引物，PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分 钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得重组RBP4(对比)基因。

(3)重组RBP4(对比)表达载体的构建：

将上述重组RBP4(对比)基因用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体 pET-32a(+)的Xho I/Nde I之间的片段，得到表达载体pET-32a(+)-RBP4(对比)。对 上述实施例1、2、3以及本实施例的表达载体pET-32a(+)-RBP4、载体pET-32a(+)和 RBP4基因分别进行Xho I和Nde I双酶切鉴定，结果如图1所示，其中1：Marker，2： RBP4(20)酶切载体，3：RBP4(35)酶切载体，4：RBP4(20-35)酶切载体，5： RBP4(对比)酶切载体，6：RBP4(20)PCR条带，7：RBP4(35)PCR条带，8： RBP4(20-35)PCR条带，9：RBP4(对比)PCR条带。由图1可以看出，重组质粒 经Xho I和Nhe I双酶切后，电泳均可见到两条与预期分子量大小一致条带，与 pET-32a(+)和RBP4基因的大小相符。

(4)重组RBP4(对比)表达菌株的构建：

S10：从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞Origamin B(100μL/支)，迅 速冰浴化开；

S20：分别取10ng上述表达载体pET-32a(+)-RBP4(对比)加入100μL感受态细 胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；

S30：迅速冰浴5分钟；

S40：加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；

S50：取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑 选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时，此即为成功转化的宿主细胞， 命名为pET-32a(+)-RBP4(对比)/Origamin B。

(5)重组RBP4(对比)的表达纯化：

S10：将所得阳性克隆pET-32a(+)-RBP4(对比)/Origamin B接种于含有氨苄的 LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；

S20：将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至 OD600达到0.6，得到第二菌液；

S30：于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于22℃，250rpm下培养 16小时，得到第三菌液；

S40：将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；

S50：对上述实施例1、2、3以及本实施例的上清进行SDS-PAGE电泳检测，结 果如图2所示，其中1：Marker，2：空白菌体，3：RBP4(20)表达菌体，4：RBP4 (35)表达菌体，5：RBP4(20-35)表达菌体，6：RBP(对比)表达菌体，可以看出 pET-32a(+)-RBP4/Origamin B上清中含有约20KD的目标蛋白RBP4抗原；

S60：对所得上清液过Ni柱、离子柱、分子筛进行纯化；

S70：透析后分装保存于缓冲液中；

S80：取上述实施例1、2、3以及本实施例的透析样品进行SDS-PAGE电泳检测， 结果如图3所示，其中1：Marker，2：RBP4(20)，3：RBP4(35)，4：RBP4(20-35)， 5：RBP4(对比)，从图3中可知蛋白分子量大小与理论大小一致。

【实施例5】重组视黄醇结合蛋白4性能检测和应用

(1)3种突变重组RBP4抗原性检测

S10：将纯化后的突变重组RBP4与天然RBP4分别使用碳酸盐缓冲液稀释成 100ng/mL,100μL/孔，4℃放置过夜；

S20：弃反应液，洗涤拍干，将DAKO抗人视黄醇结合蛋白4多抗稀释为1:40000、 1:80000、1:160000、1:320000、1:640000、1:1280000与1:2560000，纵向加入100μL/ 孔，37℃反应60min；

S30：弃反应液，洗涤拍干，将羊抗兔酶标二抗稀释为1:4000，100μL/孔，37℃ 反应60min；

S40：弃反应液，洗涤拍干，加TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10min；

S50：加入终止液2mol/l硫酸，50μL/孔，OD450读数。

表1：突变重组RBP4抗原性检测

从表1可知：突变重组RBP4与抗人视黄醇结合蛋白4多抗具有反应，且反应强 度与天然RBP4蛋白接近一致，说明突变重组RBP4具有天然RBP4的抗原性。

(2)突变重组RBP4稳定性测定：

使用RBP4体外诊断试剂盒对上述突变型重组RBP4抗原、未突变重组RBP4抗原 和天然RBP4抗原的稳定性进行检测。将以上5种RBP4抗原调整浓度到2mg/mL，分 装后放入37℃培养箱中，共7天，采用终点法检测，作为样本在日立7180生化仪上 进行检测，2mg/mL浓度稀释至1/10检测，检测结果见表2。

表2：突变重组RBP4稳定性检测

从表2可知：突变重组RBP4，与0天相比37℃破坏后检测值波动不大且无趋势 降低或升高，稳定性好；未突变重组RBP4与天然RBP4检测值有明显的下降趋势， 稳定性不理想。

(3)重组RBP4免疫原性测定：

将突变重组的3种RBP4抗原、未突变重组RBP4抗原分别同剂量同时各免疫5 只兔子，DAKO公司抗体作为阳性对照(人源抗原免疫获得的抗体)，检测效价，检 测结果见表3、4、5、6。

(1)将天然RBP4使用碳酸盐缓冲液稀释成100ng/mL,100μL/孔，4℃放置过夜；

(2)弃反应液，洗涤拍干，将免疫抗血清稀释与阳性对照分别稀释为1:20000、 1:40000、1:80000、1:160000、1:320000、1:640000与1:1280000，纵向加入100μL/孔， 37℃反应60min；

(3)弃反应液，洗涤拍干，将羊抗兔酶标二抗稀释为1:4000，100μL/孔，37℃反 应60min；

(4)弃反应液，洗涤拍干，加TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10min；

(5)加入终止液2mol/l硫酸，50μL/孔，OD450读数。

表3：突变RBP4(20)免疫效价检测

表4：突变RBP4(35)免疫效价检测

表5：突变RBP4(20-35)免疫效价检测

表6：未突变重组RBP4免疫效价检测

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制； 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理 解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技 术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本 发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波赛珀生物技术有限公司

<120> 一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

<130> 2021-06-04

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp

1 5 10 15

Lys Ala Arg Tyr Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp

35 40 45

Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu

50 55 60

Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr

65 70 75 80

Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe

85 90 95

Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp

100 105 110

Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr

115 120 125

Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu

130 135 140

Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly

165 170 175

Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu

180

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp

1 5 10 15

Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Gly Gly Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp

35 40 45

Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu

50 55 60

Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr

65 70 75 80

Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe

85 90 95

Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp

100 105 110

Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr

115 120 125

Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu

130 135 140

Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly

165 170 175

Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu

180

<210> 3

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp

1 5 10 15

Lys Ala Arg Tyr Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Gly Gly Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp

35 40 45

Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu

50 55 60

Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr

65 70 75 80

Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe

85 90 95

Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp

100 105 110

Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr

115 120 125

Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu

130 135 140

Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly

165 170 175

Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu

180

<210> 4

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp

1 5 10 15

Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp

35 40 45

Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu

50 55 60

Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr

65 70 75 80

Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe

85 90 95

Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp

100 105 110

Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr

115 120 125

Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu

130 135 140

Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly

165 170 175

Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu

180

<210> 5

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gaacgtgact gccgtgtttc ttctttccgt gttaaagaaa acttcgacaa agctcgttac 60

tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtctgttcct gcaggacaac 120

atcgttgctg aattctctgt tgacgaaacc ggtcagatgt ctgctaccgc taaaggtcgt 180

gttcgtctgc tgaacaactg ggacgtttgc gctgacatgg ttggtacctt caccgacacc 240

gaagacccgg ctaaattcaa aatgaaatac tggggtgttg cttctttcct gcagaaaggt 300

aacgacgacc actggatcgt tgacaccgac tacgacacct acgctgttca gtactcttgc 360

cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420

ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480

ctggctcgtc agtaccgtct gatcgttcac aacggttact gcgacggtcg ttctgaacgt 540

aacctgctg 549

<210> 6

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

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agcggcacct ggtatgcgat ggcgaaaaaa gatccggaag gcggctttct gcaggataac 120

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cgcctgctga acctggatgg cacctgcgcg gatagctata gctttgtgtt tagccgcgat 420

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<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtggtttcct gcaggacaac 120

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cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420

ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480

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aacctgctg 549

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<211> 549

<212> DNA

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gaacgtgact gccgtgtttc ttctttccgt gttaaagaaa acttcgacaa agctcgtttc 60

tctggtacct ggtacgctat ggctaaaaaa gacccggaag gtctgttcct gcaggacaac 120

atcgttgctg aattctctgt tgacgaaacc ggtcagatgt ctgctaccgc taaaggtcgt 180

gttcgtctgc tgaacaactg ggacgtttgc gctgacatgg ttggtacctt caccgacacc 240

gaagacccgg ctaaattcaa aatgaaatac tggggtgttg cttctttcct gcagaaaggt 300

aacgacgacc actggatcgt tgacaccgac tacgacacct acgctgttca gtactcttgc 360

cgtctgctga acctggacgg tacctgcgct gactcttact ctttcgtttt ctctcgtgac 420

ccgaacggtc tgccgccgga agctcagaaa atcgttcgtc agcgtcagga agaactgtgc 480

ctggctcgtc agtaccgtct gatcgttcac aacggttact gcgacggtcg ttctgaacgt 540

aacctgctg 549